專利名稱：一株腐皮鐮孢菌及其在降解二苯并噻吩中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株二苯并噻吩降解菌及其在環(huán)境污染控制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
除了煉焦廢水中含有有機(jī)硫雜環(huán)化合物如二苯并噻吩等，硫在石油中的含 量也比較高，原油中硫含量在0. 025-5 %之間，大部分以硫化物、硫醇、噻吩、苯并噻吩 (benzothiophene,BT)或者二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)等有機(jī)硫存在，二苯并噻 吩是硫雜質(zhì)中的主要成分，在一些石油中占據(jù)總硫的40% -70%。石油、石化產(chǎn)品以及煉 焦生產(chǎn)在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及使用過程中會(huì)產(chǎn)生大量污染，如土壤污染以及地下水的污染以及 大量的廢水，二苯并噻吩作為一種主要的污染物之一的降解對于土壤生物修復(fù)以及石化污 水、煉焦廢水的處理具有重要作用，此外這些污染中往往還含有一定的苯酚、多環(huán)芳烴以及 甲苯等苯系污染物。生物治理是微生物利用污染物作為碳源或其他營養(yǎng)源如氮源、硫源等，將其分解 利用轉(zhuǎn)化為二氧化碳、水以及無機(jī)礦物質(zhì)等。生物治理/處理因?yàn)槌杀镜?、操作簡單、條件 溫和以及無二次污染等優(yōu)勢，在土壤生物修復(fù)以及石化污水、煉焦廢水的處理的過程中具 有絕對的優(yōu)勢，篩選、獲得具有對二苯并噻吩具有快速降解能力以及對苯酚、多環(huán)芳烴以及 甲苯等苯系污染物同時(shí)具有降解作用的高效微生物菌株，可以將其投加于待修復(fù)的土壤以 及污水處理中，來大幅提高生物降解的效果，這對保護(hù)生態(tài)具有主要意義。一般來說生物降解菌要求具有對生長環(huán)境要求低、生長速度快、降解速度快以及 可耐受或可降解多種污染物的優(yōu)勢。本發(fā)明提供的一株二苯并噻吩降解菌具有上述優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可降解二苯并噻吩的菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明從中國某油田污泥中以二甲基亞砜為唯一硫源篩選得到的腐皮鐮孢菌 Fusariumsolani SI菌株具有快速降解二苯并噻吩的能力。該菌株屬于真菌類；在二苯并 噻吩為唯一硫源的選擇性固體培養(yǎng)基上生長有大量繁密菌絲，初期白色，長時(shí)間后變淡土 黃色，于30°C左右生長，具有典型鐮刀型孢子。該菌株為鐮孢菌屬菌株(Fusarium solani)，保藏號CGMCC No. 3653。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該菌株的應(yīng)用方法降解含二苯并噻吩污染物，具有 降解速度快，可同時(shí)降解多種有機(jī)污染物能力。本發(fā)明提供的腐皮鐮孢菌，不但生長迅速、容易成為優(yōu)勢菌株、可高效、快速降解 二苯并噻吩外，并具有降解利用環(huán)丁砜、二甲基亞砜、菲、萘、2-羥基聯(lián)苯、苯酚以及甲苯的 能力，適合進(jìn)行石油、煉焦廢水的處理以及石油污染土壤和地下水的修復(fù)。通過下面的附圖 和詳細(xì)描述，本發(fā)明這些方面的特征和優(yōu)點(diǎn)將更為清楚。


圖1是腐皮鐮孢CGMCC No. 3653的菌絲及孢子圖片。圖2是腐皮鐮孢CGMCC No. 3653以二苯并噻吩為唯一硫源的生長曲線。圖3是腐皮鐮孢CGMCC No. 3653在不同氯化銨濃度下利用二苯并噻吩的生長情況。圖4是腐皮鐮孢CGMCC No. 3653利用不同碳源的生長情況。本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語“二苯并噻吩降解菌”是指可以二苯并噻吩為唯一 碳源、能源以及硫源進(jìn)行生長的微生物菌株，即菌株在增殖或代謝過程中可將二苯并噻吩 降解為二氧化碳、水以及無機(jī)礦物質(zhì)而去除。本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語“含二苯并噻吩污染物”是指工業(yè)過程中產(chǎn)生的明 顯含有二苯并噻吩的石化、煉焦廢水或者石油污染土壤、地下水等。本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語“碳源”是指微生物可利用的含碳物質(zhì)，微生物利用 該含碳物質(zhì)合成自身細(xì)胞的含碳物質(zhì)。術(shù)語“能源”是微生物細(xì)胞可氧化其產(chǎn)生電子，在電 子傳遞過程中產(chǎn)生ATP供細(xì)胞利用的物質(zhì)。術(shù)語“硫源”是指微生物可利用的含硫物質(zhì)，微 生物利用含硫物質(zhì)來提供自身對硫的需求。
具體實(shí)施例方式(1)培養(yǎng)基基本鹽溶液(BSM):KH2P04 2. 5g, NaHP04 12H20 12. Og, MgCl2 6H20 :0. 8g, NH4C1 2. Og, CaCl2 :0. 07g, FeCl3 6H20 :0. lg，MnCl4 4H20 :0. 4g，溶于 1000ml 去離子水中，制成鹽溶液。富集、篩選培養(yǎng)基BSM溶液中加入甘油15. 0g/L，二甲基亞砜800mg/L。液體、固體培養(yǎng)基BSM溶液中加入甘油15. 0g/L, DBT 800mg/L,固體培養(yǎng)基中加 入20g/L瓊脂，濕熱滅菌備用，條件改變另作說明。(2)菌株的篩選與分離純化來自油田污水池的污泥置于250ml三角燒瓶中30°C搖床活化2天，用移液管移取 10ml活化污泥加入選擇性培養(yǎng)基中，于搖床培養(yǎng)三天后4000rpm離心5分鐘，倒掉上清液， 部分底部泥菌轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的新鮮富集培養(yǎng)基，如此每三天重復(fù)一次，共3次。然后移取適量 馴化菌液進(jìn)行稀釋涂布平板，于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后選取數(shù)量多、長勢良好、外觀不同的菌 落，進(jìn)行多次劃線分離純化得到純種菌株，將純化的菌株接種斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后于4°C冰箱 保藏，每隔3-4個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。(3)菌株的形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定菌絲采用光學(xué)顯微鏡觀察(如圖1)，具有典型鐮刀狀孢子和真菌菌絲。菌株鑒定采用28S rDNA進(jìn)行，正向引物 5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ‘ (SE Q ID NO. 2)，反向引物5' -GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3‘ (SEQ ID NO. 3)，PCR(ABI 9700)條 件94°C預(yù)變性2min，94°C變性10s，55°C退火5s，72延伸10s，35個(gè)循環(huán)，72延伸2min，測 序使用 ABI 3700 DNA 測序儀。28S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。NCBIBLAST 28S rRNA 序列搜索結(jié)果與Fusarium solani SI菌株同源性98%，2010年3月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號CGMCC No. 3653，分類命名為。(4) 二苯并噻吩降解以及細(xì)胞干重平板的培養(yǎng)菌種接種固體培養(yǎng)基后置于恒溫培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)1-2天。液體培養(yǎng)菌種接種液體培養(yǎng)基，置于30°C，200r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)一 定時(shí)間后利用等體積環(huán)己烷萃取剩余DBT，水相離心收集菌體，洗滌1-2次后放置烘箱中 80°C烘干至恒重測細(xì)胞干重。(5) 二苯并噻吩測試使用安捷倫氣相色譜(6890)進(jìn)行，F(xiàn)ID檢測器，50-300°C升 溫速度40°C /min，色譜柱HP-5毛細(xì)管色譜柱。實(shí)施例1菌種接種分別含環(huán)丁砜、二苯并噻吩為唯一硫源，或接種分別含2-羥基 聯(lián)苯、萘、菲為唯一碳源的固體培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。結(jié)果如表1所示。表1在不同硫源及碳源的培養(yǎng)基中的生長情況
唯一硫源唯一硫源及碳源唯一碳源 實(shí)施例2菌種接種甘油15. Og/L, DBT 800mg/L,氯化銨濃度2g/L的液體培養(yǎng)基， 置于30°C，180r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后測細(xì)胞干重，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3菌種接種甘油15. 0g/L，DBT 800mg/L，不同氯化銨濃度的液體培養(yǎng)基，置 于30°C，180r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后測細(xì)胞干重，結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例4菌種接種分別含甲醇、乙醇、正辛烷、正庚烷、吐溫-80以及甲苯為碳源的 液體培養(yǎng)基，置于30°C，180r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)2_3天，細(xì)胞干重如圖4所示。說明該菌對多種有機(jī)碳源具有利用能力。實(shí)施例5菌種接種甘油15. Og/L, DBT 800mg/L,氯化銨濃度5g/L的液體培養(yǎng)基， 置于30°C，180r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24hrs后測DBT的降解率為84. 5%。
權(quán)利要求
一株腐皮鐮孢(Fusarium solani)菌株，其保藏號為CGMCC No3653。
2.如權(quán)利要求1所述的腐皮鐮孢CGMCCNo. 3653，其特征是它的28S rDNA序列如SEQ IDN0. 1 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的腐皮鐮孢CGMCCNo. 3653菌株在降解二苯并噻吩中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，具體是將腐皮鐮孢CGMCCNo. 3653菌株接種 到含二苯并噻吩的培養(yǎng)基進(jìn)行降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可以高效降解二苯并噻吩的茄腐鐮孢菌菌株。本發(fā)明的目的是提供一種二苯并噻吩降解菌及利用該菌進(jìn)行二苯并噻吩降解的應(yīng)用。本發(fā)明提供的二苯并噻吩降解菌為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)CGMCC No3653。所說的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)CGMCC No3653用于降解二苯并噻吩。本發(fā)明提供的菌株具有生長速度快、降解速度快、易成為優(yōu)勢菌株且可對多環(huán)芳烴菲和萘同時(shí)具有降解效果等優(yōu)勢。
文檔編號A62D101/28GK101851587SQ20101019508
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者劉惠, 周清早, 楊光, 郁婧婧, 陳寬偉 申請人:南京師范大學(xué)