專利名稱：：一種利用盾葉薯蕷內(nèi)生鐮孢菌寡糖提高培養(yǎng)細(xì)胞薯蕷皂苷元產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種促進(jìn)盾葉薯蕷培養(yǎng)細(xì)胞生長和提高薯蕷皂苷元產(chǎn)率的方法，特別是涉及一種生產(chǎn)活性寡糖的微生物一盾葉薯蕷內(nèi)生鐮孢菌。技術(shù)背景采用植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法可以大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物可用作農(nóng)藥、醫(yī)藥、<七妝品、食品添加劑等。如何有效提高培養(yǎng)細(xì)胞中有用代謝產(chǎn)物的含量和產(chǎn)率，是植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)走向工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)重要方面。有許多手段能有效地促進(jìn)植物細(xì)胞生長和提高植物培養(yǎng)細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的含量，如添加前體物質(zhì)、改變營養(yǎng)條件、各種機(jī)械或物理的誘導(dǎo)作用、各種化學(xué)物質(zhì)的調(diào)節(jié)等，其中采用來自植物或微生物的寡糖誘導(dǎo)子是一種有效的手段。許多人工合成或由多糖裂解而來的寡糖(oligosaccharide)(或稱寡糖片段)具有促進(jìn)植物生長發(fā)育、細(xì)胞形態(tài)建成、提高次生代謝產(chǎn)物含量和提高植物的抗病性等多種生物活性。已有許多從真菌和植物中獲得寡糖的報(bào)道，但尚未見從植物內(nèi)生真菌中獲得活性寡糖來影響宿主植物次生代謝的報(bào)道。盾葉薯蕷(PZojcoreaz/wg,'6ere似"C.H.Wright)在分類上屬于單子葉綱(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬，為我國特有的藥用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肅等省區(qū)。盾葉薯蕷根狀莖中含有多種內(nèi)生真菌，它們與宿主植物長期互惠共存，相互影響，協(xié)同進(jìn)化。本發(fā)明著重于盾葉薯蕷內(nèi)生真菌寡糖的制備及其在細(xì)胞培養(yǎng)中提高薯蕷皂苷元產(chǎn)率方面的應(yīng)用，為新型誘導(dǎo)子的開發(fā)和探討內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關(guān)系提供依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種鐮孢菌(Fusan'iifnsp.),菌株代號為Dzfl7,現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2008年4月29日，登記入冊編號為2472。本發(fā)明涉及鐮孢菌的分離和分類鑒定、真菌寡糖的制備，以及真菌寡糖對盾葉薯蕷培養(yǎng)細(xì)胞生長和薯蕷皂苷元形成的影響，有效提高薯蕷皂苷元的產(chǎn)率，提供如下的技術(shù)方法。1、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7的分離采集新鮮的盾葉薯蕷根狀莖，采用內(nèi)生真菌的分離和純化技術(shù)，獲得一株內(nèi)生真菌，編號為Dzfl7。2、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7的形態(tài)特征(1)無性世代內(nèi)生真菌Dzfl7菌株在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，菌落白色夾雜紫色，圓形，產(chǎn)生大量紫色色素，分生孢子梗單生或輪生，瓶梗狀，大孢子近鐮刀形，23個(gè)隔，小孢子卵圓形，橢圓形，腎形無隔1個(gè)隔，孢子大小4.8nm22.8pmx2.3nm5.0nm。內(nèi)生真菌Dzfl7的形態(tài)特征(見圖1、圖2、圖3和圖4)符合鐮孢菌屬(fkran',)真菌的形態(tài)特征。(2)有性世代未發(fā)現(xiàn)。3、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7的分子生物學(xué)特征運(yùn)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾QITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。將Dzfl7菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列庫中注冊獲得序列號(accessionnumber)EU543260。同時(shí)將Dzfl7菌株的ITS序列與GenBank中其他真菌的ITS序列進(jìn)行比對，找出相似性最高，親緣關(guān)系最近的真菌，Dzfl7菌株的ITS序列與尖孢鐮孢菌(尸w^W7'z/mac;^on/m)EF495237的ITS序列相似度為100%,聚在一個(gè)分支上的可信度為100%。其同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖5。4、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7的發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)基液體馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度25±1°C。是否光照否。培養(yǎng)時(shí)間14天。搖床轉(zhuǎn)速150rptn。培養(yǎng)特征培養(yǎng)第6天，菌液略帶淡紫色；培養(yǎng)第14天，菌液為黃白色。5、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7多糖和寡糖的制備Dzfl7菌絲多糖含量為224.56mg/gdw,得率為2.785g/L;菌絲寡糖含量為56.25mg/gdw，得率為0.698g/L;菌液多糖得率為0.625g/L;菌液寡糖得率為0.124g/L。6、盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)特征培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度25±1°C。是否光照否。培養(yǎng)時(shí)間16天26天不等。搖床轉(zhuǎn)速120ipm。培養(yǎng)特征細(xì)胞均勻分散，成微團(tuán)，懸浮培養(yǎng)液不產(chǎn)生色素。7、內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7寡糖對培養(yǎng)細(xì)胞生長和薯蕷皂苷元形成的影響在盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第16天，添加濃度為30mg/L的內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7菌絲寡糖，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)8天，細(xì)胞干重為3.401g/L、薯蕷皂苷元含量為1.535mg/gdw、薯蕷皂苷元產(chǎn)率為5.221mg/L;而對照(即不添加寡糖的處理)的細(xì)胞干重為2.851g/L、薯蕷皂苷元含量為0.730mg/gdw、薯蕷皂苷元產(chǎn)率為2.081mg/L。內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7寡糖能有效地促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元的形成。圖l:內(nèi)生真菌Dzfl7菌落正面。圖2:內(nèi)生真菌Dzfl7菌落背面。圖3:內(nèi)生真菌Dzfl7的菌絲、分子孢子梗和分生孢子。圖4:內(nèi)生真菌Dzfl7的分生孢子。圖5:內(nèi)生真菌Dzfl7同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明首次明確了內(nèi)生鐮孢菌Dzfl7菌株的微生物學(xué)分類地位，同時(shí)發(fā)現(xiàn)從該菌制備的寡糖能促進(jìn)盾葉薯蕷細(xì)胞生長及其薯蕷皂苷元的含量，從而有效提高培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皇苷元的產(chǎn)率。本發(fā)明的目的是利用植物內(nèi)生真菌資源，獲得活性寡糖，作為誘導(dǎo)子，有效提高培養(yǎng)細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的含量和產(chǎn)率，為新型誘導(dǎo)子的開發(fā)和探討內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關(guān)系提供依據(jù)。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:內(nèi)生真菌Dzfl7的分離采集新鮮的盾葉薯蕷根狀莖，表面先用70%乙醇處理30s,然后用0.2%氯化滎處理20min以進(jìn)行徹底的表面滅菌，無菌條件下去除表皮，將根狀莖分成約0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的塊段，擺放在PDA培養(yǎng)基上，每皿l塊，在25。C，光照條件下培養(yǎng)7天~20天，從每個(gè)菌落的邊緣挑取一小段菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，連續(xù)純化培養(yǎng)45次，至菌落形態(tài)一致。將純化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株內(nèi)生真菌的編號為Dzfl7。實(shí)施例2:內(nèi)生真菌Dzfl7菌株的發(fā)酵工藝本發(fā)明采用的是搖床發(fā)酵，500mL體積的三角瓶中盛馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基200mL，將預(yù)先培養(yǎng)好的Dzfl7菌絲接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，在25。C、150rpm下暗培養(yǎng)14天，得總發(fā)酵液20L，采用高速離心(離心力為8000g,離心時(shí)間20min)的方法將菌絲和菌液分開，得菌絲體鮮重490.0g,于-20。C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3:內(nèi)生真菌Dzfl7菌株的形態(tài)特征觀察內(nèi)生真菌Dzfl7菌株在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，菌落白色夾雜紫色，圓形，產(chǎn)生大量紫色色素，分生孢子梗單生或輪生，瓶梗狀，大孢子近鐮刀形，23個(gè)隔，小孢子卵圓形，橢圓形，腎形無隔1個(gè)隔，孢子大小4.8pm22.8|imx2.3nm5.0nm。內(nèi)生真菌Dzfl7的形態(tài)特征見圖1圖4。在培養(yǎng)條件下，未發(fā)現(xiàn)Dzfl7的有性世代。實(shí)施例4:內(nèi)生真菌Dzfl7菌株ITS序列分析與分子鑒定首先將在平板上活化的Dzfl7菌株的菌絲轉(zhuǎn)移到PDA液體培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)5天后獲得新鮮的菌絲，采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取真菌基因組DNA。運(yùn)用PCR技術(shù)，DNA擴(kuò)增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。DNA測序所用的引物分別為ITS1和ITS4,采用ABIPRISM3730測序儀，分別進(jìn)行正向(5'—3')和反向(3'—5')雙向測序。反向序列經(jīng)DNAMAN軟件反向互補(bǔ)后與正向序列拼接形成5'—3'完整序列。把所得的ITSrDNA序列提交至UGenBank數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformationWebsite,http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得序列號(accessionnumber)EU543260。利用Blast工具進(jìn)行序列比對，找出相似性最高，親緣關(guān)系最近的真菌，Dzfl7菌株的ITS序列與尖孢鐮孢菌(i^^W娜o;c;^oram)EF495237的ITS序列相似度為100%,其同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖5。根據(jù)Blast比對結(jié)果，從中抽取與所分離的內(nèi)生真菌Dzfl7菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX1.8軟件進(jìn)行序列對準(zhǔn)，再用MEGA軟件計(jì)算遺傳距離，然后利用距離依靠法中的鄰位相連法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，計(jì)算Bootstrap值來評價(jià)系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。Dzfl7同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖5，Dzfl7菌株與尖孢鐮孢菌(fWar/鵬o;g邵on^)聚在一個(gè)分支上的可信度為100%。實(shí)施例5:內(nèi)生真菌Dzfl7多糖的制備內(nèi)生真菌Dzfl7多糖的制備分菌絲多糖制備和菌液多糖制備兩種。菌絲多糖的制備步驟搖培14天的真菌懸浮培養(yǎng)液(20L)，采用高速離心(離心力為8000g，離心時(shí)間20min)的方法將菌絲和菌液分開，得到的菌絲干燥至恒重248g(干重)，依次用蒸餾水、100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)、500mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)沖洗后，在250mL的500mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)中研磨，然后用500mL500mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)洗4次，抽濾，反復(fù)凍融。菌絲體再分別經(jīng)蒸餾水，甲醇:氯仿=1:1(v/v)、丙酮沖洗，用氯仿:正丁醇=5:1(v/v)不斷攪動(dòng)30min40min去蛋白(采用紫外分光光度法，檢驗(yàn)蛋白是否去除干凈)，冷凍干燥。按1:100(w/v)重新懸浮于重蒸水中，然后在高溫煮提20min。然后經(jīng)過0.22濾膜過濾，濃縮，然后在蒸餾水中透析48h(MW=8000Da),得到菌絲多糖，冰凍干燥，得到55.69g,含量為98.0%以上。菌液多糖制備步驟采用高速離心(離心力為8000g，離心時(shí)間20min)得到的菌液20L，在40。C下真空濃縮(原來的20倍)，加入氯仿乙醇-l:l(v/v)提取脫脂(每次12h)，用氯仿正丁醇=5:1(v/v)不斷攪動(dòng)30min~40tnin去蛋白(在紫外分光光度計(jì)上，檢驗(yàn)蛋白是否去除干凈)。然后加入3倍體^^、的95%乙醇(4。C醇析24h)(重復(fù)三次)，然后在37000g離心10min。沉淀再用適量蒸餾水溶解，加入(100mL120mL)水得到的懸浮液，20。C下在蒸餾水中透析48h(截留分子量為8000Da),然后通過離心得到上清液，干燥，得到12.50g，含量為98.0%以上。實(shí)施例6:內(nèi)生真菌Dzfl7寡糖的制備內(nèi)生真菌Dzfl7寡糖的制備分菌絲寡糖制備和菌液寡糖制備兩種。菌絲寡糖的制備步驟取1g實(shí)施例5中制備的干燥菌絲多糖，加入20mL2mol/L三氟乙酸(Trifluoroacedcacid,TFA),在密閉的容器中于85°C下水浴2.5h(期間不斷振搖)后，放入到冰水中終止反應(yīng)。然后過濾掉不溶的物質(zhì)。在35。C40。C濃縮，去除剩余的TFA。得到的濃漿，溶解到100mL的蒸餾水中，然后用lmol/L的NaOH溶液中和，在45。C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到250.5mg菌絲寡糖，含量為98.5%以上。菌液寡糖的制備步驟取lg實(shí)施例5中制備的干燥菌液多糖，加入20mL2mol/LTFA,在密閉的容器中于85°C下水浴2.5h(期間不斷振搖)后，放入到冰水中終止反應(yīng)。然后過濾掉不溶的物質(zhì)。在35。C40。C濃縮，去除剩余的TFA。得到的濃漿，溶解到100mL的蒸餾水中，然后用1mol/L的NaOH溶液中和，在45。C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到198.5mg菌液寡糖，含量為98.5%以上。實(shí)施例7:盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)本發(fā)明采用的是搖床培養(yǎng)，300mL體積的三角瓶中盛MS(MurashigeandStoog)培養(yǎng)基100mL，將預(yù)先培養(yǎng)好的盾葉薯蕷愈傷組織接種到己滅菌的培養(yǎng)基中，在25°C、120rpm下暗培養(yǎng)16天26天不等，懸浮細(xì)胞收獲采用的過濾的形式，將收獲的懸浮細(xì)胞凍干，按實(shí)施例8中描述的方法，測定薯蕷皂苷元的含量。實(shí)施例8:盾葉薯蕷細(xì)胞中薯蕷皂苷元含量的測定采用高效液相色譜法(HPLC)分析培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元的含量。懸浮培養(yǎng)的濾液中未檢測到薯蕷皂苷元。具體步驟如下-培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元的制備經(jīng)不同處理的盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞，過濾，冰凍干燥，研磨，準(zhǔn)確稱取200mg,加入15mL的2mol/LH2S04溶液，然后加入35mL異丙醇(使反應(yīng)液中異丙醇的終含量為70%)。在80。C下回流7h,加入15mL去離子水，分別用50mL正己垸萃取四次，合并萃取液，用lmoJ/LNaOH溶液洗兩次，再用去離子水洗兩次，最后將正己烷部分減壓濃縮，用乙腈溶解，過濾，用10mL容量瓶定容備用。高效液相色譜分析條件島津LC-10AT型HPLC(Shimadzu)，光電二極管陣列檢測器(PhotoDiodeArray,PDA),安捷倫C18液相色譜柱(AgilentTC-C18,250mmx4.6mm)，薯蕷皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)品純度98%,乙腈(Fisher色譜純)，水(重蒸水)，其他試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定準(zhǔn)確稱取4.7mg薯蕷皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)品于5mL容量瓶中，用乙腈充分溶解并定容，分別取OmL，0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.05mL和0.08mL于10mL的容量瓶中，用乙腈定容，然后分別取10nL進(jìn)樣，流動(dòng)相為乙腈:水=90:10(v/v);流速1.0mL/min;紫外檢測波長為208nm;柱溫為19。C。以HPLC的峰面積為y，以每次進(jìn)樣的薯蕷皂苷元的質(zhì)量(嗎)為i,獲得線性回歸方程J^4018687+2856，相關(guān)系數(shù)及=0.9984。植物培養(yǎng)細(xì)胞樣品中薯蕷皂苷元含量的測定:取上述定容的正己烷萃取部分10nL，進(jìn)樣,按上述HPLC條件進(jìn)行薯蕷皂苷元的分析，根據(jù)上述線性回歸方程進(jìn)行定量計(jì)算。實(shí)施例9:內(nèi)生真菌Dzfl7多糖和寡糖對盾葉薯蕷細(xì)胞生長薯蕷皂苷元含量的影響根據(jù)實(shí)施例5中步驟制備內(nèi)生真菌Dzfl7的菌絲和菌液多糖。按實(shí)施例6中的步驟制備內(nèi)生真菌Dzfl7的菌絲和菌液寡糖。稱取一定量的菌絲多糖或寡糖，用無菌的蒸餾水溶解，在無菌條件下過濾除菌，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第16天，添加寡糖或多糖，使懸浮培養(yǎng)液中寡糖和多糖的濃度為30mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)8天后收獲。盾葉薯蕷培養(yǎng)細(xì)胞千重、薯蕷皂苷元含量和產(chǎn)率的結(jié)果見表l。在30mg/L的濃度下，菌絲或菌液多糖對細(xì)胞的生長有一定的抑制作用。菌絲或菌液寡糖對細(xì)胞生長的影響不明顯，但能明顯提高薯蕷皂苷元的含量和產(chǎn)率。經(jīng)菌絲寡糖處理的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，薯蕷皂苷元的產(chǎn)率為5.006mg/L,為對照(1.597mg/L)的3.135倍。表1內(nèi)生真菌Dzfl7多糖和寡糖對盾葉薯蕷細(xì)胞生長薯蕷皂苷元含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注接種量:10gfw/L;多糖或寡糖的濃度均為30mg/L，對照為相同體積無菌的MS液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)第16天添加，然后繼續(xù)培養(yǎng)8天；每個(gè)處理均重復(fù)三次。實(shí)施例10:內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖及其添加時(shí)間對盾葉薯蕷細(xì)胞生長薯蕷皂苷元含量的影響根據(jù)實(shí)施例9中的結(jié)果，采用內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖及其不同濃度，考察不同添加時(shí)間對盾葉薯蕷細(xì)胞生長薯蕷皂苷元含量的影響，結(jié)果見表2。在寡糖濃度為0mg/L40mg/L六個(gè)梯度中，無論寡糖與培養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間為4天，8天，還是12天，均以30mg/L的寡糖濃度能有效地提高薯蕷皂苷元的產(chǎn)率；在三種不同的添加時(shí)間處理U2d+I2d、16d+8d、20d+4d)中，以培養(yǎng)第16天添加30mg/L濃度的菌絲寡糖，能有效地提高薯蕷皂苷元的產(chǎn)率。表2內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖及其添加時(shí)間對盾葉薯蕷細(xì)胞生長薯蕷皂苷元含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注接種量10gfW/L;所有對照均為無菌MS液體培養(yǎng)基，每個(gè)處理均重復(fù)三次。實(shí)施例11:內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖對培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元合成的動(dòng)態(tài)變化在實(shí)施例9和實(shí)施例IO的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第16天，添加30mg/L的菌絲寡糖，考察內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖對培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元合成的動(dòng)態(tài)變化，測定培養(yǎng)第16天(16d+0d)，分別繼續(xù)培養(yǎng)2天(16d+2d)、培養(yǎng)4天(16d+4d)、培養(yǎng)6天U6d+6d)、培養(yǎng)8天(16d+8d)、培養(yǎng)IO天(16d+10d)培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元合成的動(dòng)態(tài)變化(結(jié)果見表3)。在添后菌絲寡糖(30mg/L)0-4天內(nèi)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率急速增加，近乎于直線形，在第4天的時(shí)候達(dá)到4.170mg/L,在此后一直到第8天到薯蕷皂苷元也是增加的，只不過是增加的幅度沒有前4天大，當(dāng)?shù)降?天的時(shí)候達(dá)到最大值5.210mg/L，在第IO天的時(shí)候已經(jīng)有下降的趨勢，薯蕷皂苷元產(chǎn)率為4.708mg/L。各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期，添加菌絲寡糖的處理都比與對照高，16d+2d、16d+4d、16d+6d、16d+8d、16d+10d添加菌絲寡糖的薯蕷皂苷元的產(chǎn)率分別是2.351mg/L、4.170mg/L、4.681mg/L、5.210mg/L和4.708mg/L,分別是對照的3.912、5.080、3.294、3.383和3.745倍。表3內(nèi)生真菌Dzfl7菌絲寡糖對培養(yǎng)細(xì)胞中薯蕷皂苷元合成的動(dòng)態(tài)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注接種量10gfw/L，對照為未加誘導(dǎo)子的處理，每個(gè)處理均重復(fù)三次。權(quán)利要求1.一株產(chǎn)活性寡糖的盾葉薯蕷內(nèi)生真菌，其特征是命名為鐮孢菌(Fusariumsp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2472。2、一種按權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的分離方法，通過嚴(yán)格的表面消毒，從植物內(nèi)部分離出來的，并通過形態(tài)和分子鑒定，將ITSrDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號EU543260。3、一種從按權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌中制備寡糖。4、一種制備權(quán)利要求3中的內(nèi)生真菌寡糖的方法取干燥的菌絲或菌液多糖，加入一定體積的2mol/L三氟乙酸，在密閉的容器中于85。C下水浴2.5小時(shí)(期間不斷振搖)后，放入到冰水中終止反應(yīng)。然后過濾掉不溶的物質(zhì)。低溫濃縮，去除剩余的三氟乙酸。得到的濃漿，溶解到蒸餾水中，然后用lmol/L的氫氧化鈉溶液中和，在45。C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到菌絲或菌液寡糖。5、權(quán)利要求3中的內(nèi)生真菌寡糖用于制備促進(jìn)植物培養(yǎng)細(xì)胞的生長和提高細(xì)胞培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率在盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)一段時(shí)間后，添加一定濃度的寡糖，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)一段時(shí)間，能有效促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長和提高薯蕷皂苷元的含量。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)活性寡糖的盾葉薯蕷內(nèi)生鐮孢菌。本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌Dzf17是從盾葉薯蕷中采用內(nèi)生真菌分離技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類鑒定為鐮孢菌(Fusariumsp.)，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2472。本發(fā)明首次從盾葉薯蕷中分離出產(chǎn)活性寡糖的內(nèi)生真菌，并明確了內(nèi)生鐮孢菌Dzf17菌絲寡糖能促進(jìn)宿主盾葉薯蕷培養(yǎng)細(xì)胞的生長，提高細(xì)胞培養(yǎng)物中薯蕷皂苷元的產(chǎn)率。文檔編號C12P19/00GK101270337SQ20081011206公開日2008年9月24日申請日期2008年5月21日優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日發(fā)明者周立剛,張瑞芬,彭友良,李培琴,王薊花,趙江林申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)