一種TRβ基因突變檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測試劑盒及檢測方法,特別是設(shè)及一種ΤΚβ基因突變檢測試劑 盒及檢測方法,屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀腺激素抵抗綜合征(RTH)是由于甲狀腺激素受體(TR)基因突變,導(dǎo)致祀器官 對甲狀腺激素(ΤΗ)的敏感性降低,使得ΤΗ對全身組織器官作用障礙的一種綜合征。目前認(rèn) 為該病是一種常染色體顯性或隱性遺傳性疾病,有家族發(fā)病傾向,也有散發(fā)病例。根據(jù)突變 受體亞型不同,分為TRa基因突變致RTH(RTHa)和ΤΚβ基因突變致RTH(RT郵)。1967年 Ref etoff首次報道RT冊,目前全世界共報道3000多RT冊病例,RT地是一類罕見的內(nèi)分泌疾 病,其中80%由T祕基因突變所致,W家族性發(fā)病多見,呈常染色體顯性或隱性遺傳。T祕基 因突變是確診RT地的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] RT冊臨床表現(xiàn)呈高度異質(zhì)性,主要由于ΤΚβ基因缺陷的嚴(yán)重程度及各祀器官對TH 的依賴性和反應(yīng)性不同。依據(jù)抵抗程度的組織分布,可分為全身型RT冊、垂體型RT冊。臨床 可表現(xiàn)為甲亢(甲狀腺高代謝癥狀)或甲減(乏力、怕冷和記憶力減退等)或無明顯甲功異 常,或同時合并甲亢和甲減癥狀。臨床醫(yī)師易誤診為甲亢,予W抗甲狀腺激素藥物、放射性 艦治療或合用kT4治療,導(dǎo)致疾病癥狀加重,因此正確診斷很重要。
[0004] 目前臨床診斷RT冊主要通過kT3抑制實驗和TRH興奮試驗,但由于國內(nèi)不生產(chǎn)k T3和T畑,從國外購買困難,導(dǎo)致該疾病長期W來無法診斷。
[0005] 金婷等W31歲女患為研究對象,該患者W甲狀腺腫就診,伴屯、慌、出汗和月經(jīng)減 少等甲亢癥狀;同時有血脂異常等甲減癥狀。停賽治1個月后甲狀腺功能顯示FT3和FT4升 高,而T甜不適當(dāng)升高。心了3抑制試驗顯示垂體組織和外周組織均存在不同程度的??抵抗。 基因測序發(fā)現(xiàn)患者T祕基因出現(xiàn)M442T突變。診斷為全身型RT地(T祕基因 M442T點突變的散 發(fā)病例)。2004年Bayer在國際上首次報道一個M442T突變家系,先證者表現(xiàn)為結(jié)節(jié)性甲狀腺 腫和房顫(非屯、臟病因),F(xiàn)T3和FT4升高,TSH正常高限。目前國際上僅1例M442巧良道,國內(nèi)尚 無該突變位點的報道。T祕的M442T突變導(dǎo)致其T3依賴性轉(zhuǎn)錄活性受損,同時突變的T祕干擾 正常T祕的功能,即顯性負(fù)效作用,運是M442T導(dǎo)致RT地發(fā)病的分子機制。
[0006] 綜上,建議臨床遇到血清FT3和FT4升高,而T甜正?;蛏呋颊?,或確診為甲亢后 抗甲藥治療甲狀腺功能一直不能恢復(fù)正常的患者,要警惕T祕基因突變,因此臨床迫切需要 一種檢測效率高,方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,成本低的T祕基因突變檢測試劑盒及檢測方法,用W 提高RT地的確診率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的就在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題,提供一種檢測效率高,方法 簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,成本低的T祕基因突變檢測試劑盒及檢測方法,用W提高RT地的確診率。 [000引本發(fā)明給出的技術(shù)方案是:一種ΤΚβ基因突變檢測試劑盒,該試劑盒包括PCR緩沖 液,酶溶液,10對1-10號外顯子特異性擴增引物。
[0009] 所述PCR緩沖液包括0.5mM的MgCl2,0.5mM的dNTPs,其中dNTPs表示dATP,dUTP, dGTP,dCTP。
[0010] 所述酶溶液為高保真化q酶和UNG酶。
[0011] 所述10對1-10號外顯子特異性擴增引物編號為沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2、SEQ 10側(cè):3和沈910側(cè):4、56910側(cè):5和沈910側(cè):6、56910側(cè):7和沈910側(cè):8、56910 NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0012] 本發(fā)明還提供一種T祕基因突變檢測方法,包括W下步驟。
[001引(1)制備本發(fā)明的T祕基因突變檢ii試劑盒。
[0014] (2)提取待測樣品,進行PCR反應(yīng)。
[001引 (3 )PCR產(chǎn)物純化測序,獲得了祕基因突變檢測結(jié)果。
[0016] 其特征在于,利用T祕基因1-10號外顯子特異性擴增引物對待測樣品進行點突變 檢測,包括。
[0017] 利用所述擴增引物和待測樣本建立PCR擴增反應(yīng)體系和程序,獲得PCR產(chǎn)物,純化 后測序。
[001引所述PCR擴增反應(yīng)體系如下。
[0019]
[0020] 所述PCR擴增反應(yīng)程序如下。
[0021]
[0022] 所述PCR產(chǎn)物純化處理所用試劑可W為市面上任何一款PCR產(chǎn)物純化試劑。
[0023] 所述PCR產(chǎn)物純化處理后測序,經(jīng)過對測序圖譜的分析來確定ΤΚβ基因的突變與 否。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是。
[0025] 本發(fā)明Τ祕基因突變檢測試劑盒引物通過專業(yè)設(shè)計和多次篩選,保證了引物特異 性,同時引入UNG酶防污染系統(tǒng),能夠更加準(zhǔn)確,穩(wěn)定地對樣品進行監(jiān)測。本發(fā)明的檢測試劑 盒及檢測方法具有檢測效率高,方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,成本低等特點,因此本發(fā)明具有實質(zhì) 性的技術(shù)效果,便與推廣。
【附圖說明】
[0026] 圖1:患者Τ祕基因第10外顯子部分測序圖。患者Τ祕基因第10外顯子的第442位密 碼子處存在點突變,密碼子由ATG改變?yōu)锳CG,編碼的蛋白質(zhì)由蛋氨酸變?yōu)樘K氨酸(Μ442Τ)。 進一步分析其基因測序圖,該突變?yōu)殡s合子突變。患者父母的ΤΚβ基因未發(fā)現(xiàn)該突變。
[0027] 圖2.對實施例2的患者Τ祕全長外顯子1-10進行PCR擴增及測序,Α:患者,Β:患者父 親,C:患者母親,D:患者姐姐,測序結(jié)果顯示,患者第10號外顯子的第453位密碼子存在點突 變,密碼子從CCT突變?yōu)锳CT,導(dǎo)致其所編碼的蛋白質(zhì)由脯氨酸變?yōu)樘K氨酸。而患者父母和姐 姐均未發(fā)現(xiàn)該突變。
【具體實施方式】
[0028] W下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所掲露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實 施方式加 W實施或應(yīng)用,本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點與應(yīng)用,在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0029] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前,應(yīng)理解,本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案,而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍;在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中,除非文中 另外明確指出,單數(shù)形式"一個"、"一"和"運個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0030] 當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時,應(yīng)理解,除非本發(fā)明另有說明,每個數(shù)值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義,本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外,根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載,還可W使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0031] 除非另外說明,本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域的常規(guī)技術(shù)。
[0032] 本發(fā)明實施例提供一種ΤΚβ基因突變檢測試劑盒,該試劑盒包括PCR緩沖液,酶溶 液,10對特異性擴增引物,其中10對特異性引物序列分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2、 569 10側(cè):3和沈9 10顯:4、569 10側(cè):5和沈9 10顯:6、沈9 10側(cè):7和569 10顯:8、 沈Q ID Ν0:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID N0:20〇
[0033] 具體地,所述PCR緩沖液含有0.5mM的MgCb,0.5mM的dNTPs,其中dNTPs表示dATP, dUTP,dGTP,dCTP。
[0034] 具體地,所述10對特異性引物序列如表1所示。
[00巧]表1 10對特異性引物序列。
[0036]
[0037]
[003引優(yōu)選地,本發(fā)明TR β基因突變檢測特異性引物針對Τ祕基因1-10號外顯子設(shè)計且 通過多次篩選,保證了引物特異性。
[0039] 優(yōu)選地,本發(fā)明實施例中的酶溶液中含有化q酶,其為PCR反應(yīng)所必需,且該酶溶液 還含有UNG酶,在PCR反應(yīng)中,使用UNG酶可防非特異性PCR擴增污染。
[0040] 本發(fā)明還提供一種TR β基因突變檢測方法,包括W下步驟(1)制備TR β基因突變 檢測試劑盒;(2)取10只PCR管,分別向其中加入步驟(1)中的PCR緩沖液、酶溶液;向所述10 只PCR管中分別加入步驟(1)中的10對特異性引物;(3)提取待測樣品DNA,分別加入至所述 10只PCR管中,進行PCR反應(yīng)。
[0041 ] 具體地,上述步驟(2)中的PCR緩沖液包括1.0-5. OmM的MgCb,1.0-5. OmM的dNTPs, 良P dATP,加 TP,dGTP,dCTP各1.0-5.OmM。
[0042] 優(yōu)選地,Κ50μ1反應(yīng)體系為例,向步驟(2)中加入待測樣品后得到的混合物中各組 分終濃度及含量如下。
[0043]
[0044]
[0045] 上述體系僅為例證性,在實際應(yīng)用中可按照比例擴大或縮小該混合物體積及其中 各組分含量。
[0046] 具體地,在上述50μ1反應(yīng)體系中,所述各對引物包括步驟(1)中的10對特異性引 物,所述樣品為基因組DNA。
[0047] 具體地,在步驟(3)中的PCR反應(yīng)條件為。
[004引
[0049] 在上述PCR反應(yīng)后,對結(jié)果進行分析,所得結(jié)果可分為W下二種。
[0化0] (1)測序結(jié)果比對后與野生型一致,無突變。
[0051] (2)測序結(jié)果比對后出現(xiàn)突變,如圖1所示。
[0化2] 實施例1。
[0053] 制備本發(fā)明的Τ祕基因突變檢測試劑盒,包括W下步驟:
[0054] 1.引物合成:針對人類Τ地基因1-10號外顯子序列設(shè)計并合成10對特異性引物,序 列分別為沈Q ID NO:巧Ρ沈Q ID N0:2、SEQ ID Ν0:3和沈Q ID N0:4、SEQ ID Ν0:5和沈Q ID NO:6、SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8、SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO:11和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO:18、沈Q ID NO:19和沈Q ID NO:20。
[0055] 將上述各對引物