。
[002引 2.弓I物篩選及驗證過程
[0023] (1)通過通用性試驗篩選檢測黃色鑲抱菌的LAMP引物
[0024]W篩選能檢測黃色鑲抱菌的LAMP引物為目的，進行W下實驗：選擇黃色鑲抱菌標 準菌株，化及來自不同地區(qū)的黃色鑲抱菌（表2)的DNA作為模板，取2μΙDNA溶液，加入 24μL不同祀標設(shè)計出的LAMP引物所配制的檢測溶液進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為：62°C， 85min;反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，含有黃色鑲抱菌的樣品應(yīng)變?yōu)樘焖{色，陰性對照為紫 色。若反應(yīng)結(jié)束后能使所有含有黃色鑲抱菌的樣品變?yōu)樘焖{色，則該引物符合通用性實驗 要求，可繼續(xù)進行下一步篩選實驗；若不能使所有含有黃色鑲抱菌的樣品變?yōu)樘焖{色，則該 引物不符合實驗要求，廢棄。
[00巧](2)通過特異性試驗篩選檢測黃色鑲抱菌的LAMP引物
[0026] W篩選能特異地檢測黃色鑲抱菌的LAMP引物為目的，進行W下實驗：選擇黃色鑲 抱菌標準菌株，與其屬內(nèi)相近種禾谷鑲抱菌、尖鑲抱菌、層出鑲抱菌、木賊鑲抱菌、茄腐鑲抱 菌、燕麥鑲抱菌、厚垣鑲抱菌、Ξ線鑲刀菌、長足鑲抱菌、甘薦鑲抱菌、變紅鑲抱菌、短肥鑲抱 菌、銳頂鑲抱菌、輪枝鑲抱菌和團鑲抱菌（表2)，W及其他屬病原菌（平頭炭痘菌、膠抱炭痘 菌、多主棒抱菌、大豆紫斑病菌、大豆炭腐病菌、立枯絲核菌、冬青麗赤殼菌、玉蜀泰平廝蠕 抱菌、米曲霉菌、稻攝病菌、大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌、大豆莖褐腐病菌、 大豆擬莖點種腐病菌、大豆疫霉病菌）（表2)的DNA作為模板，取2μΙDNA溶液，加入24μΙ 經(jīng)（1)篩選出的LAMP引物所配制的檢測溶液進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為：62°C，85min;反 應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，含有黃色鑲抱菌的樣品應(yīng)變?yōu)樘焖{色，而含其他種的樣品和陰 性對照為紫色。若反應(yīng)結(jié)束后，除黃色鑲抱菌為天藍色，其他樣本為紫色，則該引物符合特 異性的實驗要求，可進行下一步篩選實驗；否則，該引物不符合實驗要求，廢棄。
[0027] (3)通過靈敏度試驗篩選檢測黃色鑲抱菌的LAMP引物
[002引 W篩選能靈敏地檢測出黃色鑲抱菌的LAMP引物為目的，進行W下實驗：選擇黃色 鑲抱菌標準菌株，將標準黃色鑲抱菌菌株DNA用分光光度計測定濃度（lOOng·μL?)后用DEPC水進行10倍比稀釋，-70°C保存作為模板。分別取10倍比稀釋后的各濃度DM稀釋液 2μL作為模板，加入24μL經(jīng)似篩選出的LAMP引物所配制的檢測溶液進行LAMP反應(yīng)，反 應(yīng)程序為：62°C，85min;反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色變化，陰性對照為紫色，記錄變?yōu)樘焖{色的 樣品的濃度，檢測靈敏度要求至少達到皮克級水平。
[0029] 經(jīng)過一系列實驗，本發(fā)明最終采用WCYP51C為祀標基因設(shè)計的引物中的一套通 用性好、特異性強、靈敏度高，能快速準確地檢測出黃色鑲抱菌的引物，由invitrogen(上 海）公司合成，其序列信息如下：
[0030] 表1
[0031]
[0032] 3.參試菌株
[0033] 本研究所使用的參試菌株如表2所示：
[0034]表 2
[0035]
[0036]
[0037]
[00測有益效果
[0039] 發(fā)明人在黃色鑲抱菌的CYP51C基因序列比對時發(fā)現(xiàn)其基因序列在種內(nèi)不同菌株 間高度保守，在鑲抱菌屬的種間存在豐富的變化，可作為黃色鑲抱菌分子檢測的候選祀標。 本發(fā)明通過分析黃色鑲抱菌的CYP51C基因與其他鑲抱菌在序列上的差異，設(shè)計并篩選了 四條特異性的LAMP引物和兩條環(huán)引物，并在此基礎(chǔ)上建立了黃色鑲抱菌的LAMP檢測體系。 本發(fā)明解決了現(xiàn)有黃色鑲抱菌的檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性偏低的問 題，所需檢測時間短（僅需85min)、特異性強、靈敏度高、可肉眼直接觀察檢測結(jié)果。
[0040] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在：
[0041] (1)實用性好。普通PCR反應(yīng)對產(chǎn)物進行凝膠電泳并用漠化乙錠染色后紫外光下 觀察才可判別結(jié)果，運不僅增加檢測所需時間和檢測操作環(huán)節(jié)，還容易造成產(chǎn)物擴散，成為 實驗室污染的一個重要來源；而且漠化乙錠巧B)有劇毒，可累積致癌；此外，紫外光也會對 實驗人員造成一定程度的傷害。而LAMP反應(yīng)只需在恒溫水浴鍋中進行，反應(yīng)之前加入HNB， 反應(yīng)后通過顏色變化可用肉眼直接觀察判斷結(jié)果。本發(fā)明操作簡單，所需時間短（完成一 次檢測僅需化)，污染小，具有更強的實用性。
[0042] (2)恒溫擴增。不像PCR技術(shù)必須要熱循環(huán)，運樣就擺脫了對熱循環(huán)儀器的依賴， 只要有穩(wěn)定的熱源如恒溫水浴鍋，LAMP反應(yīng)就可W完成，不需要昂貴的儀器設(shè)備，故而便于 基層農(nóng)業(yè)生產(chǎn)單位應(yīng)用。LAMP能在恒定的熱源下發(fā)生反應(yīng)，是因為LAMP反應(yīng)液中添加了甜 菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動態(tài)平衡中，從而在鏈置換DNA聚合酶的作用下實現(xiàn)擴增。
[0043] (3)準確度高。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)耗時長、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的 干擾；而本發(fā)明選取黃色鑲抱菌CYP51C-段特有的序列，設(shè)計出特異性的LAMP引物，通過 四條引物特異性識別祀序列的6個獨立區(qū)域，相對于PCR引物識別祀序列的2個獨立區(qū)域 而言，特異性更強，靈敏度更高。
[0044] (4)顯著提升技術(shù)水平?；陟霕嘶駽YP51C設(shè)計與篩選的高特異性引物與LAMP 技術(shù)相結(jié)合建立的黃色鑲抱菌快速分子檢測體系，克服了過去相關(guān)技術(shù)所存在的缺陷，縮 短了檢測所需時間，簡化了操作過程，提高了檢測的特異性和靈敏度，使技術(shù)水平得W升 級。
【附圖說明】
[0045] 圖1肉眼觀測結(jié)果
[0046] 左側(cè)EP管呈天藍色，表示為黃色鑲抱菌檢測陽性（+)，右側(cè)EP管呈紫色，表示為黃 色鑲抱菌檢測陰性（-)。
[0047] 圖2基于祀基因CYP51C的LAMP技術(shù)檢測黃色鑲抱菌的通用性
[0048] 其中，1號為黃色鑲抱菌標準菌株（陽性對照），2~8號為不同地區(qū)來源的黃色鑲 抱菌菌株，9號為水（陰性對照）。2~8號寄主及地區(qū)見本說明書表2提供的參試菌株信 息。來自江蘇南京江浦農(nóng)場和徐州、山東濟寧、安徽宿州、北京等地的大豆上分離到的黃色 鑲抱菌參與了驗證，結(jié)果顯示都為陽性反應(yīng)（天藍色），說明該技術(shù)對來自不同寄主和地區(qū) 的黃色鑲抱菌的檢測均適用。
[0049] 圖3基于祀基因CYP51C的LAMP技術(shù)檢測黃色鑲抱菌的特異性
[0050] 其中，1號為黃色鑲抱菌標準菌株（陽性對照），2~7號為禾谷鑲抱菌（化sarium graminearum)不同菌株，8~13號為尖鑲抱菌（F.oxysporum)不同菌株，14~19號為層 出鑲抱菌化proliferatum)不同菌株，20~24號為木賊鑲抱菌（F.equiseti)不同菌株， 25~29號為茄腐鑲抱菌（F.solani)不同菌株，30號為燕麥鑲抱菌（F.avenaceum)，31號 為厚垣鑲抱菌（F.chlamydosporum)，32號為Ξ線鑲刀菌化tricinctum)，33號為長足鑲抱 菌化longipes)，34號為甘薦鑲抱菌化sacchari)，35號為變紅鑲抱菌化incarnatum)， 36號為短肥鑲抱菌化brachyg比bosum)，37號為銳頂鑲抱菌化acuminatum)，38號為 輪枝鑲抱菌（F.ve;rticillioides)，39號為團鑲抱菌化commune)，40號為平頭炭痘菌 (Colletotrichumtruncatum)，"號為膠抱炭痘菌（C.gloeospo;rioide)，42 號為多主棒 抱菌（Corynespora cassiicola)，43號為大豆炭腐病菌（Macrophomina phaseolina)，44號為大豆紫斑病菌（Cercospora kikuchii)，45號為立枯絲核菌（Miizoctonia solani)， 46號為冬青麗赤殼菌（Calonectria ilicicola)，47號為玉蜀泰平廝蠕抱菌度ipolaris maydis)，48號為米曲霉菌（Aspergillus oryzae)，49號為稻攝病菌
[0051](Ma即aporthe oryzae)，50號為大豆南方莖潰瘍病菌值iaporthe phaseolorum var. caulivora)，51號為大豆北方莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum var. me;ridionalis)，52號為大豆莖褐腐病菌（陸ialo地ora gregata f. sp. sojae)，53號為大豆 擬莖點種腐病菌（Phomopsis longicolla)，54號為大豆疫霉病菌（Phyto地thora sojae)， 55號為水（陰性對照）。所用病原菌的寄主及地區(qū)見本說明書表2提供的參試菌株信息。 結(jié)果顯示，所有供試的禾谷鑲抱菌等鑲抱菌和其他病原菌均呈紫色的陰性反應(yīng)，僅1號黃 色鑲抱菌標準菌株呈天藍色的陽性反應(yīng)。表明本發(fā)明建立的技術(shù)可W區(qū)分目標病原菌（黃 色鑲抱菌）和非目標病原菌（其他鑲抱菌與其他屬病原菌）。
[0052] 圖4基于祀基因CYP51C的LAMP技術(shù)檢測黃色鑲抱菌的靈敏度
[0053] LAMP擴增不同濃度的黃色鑲抱菌基因組DNA;其中，1號為黃色鑲抱菌標準菌株基 因組（陽性對照），