專利名稱：松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用生物的引物序列和化學(xué)方法來(lái)測(cè)試分析材料的方法，具體是松 材線蟲(chóng)快速檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
當(dāng)今，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人類對(duì)環(huán)境安全和綠色環(huán)保的高度重視，在森林 保護(hù)方面，世界范圍都在研究和開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)危險(xiǎn)性害蟲(chóng)的方法。松樹(shù)是森林的主要 構(gòu)成樹(shù)種，松材線蟲(chóng)是松樹(shù)的主要危險(xiǎn)性害蟲(chóng)，浙江省是松材線蟲(chóng)的重要發(fā)生區(qū)，及早檢測(cè) 出松材線蟲(chóng)，對(duì)于松材線蟲(chóng)防控具有重要意義。松材線蟲(chóng)的檢測(cè)一般采用采集、分離、鏡檢 的方法，關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員肉眼觀察。由于松材線蟲(chóng)非常小，體長(zhǎng)只有1mm，尤 其是擬松材線蟲(chóng)與松材線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)上非常相似，不易區(qū)別，由此產(chǎn)生鑒別準(zhǔn)確性的問(wèn)題，嚴(yán) 重影響了松材線蟲(chóng)的防治工作和森林保護(hù)發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題有三點(diǎn)一是提供一種檢測(cè)松材線蟲(chóng)的專用引物；二是 提供一種能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)松材線蟲(chóng)的方法；三是提供一種檢測(cè)松材線蟲(chóng)的試劑盒。解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是本松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)試劑盒，包括松材線蟲(chóng)特 異性引物、線蟲(chóng)DNA提取液及PCR反應(yīng)用液，其中1)松材線蟲(chóng)特異性引物序列SCXC-F :5，-AAAATAAATGTAAAATGAATG-3‘；SCXC-R :5’ -GTGCTCGTCACGATGATG-3’ ；2)線蟲(chóng)DNA提取液中各原料及其濃度是200mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaClUOOmmo 1/L EDTA、20mg/mL SDS,20y L/ mL β -巰基乙醇和200 μ g/mL蛋白酶K ；3) PCR反應(yīng)用液為10 X PCR 緩沖液、IOmM dNTP、20yM SCXC_F、20yM SCXC_R、5U/yL Taq DNA 聚合 酶、松材線蟲(chóng)陽(yáng)性DNA和重蒸水。用松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)松材線蟲(chóng)的方法包括如下步驟1)線蟲(chóng)DNA的提取取收集的線蟲(chóng)200 μ L置于Eppendorf管中，加入300 μ L線蟲(chóng)DNA提取液，混勻， 在65°C水浴中處理lh，每隔IOmin搖動(dòng)一次；用氯仿與異戊醇的體積比為24 1的混合液 500 μ L抽提，4°C條件下，12000r/min離心15min，取上清液；在上清液中加入2倍于上清液 體積的無(wú)水乙醇，_20°C條件下放置30min，12000r/min離心IOmin ；沉淀物用_20°C預(yù)冷的 75%乙醇ImL洗滌1次，沉淀物干燥后加入100 μ L滅菌重蒸水重新懸浮沉淀即為PCR擴(kuò)增 的模板DNA，在-20°C中冷藏備用；2) PCR反應(yīng)體系的制備
取一 0. 5mL PCR薄壁管，依次加入以下試劑10 X反應(yīng)緩沖液2. 5 μ LdNTP 混合物，10mmol/L 0. 5 μ LSCXC-F,20ymol/L0. 5 μ LSCXC-R,20ymol/L0. 5 μ L
Taq DNA 聚合酶，5U/ μ L 0. 5 μ L模板 DNA2 μ L加重蒸水至終體積為25 μ L，將離心管在離心機(jī)中快速離心使PCR反應(yīng)液混勻；3) PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置94°C預(yù)變性5分鐘后開(kāi)始以下循環(huán)反應(yīng)94°C變性30秒，48°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個(gè)環(huán)后72°C繼續(xù)延伸10分 鐘；4) PCR反應(yīng)結(jié)果的電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物加2 μ L 6XDNA上樣緩沖液，以含溴化乙錠的 瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，與對(duì)照DNA的擴(kuò)增進(jìn)
行比較，如果在270bp處有條帶，說(shuō)明該樣品為松材線蟲(chóng)，沒(méi)有條帶，說(shuō)明不是松材線蟲(chóng)。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有松材線蟲(chóng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)，提供了一種能快速、簡(jiǎn)易 和準(zhǔn)確地檢測(cè)馬尾松、黑松等中松材線蟲(chóng)的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法及其專用引物和 試劑盒對(duì)松材線蟲(chóng)具有很好的專化性，能大幅度提高松材線蟲(chóng)檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。應(yīng)用 本發(fā)明所提供的松材線蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒，普通操作人員就能快速準(zhǔn)確地對(duì)該種線蟲(chóng)進(jìn)行檢 測(cè)。用本方法檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，只需少量的蟲(chóng)體DNA，3個(gè)小時(shí)即可得出檢測(cè)結(jié)果，靈敏 度高、特異性強(qiáng)，應(yīng)用本方法不僅能檢測(cè)松材線蟲(chóng)成蟲(chóng)，還可以檢測(cè)其幼蟲(chóng)和卵，解決了單 純依靠形態(tài)難以對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行鑒定的問(wèn)題。


附圖為松材線蟲(chóng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。其中M :DL2000標(biāo)準(zhǔn)DNA ；1 空白對(duì)照；2 松材線蟲(chóng)；3 擬松材線蟲(chóng)
具體實(shí)施例方式一、引物的設(shè)計(jì)本發(fā)明在GenBank中搜索已發(fā)布的松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的DNA序列，如序列 表所示序列3，根據(jù)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的rDNA ITSl序列間的差異設(shè)計(jì)引物SCXC-F 5，-AAAATAAATGTAAAATGAATG-3，和 SCXC-R :5，-GTGCTCGTCACGATGATG-3，，用該引物對(duì)松材 線蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。二、松材線蟲(chóng)的檢測(cè)1、線蟲(chóng)基因組DNA提取取收集的線蟲(chóng)200 μ L于Eppendorf管中，加入300 μ L線蟲(chóng)DNA提取液(200mmol/ L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、100mmol/L EDTA 即乙二胺四乙酸、20mg/mL SDS 即十二燒基磺酸鈉、20 μ L/mL β -巰基乙醇、200 μ g/mL蛋白酶K)，混勻，在65 °C水浴中處理lh，每隔 IOmin搖動(dòng)一次；用氯仿與異戊醇的體積比為24 1的混合液500 μ L抽提，4°C條件下， 12000r/min離心20min，取上清液；在上清液中加入2倍體積于上清液的無(wú)水乙醇，-20°C 條件下放置30min，12000r/min離心20min ；沉淀物用_20°C預(yù)冷的75%的乙醇ImL洗滌1 次，沉淀物干燥后加入100 μ L滅菌重蒸水重新懸浮沉淀即為PCR擴(kuò)增的模板DNA。上述相 關(guān)試劑的用量為一次DNA提取實(shí)驗(yàn)所用的量。本試劑盒中提供的線蟲(chóng)DNA提取液為20mL，可滿足50次實(shí)驗(yàn)所需的量。上述線蟲(chóng)樣品可為同一種線蟲(chóng)的純樣品或多種線蟲(chóng)的混合樣品，其蟲(chóng)態(tài)可為幼蟲(chóng) 和/或成蟲(chóng)和/或卵。2、PCR 擴(kuò)增取一 0. 5mlPCR薄壁管，依次加入以下試劑10 X PCR 緩沖液2. 5 μ 1dNTP 混合物，IOmmo 1/L 0. 5 μ 1SCXC-F, 20 μ mo 1/L0. 5 μ 1SCXC-R, 20 μ mo 1/L0. 5 μ 1Taq DNA 聚合酶，5U/μ L 0. 5 μ 1模板 DNA2 μ 1加重蒸水至終體積為25 μ 1。上述相關(guān)試劑的用量為一次PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所用的量。上述引物SCXC-F見(jiàn)序列表的序列1，SCXC-R見(jiàn)序列表的序列2。將反應(yīng)混合液置于PCR儀中，94°C預(yù)變性5分鐘后開(kāi)始以下循環(huán)反應(yīng)94°C變性 30秒，48°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個(gè)環(huán)后72°C繼續(xù)延伸10分鐘。本試劑盒中提供的PCR反應(yīng)用液為10XPCR緩沖液150 μ L、10mM dNTP 30 μ L、 20 μ M SCXC-F 30μ L,20yM SCXC-R 30μ L,5U/y 1 Taq DNA 聚合酶 30 μ L、松材線蟲(chóng)陽(yáng)性 DNA 100 μ L和重蒸水ImL，可滿足50次PCR反應(yīng)所需的量。3、結(jié)果檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物加2 μ L 6XDNA上樣緩沖液，以含溴化乙錠的 瓊脂糖凝膠電泳，從電泳圖中可看到，從松材線蟲(chóng)中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為270bp的片段，
而從擬松材線蟲(chóng)中不能擴(kuò)增出條帶。說(shuō)明該引物的特異性強(qiáng)，可以從擬松材線蟲(chóng)中檢測(cè)到 松材線蟲(chóng)。線蟲(chóng)DNA提取液、PCR反應(yīng)用液和DNA上樣緩沖液的相關(guān)原料市售而得，上述相關(guān) 原料的濃度和/或量為本申請(qǐng)人自行配制和實(shí)際應(yīng)用。4、將擴(kuò)增出的松材線蟲(chóng)片段制作克隆后測(cè)序，得到的序列如序列表所示序列4，將 該序列與已發(fā)表的松材線蟲(chóng)的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所測(cè)的序列與已發(fā)表的松材線蟲(chóng)序列 只有一個(gè)堿基不同，同源性為99%，而與擬松材線蟲(chóng)序列的同源性最高只有89%，說(shuō)明克 隆的片段確實(shí)為松材線蟲(chóng)的片段，PCR結(jié)果是真實(shí)可靠的，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)松材線蟲(chóng)是特異 的。
權(quán)利要求
一種松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)試劑盒，包括特異性引物、DNA提取液、松材線蟲(chóng)陽(yáng)性DNA及PCR反應(yīng)用液，其特征是1)松材線蟲(chóng)特異性引物序列SCXC F5’ AAAATAAATGTAAAATGAATG 3’；SCXC R5’ GTGCTCGTCACGATGATG 3’；2)線蟲(chóng)DNA提取液中各原料及其濃度是200mmol/L Tris HCl、200mmol/L NaCl、100mmol/L EDTA、20mg/mL SDS、20μL/mLβ 巰基乙醇和200μg/mL蛋白酶K；3)PCR反應(yīng)用液為10×PCR緩沖液、10mM dNTP、20μM SCXC F、20μM SCXC R、5U/μL Taq DNA聚合酶、松材線蟲(chóng)陽(yáng)性DNA和重蒸水。
2.用權(quán)利要求1所述松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)松材線蟲(chóng)的方法，其特征是包 括如下步驟1)線蟲(chóng)DNA的提取取收集的線蟲(chóng)200 μ L置于Eppendorf管中，加入300 μ L線蟲(chóng)DNA提取液，混勻，在65°C 水浴中處理lh，每隔IOmin搖動(dòng)一次；用氯仿與異戊醇的體積比為，24 1的混合液500 μ L 抽提，4°C條件下，12000r/min離心15min，取上清液；在上清液中加入2倍于上清液體積的 無(wú)水乙醇，-20°C條件下放置30min，12000r/min離心IOmin ；沉淀物用_20°C預(yù)冷的75%乙 醇ImL洗滌1次，沉淀物干燥后加入100 μ L滅菌重蒸水重新懸浮沉淀即為PCR擴(kuò)增的模板 DNA，在-20°C中冷藏備用；2)PCR反應(yīng)體系的制備取一 0. 5mL PCR薄壁管，依次加入以下試劑及其含量，10 X PCR 緩沖液2. 5yLdNTP 混合物，10mmol/L 0. 5 μ LSCXC-F,20ymol/L0. 5 μ LSCXC-R, 20 μ mo 1/L0. 5 μ LTaq DNA 聚合酶，5U/ μ L 0. 5 μ L模板DNA2 μ L加重蒸水至終體積為25 μ L，將離心管在離心機(jī)中快速離心使PCR反應(yīng)液混勻；3)PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置94°C預(yù)變性5分鐘后開(kāi)始以下循環(huán)反應(yīng)94°C變性30秒，48°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸10分鐘；4)PCR反應(yīng)結(jié)果的電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取IOyL擴(kuò)增產(chǎn)物加2μ L 6XDNA上樣緩沖液，以含溴化乙錠的 瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，與對(duì)照DNA的擴(kuò)增進(jìn)行 比較，如果在270bp處有條帶，說(shuō)明該樣品為松材線蟲(chóng)，沒(méi)有條帶，說(shuō)明不是松材線蟲(chóng)。
全文摘要
一種松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)方法及試劑盒，松材線蟲(chóng)特異性引物序列如序列表的序列1和2所示，線蟲(chóng)DNA提取液中各原料及濃度是200mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、100mmol/LEDTA、20mg/mL SDS、20μL/mLβ-巰基乙醇和200μg/mL蛋白酶K；PCR反應(yīng)用液為10×PCR緩沖液、10mM dNTP、20μMSCXC-F、20μM SCXC-R、5U/μL Taq DNA聚合酶、松材線蟲(chóng)陽(yáng)性DNA和重蒸水；本試劑盒及其檢測(cè)方法對(duì)松材線蟲(chóng)的成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)及卵都能檢測(cè)，且能分辨出松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)，具有檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921844SQ20101022897
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者徐志宏, 陳為民, 馬新穎 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué);杭州市森林和野生動(dòng)物保護(hù)管理總站