用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌試劑盒與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于耐碳青霉締類腸桿菌(CRE)檢測技術領域，具體設及碳青酶締酶基因 KPC、NDM、IMP、VIM和0XA-48的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 碳青霉締類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型β-內(nèi)酷胺抗生素，因其 具有對β-內(nèi)酷胺酶穩(wěn)定W及毒性低等特點，已經(jīng)成為治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物 之一。隨著其在臨床中的廣泛應用，碳青霉締類抗生素出現(xiàn)嚴重的耐藥現(xiàn)象，耐藥細菌表現(xiàn) 為廣泛耐藥。2000年W前，未見碳青霉締酶廣泛流行的報道，更多的是AmpC酶或者ES化合并 膜孔蛋白丟失造成碳青霉締耐藥的報道;2001年，美國北卡羅來納州首次報道KPC(該菌是 1996年在ICU分離出的一株細菌）；2004年，美國紐約布魯克林地區(qū)報道了 KPC的暴發(fā)流行； 從1996年到2006年間，KPC風行美國全國；過去的十年，CRE逐漸成為威脅人類健康的一個重 要問題。碳青霉締耐藥的腸桿菌（Ca;rbapenem-Resis1:ant Enterobacteriaceae)或耐碳青 霉締腸桿菌，包括腸桿菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌、肺炎克雷伯菌等，具有特點包括（1)所 致感染病死率高；（2)意味著泛耐藥，治療方案有限（3)位于質(zhì)粒上的耐藥基因在不同種的 細菌間傳遞；（4)耐藥轉移速度快:從院內(nèi)到社區(qū)；因此對于耐藥菌株的快速檢測對于患者 抗生素精準治療，減少抗生素濫用具有極為重要的臨床意義。
[0003] 越來越多研究表明，細CRE耐藥機理主要包括:碳青霉締酶與頭抱菌素酶合并膜孔 蛋白丟失。產(chǎn)碳青霉締酶基因存在多重，包括KPC、NDM-l、IMP、VIM與0XA-48等運5種最流行 的碳青霉締類抗菌藥物耐藥機制。KPC是引起腸桿菌科細菌碳青酶締主要原因，KPC的基因 型已達約20種，目前流行的主要是KPC-2和KPC-3; NDM基因大約有12種NDM基因型，是引起全 球關注的新發(fā)水解活性極強的碳青霉締酶；IMP和VIM是臨床中最為常見的金屬β-內(nèi)酷胺 酶。0ΧΑ-48高度水解青霉素，輕度水解碳青霉締類藥物(活性中屯、無疏水橋），對ΙΡΜ的活性 大于ΜΗΜ。
[0004] 目前用于CRE基因型檢測的方法有多種類型，包括PCR法、環(huán)介導等溫擴增方法、基 因忍片等，運些方法存在檢測通量低、集成程度差、檢測費用相對較高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術所存在的問題，本發(fā)明針對爆發(fā)流行最常見、最關鍵的基因，采用多 重擴增技術，結合CFX96 Touch?巧光定量pCR、biometra Toptical型巧光定量PCR等6通道 檢測系統(tǒng)，單次反應檢測W上五種基因的多種亞型，為臨床工作者鑒定CRE基因型，縮短時 間、降低成本具有極大的臨床意義。
[0006] 本發(fā)明目的之一提供一種用于檢測耐碳青霉締類腸桿菌(CRE)的試劑盒，試劑盒 中包括下述組合物:檢測引物對和檢測探針。本發(fā)明的目的之二還在于提供基于該檢測引 物對和檢測探針的根進一步的試劑盒及檢測方法。本發(fā)明的組合物、試劑盒及檢測方法能 夠多重擴增分別檢測KPC、NDM與IMP、VIM、0XA-48等耐藥基因，并且實現(xiàn)耐藥基因定量測定。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供用于檢測耐碳青霉締類腸桿菌的試劑盒，包括下述檢測引物對中的至 少一對：
[0009] 檢測引物對1:
[0010] 邸(：上游引物為:5'-41^6〇1；1'(：了461'1'(：了6(：了6-3'，如沈9 10^.1所示，
[0011] KPC下游引物為:5' -TATCCATCGCGTACACACCG-3'，如沈Q ID NO. 2所示；
[0012] 檢測引物對2:
[0013] NDM上游引物為:5' -GCAAATGGAAACTGGCGACC-3'，如沈Q ID NO. 4所示，
[0014] NDM下游引物為:5' -TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3'，如沈Q ID NO. 5所示；
[001引檢測引物對3:
[0016] 〇^上游引物為：5'-口^461766口^461761766了6-3'，如沈9 10^.7所示，
[0017] IMP下游引物為:5' -TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3'，如沈Q ID NO. 8所示；
[001引檢測引物對4:
[0019] ￥0〇1游引物為：5'-40：464刊601；4了66了61'1'-3'，如沈9 10^.10所示，
[0020] ￥碰下游引物為:5'-1^61^4了64446了6〔6了664-3'，如沈9 10^.11所示；
[0021] 檢測引物對5:
[0022] 0乂4-48上游引物為:5'-666〔641^446口'4176664-3'，如沈9 10^.13所示，
[0023] 0乂4-48下游引物為：5'-66口'6了61'1'1'1766了66〔41'-3'，如沈9 10備.14所示。
[0024] 本發(fā)明從眾多基因中選擇KPC、NDM與IMP、VIM、0XA-48中的一種或幾種作為檢測的 目的基因，一方面，可W保證檢測結果的靈敏性和有效性，另一方面，具有操作簡便、成本 低、所需時間短等優(yōu)點。在引物的設計過程中，由于檢測樣本的不確定性，往往出現(xiàn)非特異 性擴增、無法擴增出或者引物與引物之間、引物與其他探針之間擴增相互干擾等問題，發(fā)明 人意外的發(fā)現(xiàn)上述序列的檢測引物具有很好的特異性和有效性，尤其，當運幾種基因 KPC、 NDM與IMP、VIM、0XA-48-起聯(lián)合使用時，效果會更好。
[00巧]進一步，包括至少一個對應與上述檢測引物對匹配的檢測探針，
[0026] 與檢測引物對1匹配的檢測探針為KPC探針：
[0027] KPC探針包括SEQ ID NO. 3所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0028] KPC探針為:5'-巧光標記物 1/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/澤滅劑-3';
[0029] 與檢測引物對2匹配的檢測探針為NDM探針：
[0030] NDM探針包括SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0031] NDM探針為:5'-巧光標記物2/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/澤滅劑-3';
[0032] 與檢測引物對3匹配的檢測探針為IMP探針：
[0033] IMP探針包括SEQ ID NO.9所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0034] IMP探針為:5'-巧光標記物3/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/澤滅劑-3';
[0035] 與檢測引物對4匹配的檢測探針為VIM探針：
[0036] VIM探針包括SEQ ID NO. 12所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0037] VIM探針為:5'-巧光標記物4/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/澤滅劑-3';
[003引與檢測引物對5匹配的檢測探針為0XA-48探針：
[0039] 0乂4-48探針包括569 10^.15所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0040] OXA-48探針為:5'-巧光標記物5/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/澤滅劑-3'。
[0041] 所述巧光標記物1至巧光標記物5選自不同的巧光標記物，用W保證在在同一體系 中通過不同的巧光標記物來區(qū)分內(nèi)標與目的基因。
[0042] 用上述引物對擴增的PCR產(chǎn)物的尺寸均在40bp至2(K)bp的范圍中，運可W使得能夠 在短時間內(nèi)特異性基因。探針可選用下述任一巧光標記物在其5/端標記：FAM、VIC、TET、 JOE、肥 乂、〔￥3、〔￥5、3(^、1?60610、了6乂48 1?60、1?60670、肥0、如333巧05等；選用下述任一澤滅 劑在其3/端標記：6-TAMRA、BHQ-l~3、和結合分子溝的非突光澤滅劑（Minor Groove Binder nonf luorescent quencher，MGBNFQ)〇
[0043] 優(yōu)選地，所述KPC探針的5/端標有巧光基團FAM，KPC探針的y端標有澤滅基團B冊- 1;所述NDM探針的5/端標有巧光基團肥X，NDM探針的y端標有澤滅基團B冊-1;所述IMP探針 的5/端標有巧光基團Texsa Red, IMP探針的y標有澤滅基團BHQ-2;所述VIM探針的5/端標 有巧光基團切5，VIM探針的y端標有澤滅基團B冊-2;所述0XA-48探針的5