專利名稱：：小立碗蘚抗低溫基因Ppviolaxanthinde-epoxidase及其蛋白和載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因基因尸/w'o7a,a/7f/j'/7flfe-印on'c/ase及其編碼的蛋白質(zhì)、含有該基因的載體、和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
：低溫、干旱、高鹽是限制植物生長發(fā)育、地理分布、形態(tài)建成等的重要環(huán)境脅迫因素。這些脅迫因素作用的結(jié)果均導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，影響植物細(xì)胞的滲透壓，進(jìn)而影響植物正常的生理代謝，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物的死亡。通過對一些模式植物的研究發(fā)現(xiàn)這三種脅迫因素誘導(dǎo)表達(dá)的功能蛋白及轉(zhuǎn)錄因子相互交差，因此，尋求同時(shí)具有忍耐低溫、干旱、高鹽脅迫的綠色植物來研究植物的非生物脅迫極有必要。對苔蘚植物的基礎(chǔ)研究標(biāo)明苔蘚植物是極地低溫度環(huán)境的先鋒植物之一，同時(shí)它也分布在極端干旱的沙漠。在漫長的生物進(jìn)化歷程中，苔蘚植物形成了一套獨(dú)特的適應(yīng)低溫干燥等惡劣環(huán)境的機(jī)制。對小立碗蘚非生物脅迫研究發(fā)現(xiàn)(Frank等，2005)，與其他高等植物相比，小立碗蘚(州/sc譜/fre〃apateys)可以忍耐極端的生態(tài)環(huán)境。如，擬南芥在lOOmM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003),而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理?xiàng)l件下，小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醉處理三天后，小立碗蘚仍可以幸存。當(dāng)小立碗蘚失水92%時(shí)仍可恢復(fù)正常生長發(fā)育。在脫水、鹽漬和滲透脅迫條件下，F(xiàn)rank等(2003)分析鑒定了一系列上調(diào)基因，其編碼的蛋白主要有膽堿脫氫酶(cholinedehydrogenase)、甜菜堿(glycinebetaine)、三氫吡咯羧酸鹽(delta11-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、韋丐依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在(TC低溫脅迫七天后小立碗蘚仍可恢復(fù)生長(Minami等，2005)，且在冷馴化過程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉(zhuǎn)錄，提高了其冰凍耐受能力。因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關(guān)基因并進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)應(yīng)用于提高農(nóng)作物的抗逆性是目前研究的熱點(diǎn)之一。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種高效的抗低溫脅迫相關(guān)基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一目的是提供含有上述基因的載體。本發(fā)明的再一目的是提供表達(dá)上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。具體地，本發(fā)明的發(fā)明人將培養(yǎng)至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在0。C下經(jīng)過不同時(shí)間的處理與非處理小立碗蘚莖葉體組成差異材料，通過cDNA-AFLP技術(shù)得到差異表達(dá)的EST，隨后在分子水平進(jìn)行表達(dá)分析或蛋白質(zhì)水平的分析，挑選出了一種具有顯著抗逆特性的基因一小立碗蘚抗逆基因尸pWo7a;ray7t力j'/jofe-epon'fikse，其堿基序列如SEQIDNo.1所示，其cDNA序列如SEQIDNo.2。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了上述基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。在本發(fā)明的完成過程中，還提供了包含上述基因的載體、以及表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術(shù)，可以利用該基因培育出優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，從而提高農(nóng)作物的抗逆性。圖1為/^w'o^3;ra/7Z^z'/ofe-eparz'okse基因的cDNA-AFLP圖譜，其中，Maker:分子量標(biāo)記；1、未馴化的24小時(shí)的材料；2、未馴化的12小時(shí)的材料；3、冷馴化的24小時(shí)的材料；4、冷馴化的12小時(shí)的材料。圖2為尸p7io7a;ra/7t/i/7ofe-epo義iokse基因的Real-timeRT-PCR相對表達(dá)量變化圖。具體實(shí)施例方式1、小立碗蘚的培養(yǎng)及冷脅迫處理將小立碗蘚培養(yǎng)至15葉左右，移入0。C處理0、3、6、12、24、48、72小時(shí)，分別取材用于cDNA-AFLP分析。附小立碗蘚培養(yǎng)基配方及制備大量元素Ca(N0丄4H200.8g/L0.0125g/L0.25g/LFeS047H20MgS047H20微量元素CuS045H20ZnS047H20H3B030.055mg/L0.055mg/L0.614mg/L0.389mg/L0.055mg/L0.028mg/L0.025mg/LMnCl2■CoCl26H20Na2Mo042H20Glucose酒石酸銨磷酸鹽緩沖液5g/L0.5g/Llml/L微量元素配制成1000X母液，4'C存放。固體基本培養(yǎng)基，加入濃度為0.8%瓊脂粉。磷酸緩沖液的配制取25gKH2P(V溶解于100ml蒸餾水，用4MK0H調(diào)整pH7.0，4'C存放。2、cDNA-AFLP分析cDNA-AFLP方法參照Christian,1998。1)小立碗蘚RNA提取(TE3D法)和DNaseI處理2)mRNA的分離mRNA從總RNA中分離，按照Promega公司試劑盒PolyATractraRNAIsolationsystem介紹的方法進(jìn)《亍。3)cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司試劑盒cDNASynthesisKit(M-MLVVersion)介紹的方法進(jìn)行。4)雙酶切采用EcoRI和Msel兩種限制性內(nèi)切酶對cDNA進(jìn)行雙酶切。模板cDNA(200ng/u1)1.25u1緩沖液(10X)2ulEcoRI5U/u11U1Msel5U/ullulddH2014.75u1總體積20ul混勻離心，37°C酶切至少3個(gè)小時(shí)，最好過夜直至cDNA被完全酶切；酶切完全后，反應(yīng)混合物置65'C加熱15min，使限制性內(nèi)切酶失火，之后將反應(yīng)管置冰上冷卻；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，呈現(xiàn)均勻彌散為較好酶切效果。5)接頭連接采用EcoRIadaptor和Mselad鄰tor兩種接頭連接，所用接頭見表2.1。酶切反應(yīng)液緩沖液(10X)T4-連接酶(10U/u1)ATP(10mM)EcoRI接頭Msel接頭ddH20總體積50pmo1/ii150pmol/ii120y12u10.lu10.2"lu1lii15.7u130u1混合離心，37。C至少連接3小時(shí)，-20。C可長期保存。6)預(yù)擴(kuò)增以E0和M0為引物做預(yù)擴(kuò)增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應(yīng)管中模板DNA(連接反應(yīng)液)緩沖液(10X)MgC12(25mM)EcoRI引物(E0，50ng/u1)Msel引物(M0，50ng/ul)Taq酶(5U/u1)dNTP(10mM)H20總體積PCR反應(yīng)程序94'C、3min;94°C-環(huán)；68°C、10min;4'C保存。2.0u12.On11.2u10.6u10.6u10.2u10.2u113.2u120ti130s，56°C、30s，72°C、lmin，15個(gè)循<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)選擇性擴(kuò)增以El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8禾BMl、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8為引物做選擇性擴(kuò)增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應(yīng)管中模板DNA(預(yù)擴(kuò)稀釋物)5.0ul緩沖液(10X)2.0nlMgCl2(25mM)1.2uldNTP(10mM)0.2iilEcoRI引物(Ex，50pmol/nl)0.6ulMsel引物(Mx，50pmol/u1)0.6ulTaq酶(5U/iU)0.2ix1H2010.2u1總體積20nlPCR反應(yīng)采用"touchdown"策略。程序如下94。Clmin94。C65°C72°C94°C30s30slmin30s7個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.7°C)20個(gè)循環(huán)56°C30s72°Clmin68。ClOmin4°C保存8)電泳檢測——銀染技術(shù)記錄試驗(yàn)結(jié)果拍照或掃描，統(tǒng)計(jì)檢測位點(diǎn)數(shù)及其多態(tài)性位點(diǎn)。以冷馴化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未馴化0h的小立碗蘚為材料，進(jìn)行cDNA-AFLP分析。統(tǒng)計(jì)200bp-1000bp之間的可讀帶，結(jié)果表明小立碗蘚冷馴化和未冷馴化的基因表達(dá)存在著明顯差異。有些cDNA片段在冷馴化后表達(dá)量逐漸增加，有些cDNA片段表現(xiàn)出先增加后降低，有些cDNA片段表達(dá)量先降低后增加，還有少數(shù)表達(dá)量明顯降低。3、尸;w'o7ara/7t/w'/7ofe—epo義i(/ase全長基因的獲得1)RT-PCR分析將由cDNA-AFLP分析得到的差異片段與P.patensEST數(shù)據(jù)庫(http:〃moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)進(jìn)行BLAST比對后，進(jìn)行聚類分析和功能分類，顯示小立碗蘚在冷馴化過程中細(xì)胞內(nèi)的代謝活性和生長狀態(tài)發(fā)生了極大的變化。特別值得一提的是，發(fā)現(xiàn)了與膜穩(wěn)定性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，尸pC^Pi7J編碼/^w'o73X3/7"i/7c/e-印awVase。該基因的表達(dá)分析顯示尸payi7J在冷馴化中下調(diào)表達(dá)，Ppviolaxanthinde-印oxidase是木質(zhì)素循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩S質(zhì)。violaxanthinde-印oxidase的活性依賴于脂肪酸的不飽和程度，并且受細(xì)胞膜流動(dòng)性的調(diào)節(jié)(Latowskietal.，2002;Bugosetal.，1998)。通過同源序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到尸/w'o7a;ra/7t力//7ofe-epo;n'okse。尸pfa'o7ar朋t力i/A-epo;nWase基因的上游引物序列為CTATTACCGAGGCAAGAATG;下游引物序列為CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。PCR反應(yīng)體系如下cDNA3u110XLAPCR緩沖液2ix1d證(2.5mM)1.6ulprimerF(50pmo1/ti1)primerF(50pmo1/n1)LAPolymeraseddH20總體積PCR反應(yīng)程序0.15u10.15u10.lix113u120u195°Clmin95°C45s65°C45s68°C2min32個(gè)循環(huán)72°ClOmin4°C保存2)純化后的差異片段與pGEM-Teasy(Promega)載體連接3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化5)陽性克隆的測序以載體兩端的T7或SP6引物進(jìn)行序列測定。測序儀為ABI3100(A卯liedBiosystems)<>該基因的基因組序列如下CTAAACCTGCGCACCTCGTGATCCTGGATGGTAGAGGGAATGGGGGGGGGGGGGGGCCTTGTGGATGACGACTCAAAAGCACTGGAGCTCGCAGTGCCTCCATTTGTGGAGTGAGTTAGAGCGAAAGAGAGCTTGCAGGGTCTGTTATCTTGTTCCGAATCTAGTTTGGGTTTTGGAGCGTTTGTAATTTTTAGGCTTGCGTTGAGCTGC11GTTGATTGGTTGCGTAGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGGTCTGGCAATTCACCAGCTTTCTCTTGTTGTTGCTCAGTGTTGCGCAAATTGATTATTGTTCCTGGTGGTTCTGTTCTGTGAAGTCTGATCATTTTGGAGATTTTGTGGGAGTTTATGAGAATGATGCGCATGTTTAGTCTCAACTTGCGTAAGGATAAAAGATAAAGTGCAGGAAAGTTTTGAACAAAGATTACATCTTACACGTAGGCACACTTGGCTATATCTCTGGAAATCTGACGGTGAAMTGTCTTGCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGAGAACAAAGTTGTCGATGAATTCAACGAATGTGCTGTAACAAGAAAAGGCTGCGTCCCTCAGAAGGCTGATGAAGGTCGCTTCCCGGTGCCCGCTCCGTGCTTTCATTGTCACTGAAGTGCCAACATCCTAGTGAGATGGCAGTAAAAGCTCCAGCATTGGCTGCAGCAGTGAATTGTTGACAAGCTTAGCTTTGGAAAACTTGCAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGAGAGAGCTTCTTTGTAAAGGAGGCACAAGAGGTGGAGCAAGGTGGCGAGAAGATTATCCAGAAGCTGGGACGACTGTGGGCTCAGCTGACCAAAGGCGCTGAAGAGGTGCGGCGTGACGAGGAGCAGCTCCTCAAGGAGCTTGGAGAGTTCGGAAAGAGTGCTCAAATGAACGAGGAGGAGTTCATGCAATCTTTGGGAGATGAAGAGAAG磁TTGCTTGAAGACTTGGGGAATCAGATTTTGGCTCGTCAGAAAAAGCCCAGCAGCTTGTGAATTCACGTTAAAAAGAGAGGTTTTCTTCATGTTGAATTTGTACTTTCCTTAACTGCATAGAGATGACATCTATTCAATATCTTCDSSequence(1596bp)CAGCTGTTGCAACGGGGTTTTTGCTATGGGGTGGATCAAGCGCGTTGGCTGCTGACCCTCTAAAAACATGCTCATGTCTTCTTAAGGAATGCCGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGTTCTACTGTGCAGAACTTCGTACAAGACGAAAAGCAACCAGGAATCTTATTAAACCACGGAAACGAGTTCACCACAACTGACAACACATGTGGACCGGAACCGCCATTGCTTGCCAGACTGGAAAAGAAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGTTTTGGGAAGGAAGGTC氨基酸序列MAVVHALLSLPHPAAGNPLQLSVQSNSRNTSASAGRLSSLSSRPCLGGLVSRSSKTKWISTRGGCRRACVVNMRLSKSQCKEQGQTECSNGEIASTSAIVAREASSVQSPRWRLQILPRNVAQGFALQAAAAVATGFLLWGGSSALAADPLKTCSCLLKECRVELAKCIADPKCAANVACLQTCNGRPDETECQIGCGDLFENKVVDEFNECAVTRKGCVPQKADEGRFPVPAPSSLVQDFDTTRFTGTWYITSGLNKTFDTFDCQK冊FTAEPAKLSGNLSWRIATPDGGFFTRSTVQNFVQDEKQPGILLNHGNEFLHYQDDWYILASRIEMPDDYVFIYYRGKNDAWDGYGGAVVYTKSSTLPTSIIPELGAAAKKVNLDFKKFTTTDNTCGPEPPLLARLEKKAEEGEKFLEKEVVEGEKFVEKEVEEGESFFVKEAQEVEQGGEKIIQKLGRLWAQLTKGAEEVRRDEEQLLKELGEFGKSAQMNEEEFMQSLGDEEKKLLEDLGMQPSDVGKLFGNSVPLRKLR4、/^'o7a扁t力//7cfe-印組't/維基因的Real-timeRT-PCR分析利用real-timeRT-PCR方法研究了尸/Kiaax3"Z^z'/7c/e-epo;a'okse基因在冷馴化過程中的表達(dá)變化。1)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。試劑盒使用TaKaRa公司的RNAPCRkit，參照試劑盒的說明書，以試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。2)預(yù)實(shí)驗(yàn)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用h'SExTaqDNApolymerase,進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下94°C2min94°C30s61。C30s72°C20s30個(gè)循環(huán)20°C5minPCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇反應(yīng)產(chǎn)物專一，沒有二聚體等雜帶的樣品進(jìn)行下一步定量PCR反應(yīng)。3)定量PCR反應(yīng)利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列見表2.2。PCR儀使用CorbetResearch公司的RotorGene3000Real-TimeThermalCycler。實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用軟件Rotor-Gene6.O(Donaldetal.，2005)以及Excel7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。采用Pp-actin3基因作對照，尸/7i^'o7aM/7^7y/7ofe-epow'ofese基因的上游引物序列為CTATTACCGAGGCAAGAATG;下游引物序列為CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成將預(yù)試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物按照10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，選擇1/1,000，1/10，000，1/100,000，1/1,000，000濃度的稀釋產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品模版，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。通過這四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene5.0根據(jù)反應(yīng)的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖2，轉(zhuǎn)錄本7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明基因PpKioh;ra/^力//7印ouWase在冷馴化中下調(diào)表達(dá)，其是木質(zhì)素循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩S質(zhì)。violaxanthinde-印oxidase的活性依賴于脂肪酸的不飽和程度，并且受細(xì)胞膜流動(dòng)性的調(diào)節(jié)(Latowskietal.,2002;Bugosetal.，1998)，表明膜的穩(wěn)定性機(jī)制可能是小立碗蘚冷馴化機(jī)制中的一項(xiàng)重要策略，低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性說明了尸pw》7a;ra"t力眾A-e/^aVaw基因與小立碗蘚的低溫抗性密切相關(guān)。序列表，txt<110〉首都師范大學(xué)<120>小立碗蘚抗低溫脅迫基因Ppviolaxanthinde-印oxidase及其編碼的蛋白質(zhì)、含有該基因的載體、和細(xì)胞系<160>3<210>1<211〉4464〈212〉瞧〈213〉小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)<400>1ctaaacctgcgtgg3tg3Cggcg3卿agaggcattggcaggttctttgtcttgacttgatgttccgaat卿ggcggatctgctggtaatttttttmtgaagcgttgcttggttgttggcgtC3gcttaggtcttcaaaatatgcgagg犯3ttgcggtgg柳ctttttgattttgagcttcgaaaaaataggcattgCCELgCttCactttggttgcgtttctacttgcaagctgcctgctgaccctctgcagtaataggatggaacgatgcgtgagttgattggt犯tgtagcatcaattcaccatggttctgUtacctgtcgttgagaatgatagttttgaacgacggtgaaagaattcaacgcgcttcccggggg訓(xùn)tggtcatgagttcatttactggcttctggtatttctgattgaagaattgtgctgtccagatggaaccaggaatcactgctgtcc3gtactggaggtcgtacacacttggagg肪atatcactccgagctgcatggsgtcttg幼g犯CELElgCCgatatggaggagctgggggcacacatgtggaaccagttgcaagctccagcagcggagg犯ga犯g肌gtggggcg鄉(xiāng)agagcacctcgtgactcaaaagcUggC3ttggtgctgaggcgtgctgctatactagtttgggttagttagtcatttattcaattttuuuatcctggeitgactggagctcagctgaatccctcaatgcggcgggctttcgccctctctagttttggagcgatggctgtggtcctggtgtggtagaggg犯gcagtgcctcagt3gagttttggggggggggcaggaaatcggacgcctgtaaaeict犯atttatcgaagttctacttcagcaaattcttcaggttttgaattggatgttcttttcttcattcaagtgattggcactcgagcctacttgatggcagctgtttctaaaaacaccttcagattaatatttgctatatgtgtcatgcgtagggtgtttacaaacgctttctcttctgtgaagtctagtaacagagCgCEltgttt犯agattacaatgtcttgcaaatgtgctgttgcccgctccacatcaccagcagcagagccctgaagctaageitcagttttttggggtcttaactagctttggcttcttcattattaaaccttgttttaccattgctttatctgattaaggatttcctttt2igtcaatg膽gat犯taccgtttgtacacagatgactatggcagtcgtttgcagcg卿acaaatg犯cggacttggggagtgctttcatttggctgcaggagagaaattttatccagaagtgacgaggaaggaggagtttgcaaccatcctttgcagctcgtctttatcggatttcgsiccgcagtgt幼Ct3tCgtggCctagaaacgtgg犯Wtattgcatcagtttaattcagcaggctaatgttctggatgcgcgatgtgacgtgcaacggggttgctcatgtcattggaaatacagcgccaattggaatcttggg犯ttagcgctgtaatggagttgttgctctgatcatttttg肪ccgttaagtctcaacttcttacacgtgattggttgtaac肪g犯肪atccagcttatggtttgaaccgca肪attagaacagttgtcga/ttc犯tgtaattgtgaacfitaatgtgtctcgttctacacgga^cgattt3ggcttatcctgagggatgaggtctttcacaatttcgagagttgtctgaggttgatctcgcaacctctgtttatctaacaccaagagcattgcttgctgtcactgaacagtgaattgcctgg卿aggagcttctttgctgggacgagcagctcctccatgcaatcttgacgttggactcttgtagaccaccacaceitttgtaattttacatgctttgtttttgagtttgtgtattgatctgtacagcagtaggcctt卿ggcggt卿gc犯ggaaagagaagcttgcgc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CLLKEECAVTRKGCVTAEPAKLSGNRIENKPDDYVTDNTCGPEPPKIIQKLGRLWGMQPSDVGKLPTIONSSRPCLGGLVAREASSVQSPCRVELAKCIAPQKADEGRFPLSWRIATPDGFIYYRGK隠LLARLEKKAEAQLTKGAEEVFGNSVPLRKLSRSSKTKWISRWRLQILPRNDPKCAANVACVPAPSSLVQDGFFTRSTVQNWDGYGGAVVYEGEKFLEKEVRRDEEQLLKERTYPEPRTLE396040204080414042004260432043804440446460120180240300360420480540600660720780840,9601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402100216021876012018024030036042048054057權(quán)利要求1、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因Ppviolaxanthinde-epoxidase，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNo.1所示。2、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因尸jPW'o7a;ra/7t/7^ofe-epoxiokse,其特征在于，其堿基序列如SEQIDNo.2所示。3、權(quán)利要求l所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。4、含有權(quán)利要求1所述基因的載體。5、表達(dá)權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。全文摘要本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因Ppviolaxanthinde-epxidase及其編碼的蛋白質(zhì)、含有該基因的載體、和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術(shù)，可以利用該基因培育出優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，從而提高農(nóng)作物的抗逆性。文檔編號(hào)C12N5/10GK101580838SQ20081011161公開日2009年11月18日申請日期2008年5月15日優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日發(fā)明者何奕昆,孫銘明,崔素霞,慧王,勇胡申請人:首都師范大學(xué)