一株毒殺植物寄生線蟲的菌核青霉及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株毒殺植物寄生線蟲的菌核青霉及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區(qū)發(fā)生和為害，種類多種多樣。在全球范圍 內(nèi)，植物寄生線蟲的發(fā)生與危害隨著農(nóng)林業(yè)的發(fā)展和耕作栽培制度的變化日益嚴(yán)重。據(jù)估 計，全球每年因植物寄生線蟲給農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)造成的損失高達1，570億美元(Abad P，et al.2008.Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne inco即ita.Na1:ure Biotechnology, 26:909-915)，而實際的損失遠遠超過估計，再者，線蟲 與其它生物相互作用而對植物產(chǎn)生的直接或間接影響還在急劇增加。
[0003] 目前對植物有害的線蟲約有3000多種，在我國主要有根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、松材線 蟲等。根結(jié)線蟲可W危害114科超過3000種植物，是農(nóng)業(yè)上為害最大的一類線蟲，病害發(fā)生 后，一般減產(chǎn)1〇%-15%左右，嚴(yán)重的高達75%W上，甚至絕收(A.G.怖itehead，1998.Plant 化matode Con化O1.ISBN0851991882CAB International)。目前線蟲防治仍W化學(xué)防治為 主，但是線蟲體表為不具細胞結(jié)構(gòu)的角質(zhì)層，神經(jīng)系統(tǒng)又不發(fā)達，蟲體通氣性、透水性較差， 對化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)遲純，所W化學(xué)殺線劑多為劇毒農(nóng)藥，對人畜毒性高，污染環(huán)境，很多已被 禁止用于蔬菜和瓜果。目前雖有一些適于菜田使用的中、低毒殺線劑，但品種很少，給線蟲 的防治工作增添了困難，因此開發(fā)高效安全的生物殺線劑迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何防治植物寄生線蟲。
[0005] 為解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株菌核青霉。
[0006] 本發(fā)明所提供的菌核青霉，其菌株號為D35,其在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、的登記入冊編號為CGMCC No. 12168。
[0007] 上述菌核青霉D35可W分生抱子、菌絲或含有分生抱子和/或菌絲的菌絲體的形式 存在。
[000引上述菌核青霉D35的培養(yǎng)物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0009] 本發(fā)明所提供的菌核青霉D35的培養(yǎng)物，是將菌核青霉D35在微生物培養(yǎng)基中培養(yǎng) 得到的培養(yǎng)容器內(nèi)的物質(zhì)，所述物質(zhì)包括所述菌核青霉和所述菌核青霉的代謝物。
[0010] 上述菌核青霉D35的培養(yǎng)物中，所述微生物培養(yǎng)基可為固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。
[0011] 上述菌核青霉D35的培養(yǎng)物中，所述固體培養(yǎng)基可為由糖米和水制成的固體培養(yǎng) 基。所述糖米是稻谷脫去外保護皮層稻殼后的穎果，內(nèi)保護皮層(果皮、種皮、珠屯、層)完好 的稻米巧粒。
[0012] 為解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了植物寄生線蟲抑制劑。
[0013] 本發(fā)明所提供的植物寄生線蟲抑制劑，它的活性成分是菌核青霉D35和/或菌核青 霉D35的代謝物。
[0014] 所述植物寄生線蟲抑制劑具體可為用乙酸乙醋從菌核青霉D35的培養(yǎng)物中提取得 到的溶于乙酸乙醋的物質(zhì)。
[0015] 上述植物寄生線蟲抑制劑中，所述植物寄生線蟲可為根結(jié)線蟲。
[0016] 上述植物寄生線蟲抑制劑中，所述根結(jié)線蟲可為南方根結(jié)線蟲。
[0017] 上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代謝物和/或菌核青霉D35的培養(yǎng)物在制備 植物寄生線蟲抑制劑中的應(yīng)用或在制備抑制植物寄生線蟲危害黃瓜藥劑中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護范圍。
[001引上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代謝物和/或菌核青霉D35的培養(yǎng)物在抑制 植物寄生線蟲中的應(yīng)用或抑制植物寄生線蟲危害黃瓜中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述植物寄生線蟲可為根結(jié)線蟲。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述根結(jié)線蟲可為南方根結(jié)線蟲。
[0021] 上文中，所述植物寄生線蟲抑制劑中，除所述活性成分外，還含有載體。所述載體 可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體;所 述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物;所述礦物材料可為粘±、滑石、高嶺 ±、蒙脫石、白碳、沸石、娃石和娃藻±中的至少一種;所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀 粉中的至少一種;所述高分子化合物可為聚乙締醇和/或聚二醇;所述液體載體可為有機溶 劑、植物油、礦物油或水;所述有機溶劑可為癸燒和/或十二燒。
[0022] 所述植物寄生線蟲抑制劑中，上述菌核青霉D35可W分生抱子、菌絲或含有分生抱 子和/或菌絲的菌絲體的形式存在。
[0023] 所述植物寄生線蟲抑制劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒 劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。
[0024] 根據(jù)需要，所述植物寄生線蟲抑制劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80 等）、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑）、抑調(diào)節(jié)劑等。
[0025] 實驗證明，活性成分為用乙酸乙醋從菌核青霉D35的培養(yǎng)物中提取得到的溶于乙 酸乙醋的物質(zhì)的植物寄生線蟲抑制劑，在活性成分含量為1.5g/L對南方根結(jié)線蟲的校正死 亡率為100%。菌核青霉D35對南方根結(jié)線蟲卵解化的平均抑制率為99%。菌核青霉D35固體 發(fā)酵培養(yǎng)物在沒有任何助劑填加的條件下，45天時對黃瓜根結(jié)線蟲病防效達83.9%，80天 后對黃瓜根結(jié)線蟲病防效仍達77.7%。經(jīng)菌核青霉D35處理后的黃瓜苗根系發(fā)達，根結(jié)少， 植株生長正常，對黃瓜安全。菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代謝物可用于植物寄生線蟲 的防治中。
[002引保藏說明
[0027]菌種名稱：菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)
[002引菌株編號:D35
[0029] 保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、
[0030] 保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0031] 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0032] 保藏日期:2016年4月12日
[0033] 保藏中屯、登記入冊編號:CGMCC No. 12168
【附圖說明】
[0034] 圖1為菌核青霉D35在馬下平板上菌落形態(tài)。
[0035] 圖2為菌核青霉D35在馬下平板上產(chǎn)抱情況。
[0036] 圖3為菌核青霉D35分生抱子梗形態(tài)。
[0037] 圖4為植物寄生線蟲抑制劑處理45天的黃瓜根系。
[0038] 圖5為CK處理45天的黃瓜根系。
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實施例1、菌核青霉D35的分離與鑒定
[0041 ] 1.1菌株分離
[0042] 采用稀釋平板分離法從中國福建武夷山±樣中分離菌株。稱取±樣10邑放入90ml 無菌水中，用Iml無菌移液管吸取Iml 1〇-1濃度的菌液于一管9ml無菌水中，搖勻即為1〇-2濃 度的菌液，同樣方法，依次稀釋到1〇- 4。將上述1〇-2、1〇-哺1〇-4上壤菌液分別涂布到PDA平板 上，吹干后倒置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，將分離到的真菌轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng)，待長好 后，置于冰箱中保存。取編號為D35的菌株進行下述鑒定。
[0043] 1.2菌株鑒定
[0044] 1.2.1菌株形態(tài)觀察
[0045] 將菌株D35用接種針挑至馬下培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：葡萄糖Ig、蛋白腺0.5g、 KH2P04* 3出0 0.1g、MgS〇4. 7出0 0.05g、0.1%孟加拉紅溶液0.331111、瓊脂1.5~2旨、蒸饋水 100mL，自然抑，2%去氧膽酸鋼溶液2ml (預(yù)先滅菌，臨用前加入），鏈霉素溶液（10 OOOu/ml) 0.33ml(臨用前加入））平板中央，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7化后照相，并于顯微鏡下觀察分生抱 子梗及分生抱子的形態(tài)。從圖1中可W看到菌株D35在馬下培養(yǎng)基上菌落呈圓形，初在邊緣 產(chǎn)生白色菌絲，漸變?yōu)槌吸S色，從圖2中可W看到分生抱子較多的面上近于暗綠色，產(chǎn)抱量 大。從圖3顯微鏡下可W看到D35菌絲有橫隔，分生抱子梗頂端產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小 梗，形如掃靑，分生抱子球形。鑒于分生抱子梗和菌落等典型形態(tài)特征，初步鑒定D35為青霉 屬真困。
[0046] 1.2.2分子生物學(xué)鑒定
[0047] 提取菌株D35的基因組DNA，-20°C保存?zhèn)溆?。W提取的DNA為模板，擴增引物為真菌 rDNA-ITS通用引物ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和口S2(5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3'）JCR 擴增的反應(yīng)體系為 IOXPCR Buffer 2.5 化，dNTPs 1.5 化，TaqDNA 聚合酶0.化L，引物1.扣L，模板DNA 1.扣L，d地20 17.化L，總體積25化。PCR擴增反應(yīng)的條件 為：94°C預(yù)變性2min，94°C變性45S，37°C退火 1111111，72°(：延伸2111111，35個循環(huán)，72°(：延伸 IOmiruPCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后送生工生物工程(北京)有限公 司測序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對，通過MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。 [00 4引經(jīng)測序獲得菌株D35的rDNA-ITS序列（序列表中序列1)，通過Blast分析，選取與之 同源性較高的菌株，利用軟件MEGA5.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析、Nei曲bor-Joining法構(gòu)建菌株的 rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明D35與化nicillium aff. sclerotiorum聚在一個分支上，同 源性為99 %，因此，結(jié)合之前的形態(tài)特征，確定菌株D35為菌核青霉（Penici Ilium aff.sclerotiorum)0
[0049] 菌核青霉（Penicillium aff .scle;rotio;rum)D35 已于 2016年 4 月 12 日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為CGMCC No. 12168。
[0050] 實施例2、植物根結(jié)線蟲抑制劑