用于檢測(cè)表達(dá)金屬?β?內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌的基于6,7?反式頭孢菌素的探針的制作方法
【專利摘要】本公開內(nèi)容包括了對(duì)金屬?β?內(nèi)酰胺酶，特別地碳青霉烯酶的選擇性檢測(cè)有用，從而區(qū)分耐受碳青霉烯類的細(xì)菌的那些物種與是敏感的細(xì)菌菌株的探針的實(shí)施方案?；陬^孢菌素的具有6,7R,R構(gòu)型的探針容易被β?內(nèi)酰胺酶裂解，但不能區(qū)分被金屬?β?內(nèi)酰胺酶和其他β?內(nèi)酰胺酶的裂解。通過修飾頭孢菌素的側(cè)基，選擇性可被引入，其允許探針區(qū)分多種類型的金屬?β?內(nèi)酰胺酶，并因此更狹窄地定義細(xì)菌的菌株以及產(chǎn)生的金屬?β?碳青霉烯酶的類型。
【專利說明】用于檢測(cè)表達(dá)金屬-e-內(nèi)醜胺酶的細(xì)菌的基于6，7-反式頭抱 菌素的探針
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2014年1月17日提交，標(biāo)題為"PROBES FOR DETECTION OF CARBAPE肥M-RESISTANT BACT邸lA"的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/928,524?及于2014年3 月 21 日提交，標(biāo)題為 "6,7-TRANS CEPHALOSPORIN-BASED 化U0R0GENIC PROBES FOR DETECTION OF METAliD-e-LACTAMASE-EXPRESSING BACT邸lA"的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào) 61 /968，404的優(yōu)先權(quán)，其在此通過引用W其整體并入。
[0003] 序列表
[0004] 本公開內(nèi)容包括通過引用W其整體并入本文的序列表。
[0005] 本公開內(nèi)容的領(lǐng)域
[0006] 本公開內(nèi)容設(shè)及對(duì)耐受碳青霉締類的腸桿菌科(enterobacteriaceaeKCRE)特異 并基于立體化學(xué)修飾的頭抱菌素的巧光探針，所述立體化學(xué)修飾的頭抱菌素被修飾W包括 6,7-反式構(gòu)型。本公開內(nèi)容還設(shè)及檢測(cè)由于金屬-0-內(nèi)酷胺酶活性耐受碳青霉締類的細(xì)菌 菌株的方法。
[0007] 背景
[000引由于抗生素的濫用和過度使用，革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如大腸桿菌化scherichia coli)、克雷伯桿菌屬物種化lebsiella species)W及其他腸桿菌科中抗生素耐受性W驚 人的速度在全世界出現(xiàn)（Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol. Rev. 20:440-458 ;Richard 等，（1994) J. Infect. Dis. 170: 377-383 ;Spel 化 erg 等，（2013)N. Engl. J. Med. 368 :299- 302)。特別地，針對(duì)廣譜(6-內(nèi)酷胺類抗生素的耐受性已成為主要公共衛(wèi)生問題。在許多抗生 素中，碳青霉締類具有針對(duì)不同類型的細(xì)菌的最廣譜的活性和最大的效力，并已成為嚴(yán)重 細(xì)菌感染的治療中的"最后手段"(化adley等，（1999)Int. J.Antimicrob.Agents 11:93- 100;化卵-Wallace等，（2011)Antimicrob. Agents Chemother. 55:4943-4960)。然而，主要 由于獲得性碳青霉締酶，耐受碳青霉締類的腸桿菌科(CRE)現(xiàn)被頻繁地觀察到，且病例的數(shù) 目正穩(wěn)步增長(zhǎng)（如eenan&Bush(2007)Clin .Microbiol. Rev. 20:440-458 ;Nordmann等（2011) 血erg.Infect.Dis.17:1791-1798)。
[0009]碳青霉締酶是一組具有水解幾乎所有(6-內(nèi)酷胺類抗生素的能力的(6-內(nèi)酷胺酶，并 包括KPC-類型的Ambler A類0-內(nèi)酷胺酶、VIM-的金屬-0-內(nèi)酷胺酶（M化KAmbler B類）、 IMP-、新德里金屬-0-內(nèi)酷胺酶(New De化i me化ll〇-e-lactamase)(NDM)、W及0XA-48類型 的相對(duì)罕見的 D 類碳青霉締酶（Queenan&Bush(2007)Clin. Microbiol. Rev. 20 :440-458: Nor dmann 等，（2011) Em erg. Infect.Dis. 17 : 1791-1798;Mi;riagou 等，（2010) Clin.Microbiol. Infect. 16:112-122)。碳青霉締酶還被越來越多地報(bào)告為醫(yī)院和社區(qū)獲 得性感染，特別地對(duì)于M化的治療失敗的原因，由于它在不同菌株之間傳播和對(duì)臨床可用抑 制劑的不良敏感性（Queenan&Bush(2007)Cl in. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Walsh 等， (201 l)Clin.Microbiol. 49:3222-3227)。因此，]\?心的生產(chǎn)者的快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)適當(dāng) 的抗菌化學(xué)療法及嚴(yán)格的感染控制至關(guān)重要。
[0010] 目前，用于檢測(cè)e-內(nèi)酷胺酶的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，諸如修改的Hodge測(cè)試（MHT) (Nor血ann等，（2012)Clin.Microbiol.Infect.18:432-438;Cohen(&Leverstein-van(2010) Int.J.Antimicrob.Agents 36:205-210;Bernabeu等，（2012) Diagn.Microbiol . Infect. Dis.74:88-90;Dortet等，（2012) Antimicrob.Agents.Qiemother.56:6437-6440)W及"double-disk synergy test"(DOST) (Arakawa等，（2000) J. Clin .Microbiol. 38:40-43)缺乏必要的特異性和靈敏度，并且耗時(shí)， 通常對(duì)于大部分細(xì)菌的準(zhǔn)確檢測(cè)要求至少24-48小時(shí)，但對(duì)于具有慢生長(zhǎng)率的那些細(xì)菌要 求數(shù)天。
[0011] 基于 PCR 的方法（Poirel 等，（2011 )Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 70:119-125; Avlami等，（2010)J.Microbiol.Methods.83:185-187;Chen等，（2011) J.Clin.Microbiol.49:579-585)及質(zhì)譜（Burckhardt&Zi mm e;rmann(2011) J.Clin.Microbiol.49:3321-3324;Hrabak等，（2011)J.Clin.Microbiol.49:3327-3332)具 有高的準(zhǔn)確度和靈敏度，但與高成本、沉重儀器要求的缺點(diǎn)相關(guān)，且不能檢測(cè)新進(jìn)化的碳青 霉締酶基因。最近，由Nordmann開發(fā)的Carba-NP測(cè)試（CNP ) (Nordmann等，（201 2 ) 血erg.Infect.Dis.18:1503-1507;Dortet等，（2012)J.Clin.Microbiol.50:3773-3776; Dortet等，（2012)Antimicrob.Agents Qiemother.56:6437-6440)具有高特異性，但它僅可 適用于細(xì)菌裂解物。
[0012] 相比之下，基于巧光的生物分析測(cè)定提供了高靈敏度、易于使用、快速檢測(cè)、低成 本，且在分析之前很少需要或不需要生物樣品處理。許多能夠W高靈敏度檢測(cè)e-內(nèi)酷胺酶 活性的巧光探針已被開發(fā)(Gao等，（2003) J.Am.Chem. Soc. 125:11146-11147 ;Zlokarnic等， (1998) Science 279 :86-88 ;Xing等，（2005) J. Am.畑 em.Soc. 127: 4158-4159; Kong 等， (2010)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 419:9-16;Xie等，（2012)Nat.Chem.4:802-809;Wa化nabe 等，（2010) Biocon jugate 化 em. 21: 2320-2326; Zhang 等，（2012)Angew.化 em. Int. 51 版： 1865-1868;化ng等，（2007) J. Am. Chem. Soc. 129:266-267)。然而，運(yùn)些探針的大部分缺乏對(duì) 碳青霉締酶的特異性。僅當(dāng)與某些抑制劑組合時(shí)，一些探針已被用于檢測(cè)碳青霉締酶 (Zhang等，（2012)Angew.Chem. Int. 51版：1865-1868)。因此，幾乎沒有巧光探針可用于特異 性檢測(cè)碳青霉締酶。本公開內(nèi)容提供了一系列具有適合于細(xì)菌中mL的特異性檢測(cè)的6,7- 反式構(gòu)型的、基于頭抱菌素的巧光探針。
[001引概述
[0014] 本公開內(nèi)容包括了對(duì)金屬-0-內(nèi)酷胺酶，特別地碳青霉締酶的選擇性檢測(cè)有用，從 而區(qū)分耐受碳青霉締類的細(xì)菌的那些物種與是敏感的細(xì)菌菌株的探針的實(shí)施方案。基于頭 抱菌素的具有6,7R，財(cái)勾型的探針容易被0-內(nèi)酷胺酶裂解，但不能區(qū)分被金屬-0-內(nèi)酷胺酶 和其他e-內(nèi)酷胺酶的裂解。e-內(nèi)酷胺環(huán)的6,7位置的由R，財(cái)勾型至S，R的修飾允許頭抱菌素 可被金屬-e-內(nèi)酷胺酶，即，碳青霉締酶裂解，但基本上不可被其他內(nèi)酷胺酶裂解。另外，通 過修飾頭抱菌素的側(cè)基，選擇性可被引入，其允許探針區(qū)分多種類型的金屬-e-內(nèi)酷胺酶， 并因此更狹窄地定義細(xì)菌的菌株W及產(chǎn)生的金屬-e-碳青霉締酶的類型。
[0015] 因此，本公開內(nèi)容的一個(gè)方面包括了包含可被金屬-0-內(nèi)酷胺酶選擇性裂解的探 針的組合物的實(shí)施方案，所述探針包含具有6,7-反式構(gòu)型的頭抱菌素和附連至其的可檢測(cè) 的標(biāo)記物。在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針可具有式I或式II:
[0016；
[0017]其中，Ri可選自由W下組成的組:烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基 團(tuán)、巧光團(tuán)及巧光巧滅劑。
[001引在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，Ri可選自由W下組成的組：甲基、乙 基、異丙基、叔下基、芐基-及甲苯橫酷氧基-(tosylo巧-)。
[0019] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是(2-氧代-2護(hù)色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有結(jié)構(gòu)：
[0020]
[0021]在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針可選自由W下組成的組：
[0023]
[0024] 本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面包括了選擇性檢測(cè)金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的方法的實(shí)施 方案，所述方法包括使懷疑具有金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的樣品與包含可被金屬-e-內(nèi)酷胺酶 選擇性裂解的探針的組合物接觸，所述探針包含具有6,7反式構(gòu)型的頭抱菌素部分和可檢 測(cè)的標(biāo)記物;允許金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性裂解頭抱菌素部分的有效時(shí)間段，從而從該頭抱菌 素部分釋放可檢測(cè)的標(biāo)記物，藉此生成可檢測(cè)的信號(hào);并且檢測(cè)該信號(hào)，其中可檢測(cè)的信號(hào) 指示該樣品包含金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性或金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的來源。
[0025] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針具有式I或式II:
[0026]
[0027]其中，Ri選自由W下組成的組：烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基 團(tuán)、巧光團(tuán)及巧光巧滅劑。在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，Ri選自由W下組成的 組：甲基、乙基、異丙基、叔下基、芐基-及甲苯橫酷氧基-。
[00%]在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是(2-氧代-2護(hù)色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有結(jié)構(gòu)：
[0029；
[0030；
[0031；
[003；
[0034] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物可W是蛋光素酶底 物，并且所述方法還可包括使反應(yīng)混合物與蛋光素酶接觸，從而在釋放的蛋光素酶底物的 存在下生成可檢測(cè)的生物發(fā)光信號(hào)。
[0035] 附圖簡(jiǎn)述
[0036] 本公開內(nèi)容的各方面在回顧附圖后將更容易被理解。附圖在下面說明書和實(shí)施例 中被更詳細(xì)地描述。
[0037] 圖1A示出了對(duì)于本公開內(nèi)容的巧光探針的實(shí)施方案的設(shè)計(jì)原理。
[0038] 圖1B示出了對(duì)于祀向碳青霉締酶的巧光探針的設(shè)計(jì)原理及其一般結(jié)構(gòu)。在運(yùn)些實(shí) 施方案中，巧光團(tuán)通過-0-被連接至頭抱菌素部分，但此類連接還可W是，例如，-N-或-S-。
[0039] 圖2A-2F是一系列說明本公開內(nèi)容的探針的0-內(nèi)酷胺酶選擇性的圖。指示量的0- 內(nèi)酷胺酶在與探針（10山0在室溫在25化的lx PBS緩沖液(抑=7.4)中解育化之后的相對(duì)巧 光。
[0040] 圖2A:探針CDC-1;圖2B: (S)-CC-l;圖2C: (S)-CC-3;圖2D: (S)-CC-4;圖沈：（S)-CC- 5;W及圖2F:(s)-CC-6。相對(duì)巧光代表與和不與0-內(nèi)酷胺酶解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用 在363nm處激發(fā)和在454nm處發(fā)射(頻帶寬度=5/7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是± SD。
[0041 ]圖3A-3F是一系列說明表達(dá)0-內(nèi)酷胺酶的細(xì)菌在與CRE-特異性探針（10山0在室溫 在1X PBS緩沖液(pH=7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光的圖。
[0042] 圖 3A:探針CDC-1;圖 3B: (S) -CC-1;圖 3C: (S) -CC-3;圖 3D: (S) -CC-4;圖 3E: (S) -CC- 5;W及圖3F:(s)-CC-6。在每個(gè)圖中從左至右:具有IMP-1的大腸桿菌化.coliKlMPl-大腸 桿菌）、具有VIM-27的肺炎克雷伯桿菌化.pneumoniae) (VIM27-KP)、具有NDM-1的大腸桿菌 (NDM1-大腸桿菌）、具有KPC-3的肺炎克雷伯桿菌化PC3-KP)、具有CTX-M的肺炎克雷伯桿菌 (CTX-Kp)、具有細(xì)V-18的肺炎克雷伯桿菌（SHV18-KP)、具有TEM-lBla的大腸桿菌(TEM1-大 腸桿菌）、具有AmpC的大腸桿菌(AmpC-大腸桿菌、用BlaC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(BlaC-大腸桿菌）、 具有0XA-48的肺炎克雷伯桿菌(0XA48-KP)、具有IMI的大腸桿菌（IMI-大腸桿菌）。除了表達(dá) AmpC的大腸桿菌W外，所有細(xì)菌數(shù)目為如所示的，在表達(dá)AmpC的大腸桿菌中代替使用 107c.f.u.。相對(duì)巧光代表與和不與(6-內(nèi)酷胺酶解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用在363nm處 激發(fā)和在454nm處發(fā)射(頻帶寬度=5/7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是± SD。
[0043] 圖4示意性地示出了本公開內(nèi)容的祀向碳青霉締酶的巧光探針的合成。（a)化N02、 2N 此504、0〔1，01：，比。化）1?0山口-130山0〔1、0°(：至室溫^.1.)過夜。山）1):化1、丙酬^.1， 化；ii).7-?基香豆素、K2C03、CH3CN，r.t.，2.5h。（d)1.0當(dāng)量（eqv.)m-CPBA、DCM，0°C，0.5h。 (e)Nal、TFAA、丙酬，0°C，lh。（f)DCM:TFA: TIPS:出0 = 65:30:2.5:2.5，30min，(TC。
[0044] 圖5示出了一系列說明探針（s)-CC-2的(6-內(nèi)酷胺酶選擇性的數(shù)字圖像。指示量的 e-內(nèi)酷胺酶在與探針（10y^O在r.t在25化 lx ?85緩沖液(抑=7.4)中解育化之后的相對(duì)巧 光。在每個(gè)圖中從左至右內(nèi)酷胺酶是:VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC。相對(duì)巧光 代表與和不與e-內(nèi)酷胺酶解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用在363nm處激發(fā)和在454nm處發(fā)射 (頻帶寬度= 5/7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是±SD。
[0045] 圖6示出了重組(6-內(nèi)酷胺酶的成像。PBS(1X，抑=7.4)中指示的探針（10^1)在室 溫與多種0-內(nèi)酷胺酶(4nM)解育化。圖用紫外光(360nm)激發(fā)來獲得。
[0046] 圖 7A-13F示出 了一系列探針與內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC的巧光激活的時(shí)間過程的圖形表示。誤差棒是±SD。實(shí)屯、圓，空白；正方形，200飛摩爾 (fmoles)，2化l;S角形，20飛摩爾，2扣l;倒S角形，5飛摩爾，2扣l;菱形，l飛摩爾，2扣l。x 軸，分鐘。
[0047] 圖 7A-7F:CDC-1 分別與內(nèi)酷胺酶 VIM-27、IMP-l、NDM-l、KPC-3、TEM-l和BlaC的巧光 激活的時(shí)間過程。
[004引 圖8A-8F: (S)-CC-l分別與內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的 巧光激活的時(shí)間過程。
[0049]圖9A-9F: (S)-CC-2分別與內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的 巧光激活的時(shí)間過程。
[0化0]圖 10A-10F: (S)-CC-3分別與內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC 的巧光激活的時(shí)間過程。
[0化1 ]圖 11A-11F: (S)-CC-4分別與內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC 的巧光激活的時(shí)間過程。
[0化2]圖 12A-12F:(s)-CC-5 分別與內(nèi)酷胺酶 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光激活的時(shí)間過程。
[0化3]圖 13A-13F:(s)-CC-6 分別與內(nèi)酷胺酶 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光激活的時(shí)間過程。
[0054] 圖14A-14G示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的探針在緩沖液中的自發(fā)水解。
[0055] 圖14A是說明本公開內(nèi)容的探針在PBS緩沖液中的自發(fā)水解W釋放傘形酬并從而 生成巧光信號(hào)的圖解。[引0 = 20yM:探針的初始濃度，[門：形成的傘形酬的濃度（水解產(chǎn) 物)。
[0056] 圖14B-14G示出了水解產(chǎn)物的百分比的時(shí)間過程的一系列圖形表示。誤差棒指示 =次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0057] 圖15是說明典型SDS-PAGE分析的數(shù)字圖像，顯示表達(dá)的重組酶的制品的純度。純 化的VIM-27(29.化化)被示為代表性實(shí)例。其他酶的分子量也是約30KDa(BlaC，29.5腳a; TEM-1，32.4邸a;NDM-1，29.5邸a;KPC-3，32.3邸a; IMP-1，28.2邸a)，且它們顯示與 WVIM-27 的純度和產(chǎn)量相當(dāng)?shù)募兌群彤a(chǎn)量。M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)之前的裂解物；2,誘導(dǎo)之后的裂解 物;3，細(xì)胞裂解之后的可溶性級(jí)分;4，Ni-NTA結(jié)合之后的流通物(f low-t虹ough); 5，洗涂1; 6，洗涂2; 7，洗涂5; 8，通過在PBS中的250mM咪挫洗脫的;9，通過PD-10柱純化的酶。
[0058] 圖16示出了用作用于生成編碼W下的表達(dá)載體的模板的核酸序列:重組0-內(nèi)酷胺 酶VIM-27(GenBank登錄號(hào)HQ858608.1 KSEQ ID NO.:l)、IMP-l(GenBank登錄號(hào) KC200566.1)(沈QIDN0.:2)、NDM-l(GenBank登錄號(hào)AF059836.1)(沈QIDN0.:3)、KPC-3 (GenBank登錄號(hào)NC_019155.1)(SEQIDN0.:4)、0xa-48(沈QIDN0.:5)和TEM-l(GenBank 登錄號(hào)KC493654.1KSEQ ID顯.：6)。對(duì)于酶的相應(yīng)氨基酸序列的66礎(chǔ)曰扯登錄號(hào)在括號(hào) 中。在圖中，用于PCR擴(kuò)增步驟的引物序列（如表2中所示)在插入進(jìn)表達(dá)載體之前的位置W 黑體和下劃線來指示。
[0059 ]圖 17示出 了探針（S) -CC-1、（ S) -CC-2、（ S) -CC-3、（ S) -CC-4、（ S) -CC-5、（ S) -CC-6和 (s)-CC-7 的式。
[0060] 圖18示出了用于祀向碳青霉締酶的巧光探針（s)-CC-7的合成的方案。（a)化N02、 2N 出504、0〔1，01：，比?；?-8110山9-130山0〔1，0°(：至'.1，過夜。（。）（1):船1、丙酬^.1，化； ii).7-?基香豆素、K2C03、C曲CN，r.t.，2.5h。（d)1.0當(dāng)量m-CPBA、DCM，0°C，0.5h。（e)DCM: TFA: TIPS:出0 = 65:30:2.5:2.5，30min，0°C。
[0061] 圖19A和19B是說明探針（s)-CC-7的重組(6-內(nèi)酷胺酶選擇性和CRE特異性的圖。指 示量的e-內(nèi)酷胺酶（圖19A)和表達(dá)0-內(nèi)酷胺酶的細(xì)菌（圖19B)在與探針（10咖)在室溫在25ii L lx PBS緩沖液(pH = 7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光。圖19A，左至右在每個(gè)濃度的：VIM、 IMP、NDM、KPC、TEM-1、BlaC。圖19B，左至右:具有IMP-1的大腸桿菌、具有VIM-27的肺炎克雷 伯桿菌、具有NDM-1的大腸桿菌、具有KPC-3的肺炎克雷伯桿菌、具有CTX-M的肺炎克雷伯桿 菌、具有SHV-18的肺炎克雷伯桿菌、具有TEM-lBla的大腸桿菌、具有AmpC的大腸桿菌、用 BlaC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌、具有0XA-48的肺炎克雷伯桿菌、具有IMI的大腸桿菌。除了使用 107c.f.u的表達(dá)AmpC的大腸桿菌W外，所有細(xì)菌數(shù)目為如所示的。相對(duì)巧光代表與和不與 e-內(nèi)酷胺酶/解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用在363nm處激發(fā)和在454nm處發(fā)射(頻帶寬度= 5/7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是± SD。
[0062] 圖2〇是重組0-內(nèi)酷胺酶(411]\〇與（3)-〇：-7(1〇咖)在室溫在1義口85(抑=7.4)中解 育化的數(shù)字圖像。圖用紫外光(360nm)激發(fā)來生成。
[0063] 圖 21A-21F 是說明指示的探針與 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光 激活的時(shí)間過程的圖。誤差棒是±SD。
[0064] 圖22示出了用于祀向碳青霉締酶的產(chǎn)生生物發(fā)光探針(bioluminogenic probes) (s) -a-3和（s) -a-6的合成的方案。
[0065] 圖23是說明探針（s)-a-3的(6-內(nèi)酷胺酶選擇性的圖。指示量的(6-內(nèi)酷胺酶在與探 針（化M)在室溫在25化的lx PBS緩沖液(抑=7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光。相對(duì)巧光代表 與和不與0-內(nèi)酷胺酶解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用在350nm處激發(fā)(頻帶寬度= 5nm)和在 550nm處發(fā)射(頻帶寬度= 7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是±SD。
[0066] 圖24是說明探針（s)-CL-6的(6-內(nèi)酷胺酶選擇性的圖。指示的量的(6-內(nèi)酷胺酶在與 探針（化^0在室溫在25化的lx ?85緩沖液(抑=7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光。相對(duì)巧光代 表與和不與e-內(nèi)酷胺酶解育的巧光強(qiáng)度的差異。巧光用在350nm處激發(fā)(頻帶寬度= 5nm)和 在550nm處發(fā)射(頻帶寬度= 7.5nm)來測(cè)量。誤差棒是±SD。
[0067] 圖25是說明表達(dá)(6-內(nèi)酷胺酶的細(xì)菌裂解物在與探針（S)-化-3(liiM)在室溫在lx P B S緩沖液（P H = 7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光的圖。除了表達(dá)A m P C的大腸桿菌是在 107c.f.u. W外，所有細(xì)菌數(shù)目為如所示的。相對(duì)巧光代表與和不與0-內(nèi)酷胺酶解育的巧光 強(qiáng)度的差異。巧光用在350nm處激發(fā)(頻帶寬度= 5nm)和在550nm處發(fā)射(頻帶寬度= 7.5nm) 來測(cè)量。誤差棒是±SD。
[0068] 圖26是說明表達(dá)(6-內(nèi)酷胺酶的細(xì)菌裂解物在與探針（s)-化-6(liiM)在室溫在lx P B S緩沖液（P H = 7.4)中解育化之后的相對(duì)巧光的圖。除了表達(dá)A m P C的大腸桿菌是在 107c.f.u. W外，所有細(xì)菌數(shù)目為如所示的。相對(duì)巧光代表與和不與0-內(nèi)酷胺酶解育的巧光 強(qiáng)度的差異。巧光用在350nm處激發(fā)(頻帶寬度= 5nm)和在550nm處發(fā)射(頻帶寬度= 7.5nm) 來測(cè)量。誤差棒是±SD。
[0069] 圖27是說明生物發(fā)光發(fā)射對(duì)不同量的純化的NDM-1 +在liiM的化UC. (S)-化-6 ]的依 賴性的圖。
[0070] 圖28是說明生物發(fā)光發(fā)射對(duì)不同濃度的NDM-1裂解物+在1測(cè)的化UC. (S)-化-6]的 依賴性的圖。
[0071] 圖29示出了（S)-化-6的0-內(nèi)酷胺酶選擇性。400飛摩爾0-內(nèi)酷胺酶在與探針（1山〇 在室溫在1(K)化的lx PBS緩沖液(pH=7.4)中解育化隨后添加50ng化UC之后的相對(duì)發(fā)光。 相對(duì)發(fā)光代表與和不與e-內(nèi)酷胺酶解育的發(fā)光強(qiáng)度的差異。發(fā)光用IVIS 200來測(cè)量。誤差 棒是±SD。
[0072] 圖30示出了（S)-化-6的(6-內(nèi)酷胺酶選擇性。2x 105c.f.u的表達(dá)(6-內(nèi)酷胺酶的細(xì) 菌裂解物在與探針（1山0在室溫在1(K)化的lx PBS緩沖液(抑=7.4)中解育化隨后添加 50ng fLuc之后的相對(duì)發(fā)光。相對(duì)發(fā)光代表與和不與表達(dá)(6-內(nèi)酷胺酶的細(xì)菌裂解物解育的發(fā)光強(qiáng) 度的差異。圖通過IVIS來采集。誤差棒是±SD。
[007引詳述
[0074] 在更詳細(xì)的描述本公開內(nèi)容之前，要理解，該公開內(nèi)容并不局限于描述的特定實(shí) 施方案，并且當(dāng)然照此可變化。還要理解，本文使用的術(shù)語僅為了描述特定實(shí)施方案的目 的，且并非旨在限制，因?yàn)楸竟_內(nèi)容的范圍將僅被所附的權(quán)利要求書限制。
[0075] 在提供值的范圍的情況下，應(yīng)理解，該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值，至下 限的單位的十分之一，除非上下文另外清楚地規(guī)定，和在該陳述的范圍中的任何其他陳述 的或中間的值被包括在本公開內(nèi)容內(nèi)。運(yùn)些較小的范圍的上限和下限可獨(dú)立地被包括于所 述較小的范圍，并且還被包括于本公開內(nèi)容內(nèi)，隸屬于陳述的范圍的任何特定的排除性限 審IJ。在陳述的范圍包括上限和下限之一或兩者的情況下，排除運(yùn)些包括的限值中的任一個(gè) 或兩者的范圍也被包括在本公開內(nèi)容中。
[0076] 除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與由本公開內(nèi)容屬 于的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然在本公開內(nèi)容的實(shí)踐或測(cè)試中還可 W使用與本文描述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方 法和材料。
[0077] 在本說明書中引用的所有出版物及專利均通過引用并入本文，其程度如同每一單 獨(dú)出版物或?qū)＠痪唧w地和單獨(dú)地指明通過引用并入本文，并且在本說明書中引用的所有 出版物及專利均通過引用并入本文W公開和描述與被引用的出版物有關(guān)的方法和/或材 料。任何出版物的引用是為了其在提交日之前的公開內(nèi)容，并且不應(yīng)被解釋為承認(rèn)，本發(fā)明 由于之前的公開內(nèi)容而無權(quán)先于此類出版物。
[0078] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀該公開內(nèi)容之后將清楚的，本文描述并例證的個(gè)體實(shí)施方 案中的每個(gè)具有離散的組成部分和特征，其可容易地與其它若干實(shí)施方案中的任一個(gè)的特 征分開或組合，而不偏離本公開內(nèi)容的范圍或精神。任何所提及的方法可事件提及的 順序或w邏輯上可能的任何其他順序來進(jìn)行。
[0079] 除非另有指示，否則本公開內(nèi)容的實(shí)施方案將使用醫(yī)學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分 子生物學(xué)、藥物學(xué)等的技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分地解釋。
[0080] 必須注意，如在說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個(gè)(a)"、" 一個(gè) (an)"和"該（the)"包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如提及"支撐 物(a 8啡9〇的)"包括多個(gè)支撐物。在該說明書中W及在之后的權(quán)利要求書中，將提及許多 術(shù)語，其將被定義為具有W下含義，除非相反的意向是明顯的。
[0081] 如本文使用的，W下術(shù)語具有歸于它們的含義，除非另有說明。在本公開內(nèi)容中， "包括(comprises)"、"包括(comprising)"、"包含(containing)"和"具有化aving)"等可具 有在美國專利法中賦予它們的含義，且可意指"包括（includes)"、"包括（including)"等； "基本上由......組成"或"基本上包括"等，當(dāng)應(yīng)用于被本公開內(nèi)容包括的方法和組合物 時(shí)，指像本文公開的那些的組合物，但其可包含另外的結(jié)構(gòu)基團(tuán)、組合物組分或方法步驟 (或其類似物或衍生物，如W上討論的）。然而，與本文公開的相應(yīng)組合物或方法的那些比 較，運(yùn)樣的另外的結(jié)構(gòu)基團(tuán)、組合物組分或方法步驟等，實(shí)質(zhì)上不影響組合物或方法的基本 和新穎特征。
[0082] 在描述多個(gè)實(shí)施方案之前，提供了 W下定義并且應(yīng)該被使用，除非另有指示。
[0083] 縮寫
[0084] TFAA，S氣乙酸酢;MLB，金屬-0-內(nèi)酷胺酶;CRE，耐受碳青霉締類的腸桿菌科;PBS， 憐酸鹽緩沖鹽水;TsOH，甲苯橫酸(PTSA或pTsOH)或?qū)妆綑M酸;CPBA，氯過氧苯甲酸;DCM， 二氯甲燒;TFA，S氣乙酸;TIPS，SDS，十二烷基硫酸鋼;r. t，室溫。
[0085] 定義
[0086] 在描述和要求保護(hù)公開的主題時(shí)，W下術(shù)語將根據(jù)W下陳述的定義被使用。
[0087] 如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"酷基"，意指與選自W下的基鍵合的幾基或硫代幾 基基團(tuán)：例如，任選地被取代的，氨化化ydrido)、烷基(例如面代烷基）、締基、烘基、烷氧基 ("酷氧基"，包括乙酷氧基、下酷氧基、異戊酷氧基、苯基乙酷氧基(pheny lacetyloxy)、苯甲 酷氧基（berizoyloxy)、對(duì)-甲氧基苯甲酯基（p-methoxybenzoyloxy) W及被取代的酷氧基 諸如烷氧基烷基和面代烷氧基）、芳基、面素、雜環(huán)基、雜芳基、橫酷基(例如締丙基亞橫酷基 烷基）、橫酷基(例如烷基橫酷基烷基）、環(huán)烷基、環(huán)締基、硫代烷基、硫代芳基、氨基(例如燒 基氨基或二烷基氨基及芳烷氧基。"酷基"基團(tuán)的說明性實(shí)例是甲酯基、乙酷基、2-氯乙 酷基、2-漠乙酷基、苯甲酯基、=氣乙酷基、鄰苯二甲酯基、丙二酷基、煙酷基等。如本文所用 的術(shù)語"酷基"指基團(tuán)-C(0)R26,其中R26為氨、烷基、環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、芳基、芳基烷基、雜燒 基、雜芳基和雜芳烷基。實(shí)例包括，但不限于甲酯基、乙酷基、環(huán)己基幾基、環(huán)己基甲基幾基、 苯甲酯基、苯甲基幾基(beo巧1 carbonyl)等。
[0088] 如本文所用的術(shù)語"酷基氨基"指酷基-NH-基團(tuán)，其中酷基如先前描述的。
[0089] 如本文所用的術(shù)語"酷氧基"指酷基-0-基團(tuán)，其中酷基如先前描述的。
[0090] 單獨(dú)的或在其他術(shù)語諸如本文所用的"硫代烷基"和"芳基烷基"內(nèi)的術(shù)語"烷基" 意指可W是直鏈（即直鏈(linear))或支鏈的一價(jià)、飽和的控基。在本公開內(nèi)容中使用的燒 基基通常包括從約1個(gè)至20個(gè)碳原子，特別地從約1個(gè)至10個(gè)、1個(gè)至8個(gè)或1個(gè)至7個(gè)，更特別 地約1個(gè)至6個(gè)碳原子，或3個(gè)至6個(gè)。說明性烷基基包括甲基、乙基、正丙基、正下基、正戊基、 正己基、異丙基、異下基、異戊基、戊基、仲下基、叔下基、叔戊基、正庚基、正乙酷基（n- actyl)、正壬基、正癸基、十一烷基、正十二烷基、正十四烷基、十五烷基、正十六烷基、十屯 烷基、正十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十二烷基(dosyl)、正二十四烷基等、W及其支鏈 變體。在本公開內(nèi)容的某些方面，烷基基是包含W下或選自由W下組成的組的C1-C6低級(jí)燒 基：甲基、乙基、正丙基、正下基、正戊基、正己基、異丙基、異下基、異戊基、戊基三下基、仲 下基、叔下基、叔戊基和正己基。烷基基可在不顯著干擾本公開內(nèi)容的化合物的制備且不顯 著降低化合物的效力的位置處任選地被如本文定義的取代基取代。在本公開內(nèi)容的某些方 面，烷基基被一個(gè)至五個(gè)取代基取代，所述取代基包括面素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)脂肪族、被取 代的低級(jí)脂肪族、徑基、氯基、硝基、硫代、氨基、酬基、醒、醋、酷胺、被取代的氨基、簇基、橫 酷基、硫酷基、亞橫酷基、硫酸鹽、亞諷、被取代的簇基、面代的低級(jí)烷基(例如CF3)、面代的 低級(jí)烷氧基、徑基幾基、低級(jí)烷氧基幾基、低級(jí)烷基幾基氧基、低級(jí)烷基幾基氨基、脂環(huán)族 (cycloali地atic)、被取代的脂環(huán)族、或芳基（例如，苯基甲基芐基））、雜芳基（例如，化晚 基)和雜環(huán)基(例如，贓晚基、嗎嘟基）。烷基基團(tuán)上的取代基可自身被取代。
[0091] 如本文所用的術(shù)語"締基"指包含至少一個(gè)雙鍵的不飽和的、無環(huán)支鏈或直鏈控 基。締基基可包含從約2個(gè)至24個(gè)或2個(gè)至10個(gè)碳原子，特別地從約3個(gè)至8個(gè)碳原子，且更特 別地約3個(gè)至6個(gè)或2個(gè)至6個(gè)碳原子。適合的締基基包括但不限于乙締基、丙締基(例如，丙- 1- 締-1-基、丙-1-締-2-基、丙-2-締-1-基(締丙基)和丙-2-締-2-基）、下締-1-基、下-1-締- 2- 基、2-甲基-丙-1-締-1-基、下-2-締-1-基、下-2-締-2-基、下-1,3-二締-1-基、0-1,3-二 締2-3/1、己締-1-基、3-徑基乙締-基、庚締-1-基和辛締-1-基等。締基基可類似于烷基任選 地被取代。
[0092] 如本文所用的術(shù)語"烷基氨基甲酯基"指R'RN--C〇--基團(tuán)，其中R和R'的一個(gè)是氨， 且R和R'的另一個(gè)是如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
[0093] 如本文所用的術(shù)語"亞烷基"指具有從約1個(gè)至10個(gè)、1個(gè)至8個(gè)、1個(gè)至6個(gè)或2個(gè)至6 個(gè)碳原子并具有兩個(gè)或更多個(gè)共價(jià)鍵的附連點(diǎn)的直鏈或支鏈的基。此類基的實(shí)例是亞甲 基、乙締、丙締、下締、戊二締、亞己基、亞乙基、甲基亞乙基和亞異丙基。當(dāng)亞締基基作為取 代基存在于另一個(gè)基上時(shí)，它通常被認(rèn)為是單取代基，而不是由兩個(gè)取代基形成的基。
[0094] 如本文所用的術(shù)語"亞締堂'指具有從約2個(gè)至10個(gè)、2個(gè)至8個(gè)或2個(gè)至6個(gè)碳原子、 至少一個(gè)雙鍵并具有兩個(gè)或更多個(gè)共價(jià)鍵的附連點(diǎn)的直鏈或支鏈的基。亞締基基的實(shí)例包 括1,1-亞乙締基（--CH2 = C-)、1,2-亞乙締基（-CH = CH-)和1,4-了間二締基（-CH = CH-CH = CH-)〇
[OOM]如本文使用的術(shù)語"芳烷氧基幾基"指芳烷基-0--C0--基團(tuán)。示例性芳烷氧基幾基 是節(jié)氧基幾基。
[0096] 如本文所用的術(shù)語"芳烷基"指通過烷基基團(tuán)諸如芐基直接鍵合的芳基或取代的 芳基基團(tuán)。被取代的芳基基的其他具體實(shí)例包括氯芐基和氨基芐基。示例性的芳烷基包括 芐基、苯基乙基、和糞基甲基。
[0097] 如本文所用的術(shù)語"芳烷基氧基"指芳烷基-0-基團(tuán)，其中芳烷基如先前描述的。示 例性芳烷基氧基是節(jié)氧基。
[0098] 如本文所用的術(shù)語"芳酷基"指如W上定義的芳基基，附連至如本文定義的幾基 基，包括但不限于苯甲酯基和甲苯甲酯基。芳酷基基可任選地被如本文公開的基團(tuán)取代。
[0099] 如本文所用的術(shù)語"芳酷基氨基"指芳酷基-NH-基團(tuán)，其中芳酷基如先前描述的。
[0100] 如本文所用的術(shù)語"芳基"指芳族取代基，其可W是單芳族環(huán)，或者被稠合在一起、 共價(jià)連接或與共同基團(tuán)，諸如，但不限于，亞甲基或乙締基部分連接的多個(gè)芳族環(huán)。共同連 接基團(tuán)還可W是如在二苯基甲酬中的幾基，或如在二苯酸中的氧，或如二苯胺中的氮。術(shù)語 "芳基"特別包括雜環(huán)芳族化合物。芳族環(huán)可包括苯基、糞基、聯(lián)苯基、二苯酸、二苯胺和二苯 甲酬，W及其他。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語"芳基"意指包含約5個(gè)至約10個(gè)碳原子，例如，5 個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)碳原子，并包含5元和6元控和雜環(huán)芳環(huán)的環(huán)狀芳族。
[0101] 芳基基團(tuán)可任選地被一個(gè)芳基基團(tuán)取代基或更多個(gè)可W是相同的或不同的芳基 基團(tuán)取代基取代（"被取代的芳基"），其中"芳基基團(tuán)取代基"包括烷基、被取代的烷基、芳 基、被取代的芳基、芳烷基、徑基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、簇基、酷基、面素、硝基、燒 氧基幾基、芳基氧基幾基、芳烷氧基幾基、酷基氧基、酷基氨基、芳酷基氨基、氨基甲酯基、燒 基氨基甲酯基、二烷基氨基甲酯基、芳基硫基、烷基硫基、亞烷基和--NR ' R"，其中R '和R"可 W各自獨(dú)立地為氨、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基和芳烷基。
[0102] 芳基基團(tuán)可任選地被一個(gè)至四個(gè)取代基取代，所述取代基諸如烷基、被取代的燒 基、締基、被取代的締基、烘基、被取代的烘基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、面素、=氣甲氧 基、=氣甲基、徑基、烷氧基、燒酷基、燒酷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、氨基、烷基氨基、 酷基氨基、芳烷基氨基、二烷基氨基、燒酷基氨基、硫醇、烷基硫代、脈基、硝基、氯基、簇基、 簇基烷基、氨基甲酯基、烷氧基幾基、烷基硫幾基、芳基硫幾基(arylthiono)、芳基橫酷基胺 基(a巧Isulfonylamine)、次橫酸、烷基橫酷基(a化ysulfonyl)、橫酷氨基、芳基氧基等。取 代基可被徑基、面素、烷基、烷氧基、締基、烘基、芳基或芳烷基進(jìn)一步取代。在本公開內(nèi)容的 方面，芳基基被徑基、烷基、幾基、簇基、硫醇、氨基和/或面素取代。
[0103] 芳基基團(tuán)的具體實(shí)例包括，但不限于，環(huán)戊二締基、苯基、巧喃、嚷吩、化咯、化喃、 化晚、咪挫、苯并咪挫、異嚷挫、異嗯挫、化挫、化嗦、=嗦、喀晚、哇嘟、異哇嘟、嗎I噪、巧挫等。
[0104] 如本文所用的術(shù)語"芳基氧基"指附連至氧原子的如W上定義的芳基基。示例性芳 基氧基包括糞氧基、哇嘟氧基、異哇嗦氧基（isoquir iol iz iny 1〇巧)等。
[0105] 如本文所用的術(shù)語"芳基氧基幾基"指芳基-0--C0--基團(tuán)。示例性的芳基氧基幾基 基團(tuán)包括苯氧基-幾基和糞氧基-幾基。
[0106] 如本文所用的術(shù)語"芳基氧基"指芳基基團(tuán)，其中芳基基團(tuán)如先前描述的，包 括被取代的芳基。如本文所用的術(shù)語"芳基氧基"可W指苯基氧基或己基氧基及烷基、被取 代的烷基、面素或烷氧基取代的苯基氧基或己基氧基。
[0107] 如本文所用的術(shù)語"芳基烷氧基"指被附連至烷氧基基團(tuán)的芳基基團(tuán)。芳基烷氧基 基團(tuán)的代表性實(shí)例包括，但不限于，2-苯基乙氧基、3-糞-2-基丙氧基和5-苯基戊氧基。
[0108] 如本文所用的術(shù)語"生物發(fā)光"指一種類型的化學(xué)發(fā)光，由生物分子，特別地蛋白 的光的發(fā)射。生物發(fā)光的必要條件是在加氧酶、蛋光素酶的存在下的結(jié)合或游離的分子氧， 加氧酶、蛋光素酶在分子氧的存在下對(duì)底物蛋光素起作用并將底物轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)，其在返 回至較低能級(jí)時(shí)W光的形式釋放能量。
[0109] 如本文所用的術(shù)語"碳環(huán)(carbocylic)"包括來源于飽和的或不飽和的、被取代的 或未被取代的5元至14元有機(jī)核的基，其的成環(huán)原子(除氨W外)僅是碳。碳環(huán)基的實(shí)例是環(huán) 烷基、環(huán)締基、芳基、特別是苯基、糞基、降冰片烷基（norbornanyl)、二環(huán)庚二締基 (bicycloheptadienyl)、甲苯酷基、二甲苯基（xylenyl)、巧基、均二苯代乙締基 (stilbenzyl)、S聯(lián)苯基、二苯基乙締基（diphenyl ethyl enyl )、苯基環(huán)己基、起締基 (acenapththylenyi)、蔥基、聯(lián)苯基、聯(lián)芐基(Wbenzylyl)和相關(guān)聯(lián)芐基同系物、八氨糞基 (octahydronaphthyl )、四氨糞基（tetrahydronaphthyl )、八氨哇嘟基 (oct址y化oquinol iny 1)、二甲氧基四氨糞基等。
[0110] 如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"氨基甲酯基"，指附連至幾基基團(tuán)中的兩個(gè)非共享 鍵之一的氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、單環(huán)烷基氨基、烷基環(huán)烷基氨基 (曰化7167〇1〇曰化71日111；[]1〇)和二環(huán)烷基氨基（(1;[07010曰化71曰又曰;[]1〇)基。
[0111] 如本文所用的術(shù)語"氨基甲酯基"指出N-C0-基團(tuán)。
[0112] 如本文所用的術(shù)語"碳青霉締類"是指一類具有廣譜抗菌活性的0-內(nèi)酷胺類抗生 素。對(duì)大部分e-內(nèi)酷胺酶高度耐受。碳青霉締類抗生素最初從碳青霉締嚷締霉素(卡特利鏈 霉菌（Streptomyces cattleya)的一種天然來源的產(chǎn)物)開發(fā)。碳青霉締類是用于許多細(xì)菌 感染，諸如大腸桿菌化.coli)和肺炎克雷伯桿菌的最后手段的抗生素之一。對(duì)碳青霉締類 抗生素的藥物耐受性在運(yùn)些大腸桿菌群中的傳播通常是由于碳青霉締酶，包括新德里金屬 e-內(nèi)酷胺酶(NDM-1)的產(chǎn)生。目前，不存在對(duì)抗耐受碳青霉締類的細(xì)菌的開發(fā)中的新抗生 素，且耐受性基因的全世界傳播被認(rèn)為是主要問題。與其他e-內(nèi)酷胺類諸如青霉素類和頭 抱菌素類相比，運(yùn)些試劑具有最廣的抗菌譜。碳青霉締類通過W高親和力結(jié)合e-內(nèi)酷胺酶 并酷化酶，使它失活來規(guī)避(circumvent)e-內(nèi)酷胺酶。除了細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌(非典型），諸如衣原 體(Chlamydiae)W外，碳青霉締類針對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌兩者，W及厭氧 菌是活性的。因此，碳青霉締類也是迄今能夠抑制L，D-轉(zhuǎn)膚酶的唯一 0-內(nèi)酷胺類。碳青霉締 類非常類似于青霉素類(青霉燒類），但結(jié)構(gòu)的位置1中的硫原子已被碳原子代替，且已被引 入不飽和。
[0113] 如本文所用的術(shù)語"碳青霉締酶"指針對(duì)氧基亞氨基頭抱菌素類、頭霉素類是活性 的，且但還針對(duì)碳青霉締類是活性的一組e-內(nèi)酷胺酶。碳青霉締酶包括諸如是質(zhì)粒介導(dǎo)的 碳青霉締酶的IMP型碳青霉締酶(金屬-0-內(nèi)酷胺酶），且可在細(xì)菌物種中被發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌物種 諸如腸的革蘭氏陰性生物體，假單胞菌屬物種（Pseudomonas spp.)和不動(dòng)桿菌屬物種 (Acinetobacter spp. ；LVIM(維羅納整合子編碼型金屬-0-內(nèi)酷胺酶)包括10個(gè)成員，其大 部分存在于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，還有惡臭假單胞菌(P.putida)中且很少存在于 腸桿菌科中。IMP和VIM兩者是整合子締合的，有時(shí)在質(zhì)粒內(nèi)。兩者水解除了單環(huán)0-內(nèi)酷胺類 W外的所有e-內(nèi)酷胺類，并避開所有e-內(nèi)酷胺抑制劑。
[0114] 0-內(nèi)酷胺酶的0XA組主要存在于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)物種中。0XA碳青霉 締酶在體外非常慢地水解碳青霉締類，且對(duì)于一些不動(dòng)桿菌宿主觀察到的高M(jìn)IC(大于 64mg/L)可反映繼發(fā)性機(jī)制。0XA碳青霉締酶還趨向具有朝向青霉素類和頭抱菌素類的降低 的水解效率。KPC(肺炎克雷伯桿菌碳青霉締酶）目前是產(chǎn)生KPC的腸桿菌科的最常見的碳青 霉締酶，在美國日趨普遍。CMY從產(chǎn)氣腸桿菌化nterobacter aerogenes)的強(qiáng)毒株中分離。 它被攜帶在質(zhì)粒pYMG-1上，并因此可傳播至其他細(xì)菌菌株。NDM-1 (新德里金屬-0-內(nèi)酷胺 酶)在大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌中較為普遍。
[0115]可易受本公開內(nèi)容的內(nèi)酷胺酶影響的細(xì)菌包括革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如，但不限于， 陰溝腸桿菌化.cloacae)、弗氏巧樣酸桿菌（C.打eundii)、粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens)、 銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、奇異變形桿菌(Proteus mirabi 1 is)、腸桿菌科，包括埃希 氏桿菌屬物種化scherichia spp.)、沙口氏菌屬物種（Salmonella spp.)、流感嗜血桿菌 (H. inf luenzae)、淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)、克呂沃爾菌屬物種化luyvera spp.)、鼠傷 寒沙口氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimuri皿)等，W及革蘭氏陽性菌，諸如葡 萄球菌屬物種（Sl:a地ylococci spp.)、鏈球菌屬物種（Streptococci spp.)、鏈桿菌屬物種 (Streptobacilli spp.)、芽抱桿菌屬物種(Bacilli spp.)等。
[0116] 如本文所用的術(shù)語"幾基"指具有四個(gè)共價(jià)鍵中的兩個(gè)與氧原子共享的碳基。幾 基-如本文所用的術(shù)語"幾基"指--(c=o)--基團(tuán)。
[0117] 如本文所用的術(shù)語"甲酯胺基"是指基團(tuán)-C0NH-。簇基-如本文所用的術(shù)語"簇基" 指一C00H基團(tuán)。
[011引如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"簇基"，指-C(0)0R25-或-C(-0)0R25,其中R25為可任 選地被取代的氨、烷基、締基、烘基、環(huán)烷基、環(huán)締基、氨基、硫醇、芳基、雜芳基、硫代烷基、硫 代芳基、硫代烷氧基、雜芳基或雜環(huán)。在本公開內(nèi)容的方面，簇基基團(tuán)呈醋化形式，并可包含 作為醋化基團(tuán)的低級(jí)烷基基團(tuán)。在本公開內(nèi)容的特定方面，-C(0)0R25提供了醋或氨基酸衍 生物。醋化形式在本文中也特別稱為"簇酸醋"。在本公開內(nèi)容的方面，"簇基"可被取代，特 別地被締丙基取代，其任選地被氨基、胺、面素、烷基氨基、芳基、簇基或雜環(huán)中的一個(gè)或多 個(gè)取代。簇基基團(tuán)的實(shí)例是甲氧基幾基、下氧基幾基，叔燒氧幾基（tert. alkoxycarbony 1) 諸如叔下氧基幾基（tert. butoxycarbon^)、具有一個(gè)或兩個(gè)芳基基的芳基甲氧基幾基，包 括但不限于任選被例如低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、徑基、面素和/或硝基取代的苯基，諸如節(jié)氧 基幾基、甲氧基芐基幾基、二苯基甲氧基幾基、2-漠代乙氧幾基（2-b;romoetho巧carbon}^)、 2-艦代乙氧幾基叔下基幾基（2-;[0(10日1:110巧。日1'130]1711日1'1:.1311171。日1'13〇1'171)、4-硝基節(jié)氧 幾基、二苯基甲氧基幾基、芐基徑基幾基(benzhydro巧carbon^)、二-(4-甲氧基苯基-甲氧 基幾基、2-漠代乙氧基幾基、2-艦代乙氧基幾基、2-S甲基甲娃烷基乙氧基幾基、或2-S苯 基甲娃烷基乙氧基幾基。W醋化形式的另外的簇基基團(tuán)是甲娃烷基氧基幾基基團(tuán)，包括有 機(jī)甲娃烷基氧基幾基。此類化合物中的娃取代基可被低級(jí)烷基(例如甲基）、烷氧基(例如甲 氧基)和/或面素 (例如氯)取代。娃取代基的實(shí)例包括S甲基甲娃烷基(trimethylsilyi)和 二甲基叔下基甲娃烷基(dimethyltert.butylsil}^)。在本公開內(nèi)容的方面，簇基基團(tuán)可W 是烷氧基幾基，特別是甲氧基幾基、乙氧基幾基、異丙氧基幾基、叔下氧基幾基、叔戊氧基幾 基、sir庚氧基幾基(sir h巧tyloxy carbonyl),特別是甲氧基幾基或乙氧基幾基。
[0119] 如本文所用的術(shù)語"頭抱菌素"指其中e-內(nèi)酷胺環(huán)被稠合至6元二氨嚷嗦環(huán)，由此 形成頭抱締核的e-內(nèi)酷胺化合物。對(duì)頭抱締核的側(cè)鏈修飾可賦予抗菌活性的改進(jìn)的譜、藥 代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)W及另外的副作用。基于它們的活性譜，頭抱菌素類大致可分為四代。
[0120] 如本文所用的術(shù)語"環(huán)的"和"環(huán)烷基"指約3個(gè)至約10個(gè)碳原子，例如，3個(gè)、4個(gè)、5 個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè)碳原子的非芳族單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)。環(huán)烷基基團(tuán)可任選地是部 分不飽和的。環(huán)烷基基團(tuán)還可任選地被如本文定義的烷基基團(tuán)取代基、氧代和/或亞烷基取 代?？裳刂h(huán)烷基鏈任選地插入一個(gè)或更多個(gè)氧、硫、或被取代或未被取代的氮原子，其中 氮取代基是氨、烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基，由此提供雜環(huán)基團(tuán)。代表性的單 環(huán)環(huán)烷基環(huán)包括環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。多環(huán)環(huán)烷基環(huán)包括金剛烷基、八氨糞基、十氨糞 基、精腦烷基、茨締烷基和正金剛烷基。
[0121] 如本文所用的術(shù)語"脂環(huán)族"指具有少于8個(gè)碳原子或者由不超過=個(gè)稠合的脂環(huán) 族環(huán)組成的稠合環(huán)系統(tǒng)的環(huán)燒控。此類基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于十氨糞基等。
[0122] 如本文所用的術(shù)語"環(huán)締基"指包含約4個(gè)至16個(gè)、2個(gè)至15個(gè)、2個(gè)至10個(gè)、2個(gè)至8 個(gè)、4個(gè)至10個(gè)、3個(gè)至8個(gè)、3個(gè)至7個(gè)、3個(gè)至6個(gè)或4個(gè)至6個(gè)碳原子、一個(gè)或更多個(gè)碳-碳雙 鍵、W及的一個(gè)、兩個(gè)、=個(gè)或四個(gè)環(huán)的基，其中此類環(huán)可懸垂的方式被附連或可被稠 合。在本公開內(nèi)容的某些方面，環(huán)締基基是具有=個(gè)至屯個(gè)碳原子的"低級(jí)環(huán)締基"基。環(huán)締 基基的實(shí)例包括但不限于環(huán)下締基，環(huán)戊締基、環(huán)己締基和環(huán)庚締基。環(huán)締基基可任選地被 如本文公開的基團(tuán)，特別地可W是相同的或不同的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)取代基取代。
[0123] 如本文所用的術(shù)語"環(huán)烷氧基"指附連至氧基基的環(huán)烷基基(特別是，具有3個(gè)至15 個(gè)、3個(gè)至8個(gè)或3個(gè)至6個(gè)碳原子的環(huán)烷基基）。環(huán)烷氧基的實(shí)例包括環(huán)己氧基和環(huán)戊氧基。 環(huán)烷氧基基可任選地被如本文公開的基團(tuán)取代。
[0124] 如本文所用的術(shù)語"環(huán)烷基"指具有約3個(gè)至15個(gè)、3個(gè)至10個(gè)、3個(gè)至8個(gè)或3個(gè)至6 個(gè)碳原子并包含一個(gè)、兩個(gè)、=個(gè)或四個(gè)環(huán)的基，其中此類環(huán)可懸垂的方式被附連或可 被稠合。在本公開內(nèi)容的方面，"環(huán)烷基"指包含1個(gè)至2個(gè)環(huán)及每環(huán)3個(gè)至7個(gè)碳原子的任選 地被取代的、飽和的控環(huán)系統(tǒng)，其可與不飽和的C3-C7碳環(huán)進(jìn)一步稠合。環(huán)烷基基團(tuán)的實(shí)例 包括單環(huán)結(jié)構(gòu)諸如環(huán)丙基、環(huán)下基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、環(huán)十 二烷基等，或者多環(huán)結(jié)構(gòu)諸如金剛烷基等。在本公開內(nèi)容的某些方面，環(huán)烷基基是具有從約 3個(gè)至10個(gè)、3個(gè)至8個(gè)、3個(gè)至6個(gè)或3個(gè)至4個(gè)碳原子的"低級(jí)環(huán)烷基"基，特別是環(huán)丙基、環(huán)下 基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。術(shù)語"環(huán)烷基"還包括其中環(huán)烷基基與芳基基或雜環(huán)基基稠合 的基。環(huán)烷基基可任選地被如本文公開的基團(tuán)取代。
[0125] 如本文所用的術(shù)語"可檢測(cè)的部分"指本領(lǐng)域中已知的多種標(biāo)記部分。所述部分可 W是，例如，放射性標(biāo)記物(例如，化、1251、355、14(：、畔，等）、可檢測(cè)的酶(例如，辣根過氧化物 酶化RP)、堿性憐酸酶等）、染料、比色標(biāo)記物諸如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙 締、聚丙締、膠乳等）、珠或能夠生成可檢測(cè)信號(hào)諸如比色、巧光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光 化CL)信號(hào)的任何其他部分。因此，"可檢測(cè)的部分"與"標(biāo)記物分子"同義地使用。本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的作為對(duì)檢測(cè)有用的標(biāo)記物分子包括化學(xué)發(fā)光分子或巧光分子。適合于用來標(biāo) 記用于本公開內(nèi)容的方法的核酸的多種巧光分子是本領(lǐng)域已知的。用于此類滲入的方案可 取決于使用的巧光分子而變化。對(duì)于各自的巧光分子，此類方案是本領(lǐng)域已知的。
[0126] 在本公開內(nèi)容的探針的實(shí)施方案中，預(yù)期可檢測(cè)的部分可在頭抱菌素被碳青霉締 酶的水解裂解之后從探針釋放，使得巧光染料，例如，不再被巧滅，因此，是可檢測(cè)的。進(jìn)一 步預(yù)期，可檢測(cè)的部分諸如光吸收染料或放射性標(biāo)記物可從未被裂解的探針釋放并分離， W用于指示碳青霉締酶活性的存在的定量檢測(cè)或定性檢測(cè)。
[0127] 如本文所用的術(shù)語"可檢測(cè)的標(biāo)記的"意指，化合物諸如本公開內(nèi)容的基于頭抱菌 素的探針，可包含是放射性的、或被巧光團(tuán)取代的、或被引發(fā)可被裸眼或通過儀器諸如，不 限于，閃爍計(jì)數(shù)器、色度計(jì)、紫外分光光度計(jì)等觀察到或檢測(cè)到的物理響應(yīng)或化學(xué)響應(yīng)的一 些其他分子物類取代的部分。
[0128] 光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)工具(means)可用來檢測(cè) 此類標(biāo)記物。檢測(cè)裝置和方法可包括，但不限于，光學(xué)成像、電子成像、用CCD照相機(jī)成像、集 成光學(xué)成像及質(zhì)譜。另外，與祀結(jié)合的被標(biāo)記的或未被標(biāo)記的探針的量可被定量。此類定量 可包括統(tǒng)計(jì)分析。
[0129] 如本文所用的術(shù)語"二烷基氨基"指一NRR'基團(tuán)，其中R和R'的每個(gè)獨(dú)立地為如先 前描述的烷基基團(tuán)和/或被取代的烷基基團(tuán)。示例性烷基氨基基團(tuán)包括乙基甲基氨基、二甲 基氨基及二乙基氨基。
[0130] 如本文所用的術(shù)語"二烷基氨基甲酯基"指R'RN--C〇--基團(tuán)，其中R和R'的每個(gè)獨(dú) 立地為如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
[0131] 如本文所用的術(shù)語"非對(duì)映體"指可包含一個(gè)或更多個(gè)不對(duì)稱中屯、并可產(chǎn)生對(duì)映 體、非對(duì)映體，W及可根據(jù)絕對(duì)立體化學(xué)為(R)-或(S)-被定義的其他立體異構(gòu)形式的本公 開內(nèi)容的化合物。因此，本公開內(nèi)容的化合物包括所有可能的非對(duì)映體和對(duì)映體W及它們 的外消旋和光學(xué)純形式。光學(xué)活性(R)-異構(gòu)體和(S)-異構(gòu)體可使用手性合成子或手性試劑 制備，或者使用常規(guī)技術(shù)拆分。當(dāng)本公開內(nèi)容的化合物包含幾何不對(duì)稱中屯、時(shí)，且除非另有 說明，意圖是化合物包括E和A幾何異構(gòu)體兩者。所有互變異構(gòu)形式也被包括在本公開內(nèi)容 的化合物的范圍之內(nèi)。
[0132] 如本文所用的術(shù)語"染料"指其的存在可通過它的光吸收或光發(fā)射特性來檢測(cè)的 任何報(bào)告物基團(tuán)。例如，切5是花青染料家族的反應(yīng)性水溶性巧光染料。切5是在紅色區(qū)域的 巧光（約650nm至約67化m)。它可W被合成為帶有在氮側(cè)鏈的任一或兩者上的反應(yīng)性基團(tuán)， W便它們可被化學(xué)連接至核酸或蛋白分子。標(biāo)記出于可視化和定量目的而進(jìn)行。的5在約 64化m處被最大激發(fā)，在約67化m處被最大發(fā)射，處在光譜的遠(yuǎn)紅部分中；量子產(chǎn)率是0.28。 FW = 792。用于本公開內(nèi)容的探針的適合的巧光團(tuán)（色原酬(chromes))可選自，但并不意圖 被限制為，異硫氯酸巧光素(FITC，綠色），花青染料切2、切3、切3.5、切5、切5.5切7、切7.5 (范圍從綠色至近紅外），德克薩斯紅等。用于在本公開內(nèi)容的實(shí)施方案中使用的運(yùn)些染料 的衍生物可 W是，但不限于，切染料（Amersham Bioscience)、Alexa FluorS(Molecular Probes Inc.，）、HiLYTE.RTM Fluors(AnaSpec)W及DYLITE.RTM Fluors(Pierce,Inc.)。
[0133] 如本文所用的術(shù)語"巧光"指主要在冷的主體中作為光學(xué)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)的發(fā)光，其中 光子的分子吸收觸發(fā)具有較長(zhǎng)(較低能量)波長(zhǎng)的光子的發(fā)射。吸收的和發(fā)射的光子之間的 能量差隨著分子的旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)或發(fā)熱而消失。有時(shí)吸收的光子在紫外線范圍內(nèi)，且發(fā)射的光 在可見光范圍內(nèi)，但運(yùn)取決于特定巧光團(tuán)的吸光度曲線和斯托克斯位移(Stokes shift)。
[0134] 如本文所用的術(shù)語"巧光團(tuán)"指導(dǎo)致分子是巧光的分子的組分。如本文所用的術(shù)語 "巧光團(tuán)"指其的存在可通過它的光發(fā)射特性來檢測(cè)的任何報(bào)告物基團(tuán)。它是分子中將吸收 特定波長(zhǎng)的能量并在不同（但同樣特定)波長(zhǎng)處再發(fā)射能量的官能團(tuán)。所發(fā)射的能量的量和 波長(zhǎng)取決于巧光團(tuán)和巧光團(tuán)的化學(xué)環(huán)境兩者。用于在本公開內(nèi)容的組合物中使用的巧光團(tuán) 包括，但不限于，異硫氯酸巧光素(FITC)，一種巧光素的反應(yīng)性衍生物，其是化學(xué)地附連至 其他、非巧光分子W創(chuàng)建新的巧光分子用于多種應(yīng)用的最常見的巧光團(tuán)之一。其他歷史上 常見的巧光團(tuán)是若丹明（TRITC)、香豆素和花青素的衍生物。更新代的巧光團(tuán)諸如ALEXA 化U0RS.RTM、D化IGHT化UORS.rtmW及綠色巧光的巧光團(tuán)東京綠（Tokyo Green)通常比其 他可比的激發(fā)和發(fā)射的標(biāo)準(zhǔn)染料里耐光、更明亮且較少抑敏感。
[0135] 如本文所用的術(shù)語"FRET"指分子之間的巧光共振能量轉(zhuǎn)移。在FRET方法中，一種 巧光團(tuán)能夠作為能量供體，且另一種是能量受體分子。運(yùn)些有時(shí)被分別稱為報(bào)告物分子和 巧滅劑分子。供體分子被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)，對(duì)于其，它將通常會(huì)表現(xiàn)出巧光發(fā)射波長(zhǎng)。受 體分子也在該波長(zhǎng)處被激發(fā)，使得它可通過多種距離依賴性能量轉(zhuǎn)移機(jī)制接受供體分子的 發(fā)射能量。通常，當(dāng)它們很靠近(例如，在相同或相鄰的分子上)時(shí)，受體分子接受供體分子 的發(fā)射能量。FRET技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且可容易地用來檢測(cè)本公開內(nèi)容的鐵氧化物結(jié) 合的膚。參見例如，美國專利號(hào) 5,668,648、5,707,804、5,728,528、5,853,992和5,869,255 (對(duì)于FRET染料的描述），TMer即y等，（1994)NucleicAcidRes.22:920-928，W及Wolf等， (1988)Proc.化11. Acad. Sci . USA 85:8790-8794(對(duì)于用于FRET的一般性描述和方法），其 的每個(gè)在此通過引用W其整體并入。
[0136] 如本文所用的術(shù)語"雜芳基"指完全不飽和的包含雜原子的環(huán)形芳族基，該環(huán)形芳 族基具有選自碳、氮、硫和氧的至少一個(gè)雜原子。雜芳基基可包含一個(gè)、兩個(gè)或=個(gè)環(huán)，且環(huán) 可懸垂的方式被附連或可被稠合。在本公開內(nèi)容的方面，該術(shù)語指完全不飽和的包含 雜原子的環(huán)形芳族基，該環(huán)形芳族基具有從3個(gè)至15個(gè)、3個(gè)至10個(gè)、3個(gè)至8個(gè)、5個(gè)至15個(gè)、5 個(gè)至10個(gè)或5個(gè)至8個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員選自碳、氮、硫和氧，其中至少一個(gè)環(huán)原子是雜原子。 "雜芳基"基的實(shí)例，包括但不限于，包含1個(gè)至4個(gè)氮原子的不飽和的5元至6元雜單環(huán)基團(tuán)， 特別地，化咯基、化咯嘟基、咪挫基、化挫基、2-化晚基、3-化晚基、4-化晚基、化晚基、喀晚 基、化嗦基、化嗦基、=挫基、四挫基等;包含1個(gè)至5個(gè)氮原子的不飽和的稠合雜環(huán)基團(tuán)，特 別地嗎I噪基、異嗎I噪基、中氮巧基（indolizinyl)、苯并咪挫基、哇嘟基、異哇嘟基、嗎I挫基、 哇挫嘟基、蝶晚基、哇嗦基、獻(xiàn)嗦基、糞晚基(naphthyridiny 1)、哇喔嘟基、增嘟基、菲晚基、 口丫晚基、菲咯嘟基（phenanthrolinyl)、吩嗦基(phenazinyl)和巧挫基；嚷嶺基、苯并咪挫 基、哇嘟基（quinolinyl)、異哇嘟基、苯并S挫基（beazotriazolyl)、四挫并U達(dá)嗦基 (tetrazolopyridazinyl)等;包含氧原子的不飽和的3元至6元雜單環(huán)基團(tuán)，特別地，2-巧喃 基、化喃基等;包含硫原子的不飽和的5元至6元雜單環(huán)基團(tuán)，特別地，嚷吩基、2-嚷吩基、3- 嚷吩基等;包含1個(gè)至2個(gè)氧原子和1個(gè)至3個(gè)氮原子的不飽和的5元至6元雜單環(huán)基團(tuán)，特別 地巧咱基、苯并巧咱基、嗯挫基、異嗯挫基和嗯二挫基(oxadiazolyl);包含1個(gè)至2個(gè)氧原子 和1個(gè)至3個(gè)氮原子的不飽和的稠合雜環(huán)基團(tuán)，特別地苯并嗯挫基、苯并嗯二挫基等;包含1 個(gè)至2個(gè)硫原子和1個(gè)至3個(gè)氮原子的不飽和的5元至6元雜單環(huán)基團(tuán)，例如，嚷挫基、異嚷挫、 嚷二挫基等;包含1個(gè)至2個(gè)硫原子和1個(gè)至3個(gè)氮原子的不飽和的稠合雜環(huán)基團(tuán)，諸如苯并 嚷挫基、苯并嚷二挫基(benzothiadiazolyl)等。該術(shù)語還包括其中雜環(huán)基與芳基基，特別 地二環(huán)基稠合的基，諸如苯并巧喃基、苯并嚷吩基、獻(xiàn)嗦基、色締基、咕噸基等。雜芳基基可 任選地W如本文公開的基團(tuán)，例如W烷基、氨基、面素等取代，特別地雜芳基胺。該術(shù)語可指 包含1個(gè)至4個(gè)氮原子的不飽和的5元至6元雜單環(huán)基團(tuán)，特別地化咯基、化咯嘟基、咪挫基、 化挫基、2-化晚基、3-化晚基、化晚基、喀晚基、化嗦基、化嗦基、=挫基、四挫基等。雜芳基基 可任選地W本文公開的基團(tuán)，例如W烷基、氨基、面素等取代，特別地被取代的雜芳基基是 雜芳基胺。
[0137] 如本文所用的術(shù)語"雜環(huán)基"指具有少于8個(gè)碳原子或由不超過=個(gè)的稠合環(huán)組成 的稠合環(huán)系統(tǒng)(其中該環(huán)碳原子中的至少一個(gè)被氧、氮或硫代替）的環(huán)燒控和/或芳環(huán)系統(tǒng)。 此類基團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于，嗎嘟代等。
[0138] 如本文所用的術(shù)語"雜環(huán)的"指飽和的和部分飽和的包含雜原子的環(huán)形基，該環(huán)形 基具有選自碳、氮、硫和氧的至少一個(gè)雜原子。雜環(huán)基基可包含一個(gè)、兩個(gè)或=個(gè)環(huán)，其中此 類環(huán)可懸垂的方式被附連或可被稠合。在一個(gè)方面，該術(shù)語指飽和的和部分飽和的包 含雜原子的環(huán)形基，該環(huán)形基具有從約3個(gè)至15個(gè)、3個(gè)至10個(gè)、5個(gè)至15個(gè)、5個(gè)至10個(gè)或3個(gè) 至8個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員選自碳、氮、硫和氧，其中至少一個(gè)環(huán)原子是雜原子。示例性飽和的 雜環(huán)基包括但不限于包含1個(gè)至4個(gè)氮原子的飽和的3元至6元雜單環(huán)基團(tuán)（例如化咯烷基、 咪挫烷基和贓嗦基）；包含1個(gè)至2個(gè)氧原子和1個(gè)至3個(gè)氮原子的飽和的3元至6元雜單環(huán)基 團(tuán)（例如嗎嘟基;悉尼酬基（sydnonyl)]; W及包含1個(gè)至2個(gè)硫原子和1個(gè)至3個(gè)氮原子的飽 和的3元至6元雜單環(huán)基團(tuán)[例如，嚷挫烷基）等。部分飽和的雜環(huán)基基的實(shí)例包括但不限于 二氨嚷吩基、二氨化喃基、二氨巧喃基和二氨嚷挫基。說明性雜環(huán)基團(tuán)包括但不限于氮雜環(huán) 丙烷基、氮雜環(huán)下烷基、2-化咯嘟基、3-化咯嘟基、化咯烷基、氮雜卓基(azepinyl)、l，3-二 氧環(huán)戊烷基（1，3-(110^0131171)、211化喃基、佔(zhàn)-化喃基、贓晚基、1，4-二嗯烷基（1，4- dioxanyl)、嗎嘟基、[I比挫嘟基、硫代嗎嘟基（thiomo;rpholiny 1)、1,2,3,6-四氨[I比晚基、環(huán)氧 乙烷基、氧雜環(huán)下烷基、四氨巧喃基、四氨化喃基、四氨化晚基、四氨嚷喃基、嚷嗯烷基 (thioxanyl)、二氨嗎I噪基、2H-化喃基、4H-化喃基、二嗯烷基、1,3-二氧環(huán)戊基、化挫嘟基、 二氨化喃基、二氨嚷吩基(dihydrothienyl)、二氨巧喃基、化挫烷基、咪挫嘟基、咪挫烷基、 quinuelidinyl、哇嗦基等。
[0139] 如本文所用的術(shù)語"徑基烷基"指被--OH基團(tuán)取代的烷基基團(tuán)。
[0140] 如本文所用的術(shù)語"徑基化ydroxyir或"徑基化ydroxy)"指一0H基團(tuán)。
[0141] 如本文所用的術(shù)語"銜接物"指在本公開內(nèi)容的化合物的頭抱菌素主鏈上的官能 團(tuán)（例如，胺基團(tuán)），或銜接物可包括附連至頭抱菌素的單獨(dú)的部分，分子諸如巧光團(tuán)或巧滅 劑可然后被附連至其。銜接物可包括官能團(tuán)，諸如，但不限于，胺、簇酸、徑基、硫代及其組 合。銜接物可包括化合物，諸如，但不限于，DTPA、抓TA、D0PA、EGTA、NTA及其組合。在一個(gè)實(shí) 施方案中，銜接物和馨合劑化合物是相同的，但在其他實(shí)施方案中它們可W是不同的。
[0142] 在本公開內(nèi)容的探針的有利的實(shí)施方案中，預(yù)期，標(biāo)記物諸如，但不限于，巧光團(tuán) 可通過-0-、-N-或-S-連接被附連至頭抱菌素部分。
[0143] 如本文所用的術(shù)語"低級(jí)烷基取代的面素"指包含多達(dá)并包括八個(gè)碳原子的任何 烷基鏈，其中脂肪族氨原子中的一個(gè)被面素代替。此類的實(shí)例包括但不限于氯乙基等。
[0144] 如本文所用的術(shù)語"蛋光素酶"指催化光發(fā)射反應(yīng)的加氧酶。例如，細(xì)菌蛋光素酶 催化黃素單核巧酸和脂肪族醒的氧化，該反應(yīng)產(chǎn)生光。另一類在海洋節(jié)肢動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的蛋 光素酶催化海蛋蛋光素的氧化，且另一類蛋光素酶催化銷翅目蛋光素的氧化。因此，"蛋光 素酶"指催化生物發(fā)光反應(yīng)的酶或光蛋白（photoprotein)。蛋光素酶諸如蛋火蟲和海腎 (Renilla)蛋光素酶是充當(dāng)催化并在生物發(fā)光產(chǎn)生反應(yīng)期間保持不變的酶。蛋光素酶光蛋 白，諸如被非共價(jià)鍵合至蛋光素的水母發(fā)光蛋白和噓?蛋白光蛋白，在生物發(fā)光產(chǎn)生反應(yīng)期 間被蛋光素的釋放改變。蛋光素酶是天然存在于生物體中的蛋白或其變體或突變體，諸如 通過誘變產(chǎn)生的具有一個(gè)或更多個(gè)特性，諸如熱穩(wěn)定性或抑穩(wěn)定性的變體，即不同于天然 存在的蛋白。蛋光素酶及其修飾的突變體或變體形式是熟知的。例如，提及"海腎蛋光素酶" 意指從屬海腎的成員分離的酶或從任何其他來源，諸如從另一珊瑚蟲綱(Anthozoa)獲得或 已合成制備的等效分子。
[0145] 如本文所用的術(shù)語"被可操作地連接"指元件的布置，其中如此描述的組分被配 置，W執(zhí)行其通常功能。因此，當(dāng)適當(dāng)?shù)拿复嬖跁r(shí)，被可操作地連接至編碼序列的給定的啟 動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)該編碼序列的表達(dá)。只要啟動(dòng)子起作用，W引導(dǎo)編碼序列表達(dá)，啟動(dòng)子不必與 編碼序列鄰接。因此，例如，居間非翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列可存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之 間，且啟動(dòng)子序列可仍被認(rèn)為是"被可操作地連接"至編碼序列。
[0146] 如本文所用的術(shù)語"引物"指與待擴(kuò)增或復(fù)制的DNA區(qū)段互補(bǔ)的寡核巧酸。通常引 物在PCR中被使用。引物與模板DNA雜交(或"退火"），并被聚合酶酶用作復(fù)制/擴(kuò)增過程的起 點(diǎn)。"互補(bǔ)"意指引物序列可與模板形成穩(wěn)定的氨鍵絡(luò)合物。
[0147] 如本文所用的術(shù)語"探針"指修飾的頭抱菌素，其具有6,7反式構(gòu)型并被金屬-0-內(nèi) 酷胺酶選擇性裂解，且可具有來源于醇的允許探針選擇性區(qū)分金屬-e-內(nèi)酷胺酶物類的側(cè) 基。
[0148] 如本文所用的術(shù)語"被取代的締基"包括被W下取代的締基基團(tuán)：例如，一個(gè)至= 個(gè)取代基，優(yōu)選地一個(gè)至兩個(gè)取代基，諸如烷基、烷氧基、面代烷氧基、烷基烷氧基、面代燒 氧基烷基、燒酷基、燒酷基氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、酷基、酷基氨基、酷氧基、氨基、烷基氨 基、燒酷基氨基、氨基酷基、氨基酷氧基、氯基、面素、徑基、簇基、簇基烷基、氨基甲酯基、酬 基、硫代酬基、硫醇、烷基硫代、橫酷基、橫酷氨基、硫代烷氧基、芳基、硝基等。
[0149] 如本文所用的術(shù)語"被取代的烷基"可包括被W下取代的烷基基團(tuán)：例如，一個(gè)至 五個(gè)取代基，且優(yōu)選地1個(gè)至3個(gè)取代基，諸如烷基、烷氧基、氧代、燒酷基、芳基、芳烷基、芳 基氧基、燒酷基氧基、環(huán)烷基、酷基、氨基、徑氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基氨基、芳烷基 氨基、氯基、面素、徑基、簇基、氨基甲酯基、簇基烷基、酬基、硫代酬基、硫醇、烷基硫醇、芳基 硫代、芳烷基硫代、橫酷胺、硫代烷氧基；W及硝基。
[0150] 如本文所用的術(shù)語"被取代的芳基"包括芳族環(huán)，或由不多于=個(gè)稠合環(huán)（其的至 少一個(gè)是芳族的）組成的稠合芳族環(huán)系統(tǒng)，并且其中在環(huán)碳上的氨原子中的至少一個(gè)已被 W下代替：面素、氨基、徑基、硝基、硫代、烷基、酬、醒、醋、酷胺、低級(jí)脂肪族、被取代的低級(jí) 脂肪族或環(huán)(芳基、被取代的芳基、脂環(huán)族或被取代的環(huán)脂環(huán)族）。此類的實(shí)例包括，但不限 于，徑基苯基、氯苯基烷基氨基、二烷基氨基、硫酸根，琉基等。。
[0151] 如本文所用的術(shù)語"被取代的脂環(huán)族"指擁有少于8個(gè)碳或由不多于=個(gè)稠合環(huán)組 成的稠合環(huán)系統(tǒng)的環(huán)燒控，并且其中脂肪族氨原子中的至少一個(gè)已被W下代替：面素、硝 基、硫代、氨基、徑基、酬、醒、醋、酷胺、低級(jí)脂肪族、被取代的低級(jí)脂肪族，或環(huán)(芳基、被取 代的芳基、脂環(huán)族或被取代的脂環(huán)族）。此類基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于1-氯癸基（1- chlorodecalyl)等。
[0152] 如本文所用的術(shù)語"被取代的環(huán)烷基"包括具有從1個(gè)至5個(gè)(特別地1個(gè)至3個(gè))取 代基的環(huán)烷基基團(tuán)，所述取代基包括但不限于烷基、締基、烷氧基、環(huán)烷基、被取代的環(huán)燒 基、酷基、酷氨基、酷氧基、氨基、氨基酷基、氨基酷氧基、氧基酷基氨基、氯基、面素、徑基、簇 基、簇基烷基、酬基、硫代酬基、硫醇、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、徑基 氨基、烷氧基氨基W及硝基。
[0153] 如本文所用的術(shù)語"被取代的雜環(huán)基"指擁有少于8個(gè)碳或由不多于=個(gè)稠合環(huán)組 成的稠合環(huán)系統(tǒng)的環(huán)燒控和/或芳基環(huán)系統(tǒng)，其中環(huán)碳原子中的至少一個(gè)被氧、氮或硫代 替，且其中脂肪族氨原子中的至少一個(gè)已被W下代替：面素、徑基、硫代、硝基、氨基、酬、醒、 醋、酷胺;低級(jí)脂肪族、被取代的低級(jí)脂肪族，或環(huán)(芳基、被取代的芳基、脂環(huán)族或被取代的 脂環(huán)族）。此類基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于2-氯化喃基。
[0154] 如本文單獨(dú)或與其他術(shù)語諸如烷基橫酷基或芳基橫酷基結(jié)合使用的術(shù)語"橫酷 基"指二價(jià)基-S〇2^。在本公開內(nèi)容的方面，橫酷基基團(tuán)可被連接至被取代的或未被取代的徑 基、烷基基團(tuán)、酸基團(tuán)、締基基團(tuán)、烘基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、環(huán)烷基基團(tuán)、環(huán)締基基團(tuán)、環(huán)烘基基 團(tuán)、雜環(huán)基基團(tuán)、碳水化合物、膚或膚衍生物。
[0155] 如本文所用的術(shù)語"被取代的脂肪族"指具有少于10個(gè)碳原子的烷基或燒控。術(shù)語 "被取代的脂肪族"指擁有少于10個(gè)碳的烷基或燒控，其中脂肪族氨原子中的至少一個(gè)已被 W下代替：面素、氨基、徑基、硝基、硫代、酬、醒、醋、酷胺、低級(jí)脂肪族、被取代的低級(jí)脂肪 族，或環(huán)(芳基、被取代的芳基、脂環(huán)族或被取代的脂環(huán)族等）。此類基團(tuán)的實(shí)例包括但不限 于1-氯乙基等。
[0156] 如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"硫代烷氧基"指其中硫原子(S)被鍵合至烷氧基的 化學(xué)官能團(tuán)，具有通用化學(xué)式-SR24,其中R24為可被取代的烷氧基基團(tuán)。"硫代烷氧基"可具 有1-6個(gè)碳原子即-S-(0)-&-C6烷基基團(tuán)，其中Ci-Cs烷基具有如W上定義的含義。具有從1 個(gè)至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈硫代烷氧基基團(tuán)或基，還被稱為C1-C6硫代烷氧基的說明性實(shí) 例包括硫代甲氧基和硫代乙氧基。
[0157] 如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"硫代烷基"指其中硫原子(5)被鍵合至可被取代的 烷基的化學(xué)官能團(tuán)。硫代烷基基團(tuán)的實(shí)例是硫代甲基、硫代乙基和硫代丙基。硫代烷基可被 取代或未取代的簇酸、芳基、雜環(huán)基、幾基或雜環(huán)基取代。
[0158] 如本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語"硫代芳基"指其中硫原子(S)被鍵合至芳基基團(tuán)的 化學(xué)官能團(tuán)，具有通用化學(xué)式-SR23,其中R23為可被取代的芳基。硫代芳基基團(tuán)和被取代的 硫代芳基基團(tuán)的說明性實(shí)例是苯硫基、氯苯硫酪、對(duì)-氯苯硫酪、硫代芐基、4-甲氧基-硫代 苯基、4-硝基-硫代苯基和對(duì)-硝基硫代芐基。
[0159] 如本文所用的術(shù)語"硫醇"意指-SH。硫醇可被本文公開的取代基，特別地烷基(硫 代烷基）、芳基(硫代芳基）、烷氧基(硫代烷氧基)或簇基取代。硫醇可被W下取代:取代的或 未取代的雜芳基或雜環(huán)基，特別地包含1個(gè)至4個(gè)氮原子的被取代的或未被取代的飽和的3 元至6元雜單環(huán)基團(tuán)（例如化咯烷基、咪挫烷基、贓晚基和贓嗦基)或包含1個(gè)至2個(gè)氧原子和 1個(gè)至3個(gè)氮原子的飽和的3元至6元雜單環(huán)基團(tuán)（例如嗎嘟基;悉尼酬基(sy化ionyl))，特別 地被取代的嗎嘟基或贓晚基。
[0160] 討論
[0161] 碳青霉締類對(duì)大部分0-內(nèi)酷胺酶高度耐受，并在其C-6位置處具有S構(gòu)型和在C-5 位置處具有財(cái)勾型，如在圖1B所示。0-內(nèi)酷胺環(huán)在C-5位置和C-6位置處的運(yùn)一反式構(gòu)型提供 了具有針對(duì)e-內(nèi)酷胺酶的良好穩(wěn)定性的抗生素(Basket等，（1980)J.Antibiot.(Tokyo)33: 878-884)。相比之下，其他內(nèi)酷胺諸如頭抱菌素類，一類最初來源于真菌枝頂抱屬 (Acremonium)的、通常已被用作開發(fā)用于0-內(nèi)酷胺酶的探針的支架的0-內(nèi)酷胺抗生素 (Gao 等，（2003)J.Am.Chem.Soc.125:11146-11147;Zlokarnic等，（1998)Science279:86-88; Xing等，（2005)J.Am.Chem.Soc.127:4158-4159;Kong等，（2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 419:9-16 ;Xie等，（2012) J.Nat. Chem. 4:802-809)通常具有在對(duì)應(yīng)C-7位置處的R構(gòu)型。
[0162] 本公開內(nèi)容包括了對(duì)金屬-e-內(nèi)酷胺酶，特別地碳青霉締酶的選擇性檢測(cè)有用，從 而區(qū)分耐受碳青霉締類的細(xì)菌的那些物種與是敏感的細(xì)菌菌株的探針的實(shí)施方案。基于頭 抱菌素的用于檢測(cè)耐受抗生素的細(xì)菌的具有6,7R，財(cái)勾型的探針容易被0-內(nèi)酷胺酶裂解，但 不能區(qū)分被金屬-e-內(nèi)酷胺酶和其他e-內(nèi)酷胺酶的裂解?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過e-內(nèi)酷胺環(huán)的6,7 位置由R，財(cái)勾型至s，R的修飾允許頭抱菌素可被金屬-e-內(nèi)酷胺酶，即，碳青霉締酶裂解，但 基本上不可被其他內(nèi)酷胺酶裂解。另外，已發(fā)現(xiàn)了通過修飾頭抱菌素的側(cè)基，選擇性可被引 入，其允許本公開內(nèi)容的探針區(qū)分多種類型的金屬-e-內(nèi)酷胺酶，并因此更狹窄地定義細(xì)菌 的菌株W及產(chǎn)生的金屬-e-碳青霉締酶的類型。因此，本公開內(nèi)容提供了對(duì)鑒定耐受碳青霉 締類的細(xì)菌菌株的存在并進(jìn)一步表征菌株為針對(duì)特定類型的酶有用的探針。
[0163] 特別地，本公開內(nèi)容的探針的實(shí)施方案可通過在C-7位置處的取代來修飾，所述修 飾通過改變?cè)诤铣刹襟E中使用的醇。本公開內(nèi)容的實(shí)例由此滲入通過氧基-鍵附連至頭抱 菌素的側(cè)基，其大小從簡(jiǎn)單的甲基部分變化至取代的苯基基團(tuán)。然而，預(yù)期了可選擇可允許 金屬-e-內(nèi)酷胺酶的進(jìn)一步定義的其他側(cè)基。
[0164] 本公開內(nèi)容的探針對(duì)檢測(cè)生物樣品諸如體液，包括血液、唾液、尿液等，在受試者 人或動(dòng)物中的或者從其分離的組織，或者細(xì)菌的培養(yǎng)的群體的懸液或培養(yǎng)物中的細(xì)菌金 屬-e-內(nèi)酷胺酶有用。
[0165] 探針可游離在溶液中，或被拴系（tethered)至用于與測(cè)試樣品接觸的固體支撐 物。將探針?biāo)┫抵链祟愔挝锏拇祟惙椒╓及為檢測(cè)釋放的標(biāo)記部分選擇的和/或調(diào)整的 檢測(cè)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。
[0166] 因此，本公開內(nèi)容的修飾的頭抱菌素類已被工程化W包括頭抱菌素的財(cái)勾型至S構(gòu) 型的轉(zhuǎn)化W使得它對(duì)碳青霉締酶特異，即可被碳青霉締酶裂解，但不可被其他內(nèi)酷胺酶裂 解，或基本上較少程度地可被其他內(nèi)酷胺酶裂解。
[0167] 如圖1A和1B中所示，本公開內(nèi)容的碳青霉締酶特異的探針還可包括可檢測(cè)的標(biāo)記 部分諸如，但不限于，巧光團(tuán)?？杀挥欣貪B入進(jìn)本公開內(nèi)容的探針的適合的巧光團(tuán)包括， 但不限于，諸如在其3'-位置處被附連至頭抱菌素的烷基化的傘形酬(7-徑基香豆素）。當(dāng)在 36化m處激發(fā)時(shí)，此類附連的標(biāo)記部分幾乎不發(fā)巧光。然而，在頭抱菌素被碳青霉締酶水解 后，巧光團(tuán)被釋放，導(dǎo)致可檢測(cè)的巧光發(fā)射?？杀粷B入進(jìn)本公開內(nèi)容的探針的其他有利標(biāo)記 物是蛋光素。特別有利的蛋光素及其衍生物是具有式(45)-2-(6-?基-1,3-苯并嚷挫-2- 基)-4，5-二氨嚷挫-4-簇酸的蛋火蟲D-蛋光素，其可例如通過6-徑基位置被連接至探針。然 而，預(yù)期了，在從探針裂解之后是可檢測(cè)的任何巧光團(tuán)可有用地被滲入進(jìn)本公開內(nèi)容的探 針。
[0168] 幾種巧光探針(各自包含在C-7位置處具有S構(gòu)型的頭抱菌素部分)根據(jù)如圖4中所 示的方案來合成。頭抱菌素中構(gòu)型的反轉(zhuǎn)通過醇和重氮酬中間體之間的SN2反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，如 已被0〇116的7等（1990) J.Med.化em. 33:2513-2521描述的，其通過引用W其整體并入本文， 該重氮酬中間體在酸性條件下由7-氨基頭抱菌酸（1)的對(duì)甲氧基芐基(PMB)醋與化N02W定 量產(chǎn)率來制備。醇的R基團(tuán)可被改變，W產(chǎn)生對(duì)確定碳青霉締酶的底物偏好有用的一組探針 變體。在用于生物測(cè)定中之前，所有探針通過HPLC來純化并通過NMR和質(zhì)譜(MS)在結(jié)構(gòu)上表 征。
[0169] 本公開內(nèi)容的巧光探針實(shí)施方案相對(duì)于其他內(nèi)酷胺酶選擇性檢測(cè)碳青霉締酶的 特異性使用重組e-內(nèi)酷胺酶進(jìn)行檢查。四種碳青霉締酶，即金屬-e-內(nèi)酷胺酶VIM-27、IMP-1 和 NDM-1 W 及A類 0-內(nèi)酷胺酶 KPC-3遵循如在 Wang等，（2006)Antimicrob.Agents 化emother. 50: 2762-2771中描述的方案來表達(dá)，其通過引用W其整體并入本文。兩種非碳 青霉締酶的A類0-內(nèi)酷胺酶，TEM-lBla和BlaC也被表達(dá)，W用作陰性對(duì)照。
[0170] 在使用在約1飛摩爾至約200飛摩爾的范圍內(nèi)的酶濃度來在酶處理之前和之后，測(cè) 量探針的巧光。如圖2、5和6中所示，探針顯示了對(duì)六種0-內(nèi)酷胺酶VIM-27JMP-1和NDM-UA 類e-內(nèi)酷胺酶KPC-3和非碳青霉締酶的A類0-內(nèi)酷胺酶TEM-lBla和BlaC的不同特異性和靈 敏度。在暴露于任何和所有的酶包括TEM-lBla和BlaC對(duì)照之后，如被Xie等（2012) J.化t.化em.4:802-809描述的被采用作為陽性對(duì)照的先前報(bào)道的用于0-內(nèi)酷胺酶的非特 異性探針CDC-1，給出陽性巧光增強(qiáng)。然而，當(dāng)用碳青霉締酶處理時(shí)，本公開內(nèi)容的多種基于 修飾的頭抱菌素的探針表現(xiàn)出不同程度的巧光。
[0171 ] 例如，當(dāng)用碳青霉締酶VIM-27、IMP-1、NDM-1和KPC-3處理時(shí)，對(duì)于（S)-CC-l、（S)- CC-2和(S )-CC-5，高的巧光信號(hào)被記錄，但當(dāng)所述探針用內(nèi)酷胺酶TEM-lBla和BlaC處理時(shí)， 幾乎未觀察到巧光增強(qiáng)。因此，探針(s)-CC-l、（s)-CC-2和（s)-CC-5可被稱為是對(duì)碳青霉締 酶特異性的底物，即可特異性地檢測(cè)碳青霉締酶。相比之下，當(dāng)用低至1飛摩爾的所有四種 碳青霉締酶處理時(shí)，通過提供可檢測(cè)的巧光，（s)-CC-l和（s)-CC-5顯示比（s)-CC-2更大的 靈敏度，表明（s)-CC-l和(s)-CC-5可W是對(duì)總體碳青霉締酶特異性的但對(duì)其他內(nèi)酷胺酶不 是特異性的探針。
[0172] 僅對(duì)于S種MBL VIM-27、IMP-1 和NDM-1，探針（S)-CC-3和（S)-CC-6顯示巧光增強(qiáng)， 表明（s)-CC-3和（s)-CC-6對(duì)金屬-0-內(nèi)酷胺酶的一般特異性。然而，探針（s)-CC-6顯示比 (s)-CC-3更好的靈敏度，由于對(duì)于（s)-CC-6,用低至1.0飛摩爾的酶，巧光增強(qiáng)被清楚地觀 察到。當(dāng)在測(cè)定中使用的KPC-3的量上升至200飛摩爾時(shí)，兩種探針產(chǎn)生巧光信號(hào)，如圖2C和 2F中所示。
[0173] 如在圖2D中所示，巧光探針(s)-CC-4顯示對(duì)IMP-1的高特異性，且巧光信號(hào)W濃度 依賴性方式逐漸增加。隨著在約200飛摩爾的量暴露于NDM-1，巧光增加僅是可檢測(cè)的。結(jié)果 指示，頭抱菌素的C-7位置由財(cái)勾型向S構(gòu)型的立體化學(xué)的反轉(zhuǎn)足W增強(qiáng)相對(duì)于其他內(nèi)酷胺 酶物類對(duì)碳青霉締酶是選擇性的探針特異性。
[0174] 本公開內(nèi)容的探針與不同0-內(nèi)酷胺酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)由林-貝氏化ineweaver- Burk)曲線確定并總結(jié)于圖7A-13F和表1中。
[0175] 表1 「017A1
[017引所有探針表現(xiàn)出高穩(wěn)定性與范圍從0.7至5.9x l0-7s-i的低自發(fā)水解速率，如圖 14B-14G中所示。動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較指示，對(duì)于是最常見的金屬-0-內(nèi)酷胺酶并具有全世界 的分布的IMP-l(Oelschlaeger等，（2010)J.Med.Chem.53:3013-3027;Griffin等，（2011) Biochemistry 50 : 9125-91:34)，所有的探針顯示最佳動(dòng)力學(xué)效率（kcat/Km = 0.2-2.5 X i06s-im_i)。
[0179] 具有大體積(bulky)叔下基側(cè)基的探針（s)-CC-4顯示對(duì)于IMP-1的高的特異性和 動(dòng)力學(xué)效率化cat/Km) (2.2 X 105s^M^)，與對(duì)其他碳青霉締酶的相比的50至100倍。未檢測(cè) 到被非碳青霉締酶的內(nèi)酷胺酶的水解。對(duì)于被VIM-27和KPC-3水解，較小的R基團(tuán)是優(yōu)選的， 但對(duì)于IMP-1和NDM-1是較不優(yōu)選的。
[0180] 與VIM-27和NDM-U分別為2.6X1〇4s-1m-i和 1.0X1〇4s-1m-i)相比，對(duì)于IMP-1 和 KPC-3(分別為1.2X10V1M-哺2.2X1〇5s-1M-i)，探針（s)-CC-5表現(xiàn)出高得多的動(dòng)力學(xué)效 率。未觀察到被非碳青霉締酶的內(nèi)酷胺酶的水解。然而，對(duì)于IMP-UNDM-1和VIM-27(分別為 6.6X105s-lM-l、4.0X105s-lM-l和2.8X105s-lM-l)，探針(s)-CC-6顯示高的動(dòng)力學(xué)效率，水平 比KPC-3(2.0X10Vl^^l)高從約14倍至約33倍。運(yùn)些動(dòng)力學(xué)測(cè)量值與如圖2A-2F中所示的W 重組e-內(nèi)酷胺酶的特異性/靈敏度結(jié)果一致。
[0181] 還證實(shí)了運(yùn)些探針用于檢測(cè)表達(dá)碳青霉締酶的活的細(xì)菌的有用性。評(píng)價(jià)了產(chǎn)生碳 青霉締酶或其他臨床流行的e-內(nèi)酷胺酶的^^一種細(xì)菌菌株，包括A類0-內(nèi)酷胺酶KPC-3和 IMI，B類MBL VIM-27JMP-1和NDM-1，D類0-內(nèi)酷胺酶0XA-48，W及臨床上重要的非碳青霉締 酶CTX-M、SHV-18、TEM-l、BlaC和AmpC。探針（各自10i^M，除非指明）對(duì)在從104c.f.u.至 106c.f.u.的范圍內(nèi)不同數(shù)目的活的細(xì)菌的巧光響應(yīng)示于圖3A-3F中。作為陽性對(duì)照，對(duì)于 所有的細(xì)菌菌株，CDC-1是持續(xù)陽性的，表明所有的細(xì)菌是0-內(nèi)酷胺酶活性的。
[0182] 對(duì)于表達(dá) VIM-27、IMP-1、NDM-1 和 KPC-3 的細(xì)菌（〉= l〇5c.f .U.)，探針（s)-CC-l 和 (s)-CC-5顯示高的巧光增強(qiáng)。然而，對(duì)于104c.f.u的細(xì)菌，僅表達(dá)IMP-1的細(xì)菌可被探針 (s)-CC-l檢測(cè)到。僅對(duì)于VIM-27JMP-1和NDM-1，探針(s)-CC-3和(s)-CC-6具有強(qiáng)的巧光響 應(yīng)，與如圖2A-2F中所示的從重組酶研究獲得的結(jié)果一致。相比之下，需要至少1. Ox l〇5c.f.u.至約l.Ox 106c.f.u.細(xì)菌，W使用（s)-CC-3和(s)-CC-6探針并在化解育之后可靠 地檢測(cè)mL細(xì)菌。另外，（s)-CC-4顯示對(duì)于產(chǎn)生IMP的菌株的特異性偏好，具有約1 X 105c.f.u.細(xì)菌的檢測(cè)限值。
[0183] 因此，通過反轉(zhuǎn)頭抱菌素在C7位置處的立體化學(xué)，已開發(fā)了可特異性檢測(cè)碳青霉 締酶，且特別地由CRE細(xì)菌產(chǎn)生的金屬-0-內(nèi)酷胺酶的巧光探針。在C7位置處的取代基團(tuán)可 進(jìn)一步調(diào)節(jié)對(duì)碳青霉締酶之間的選擇性，W進(jìn)一步區(qū)分碳青霉締酶的類型。因此，（s)-CC-3 和(s)-CC-6顯示總體相比于其他內(nèi)酷胺酶對(duì)MBL的特異性和靈敏度。然而，探針(s)-CC-4顯 示對(duì)IMP-1的高特異性。
[0184] 盡管本公開內(nèi)容的探針（s)-CC-l至（s)-CC-6使用藍(lán)色巧光團(tuán)香豆素，預(yù)期了，其 他巧光團(tuán)包括，但不限于，具有較長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的那些可被用作本公開內(nèi)容的巧光團(tuán)，W改進(jìn) 靈敏度，如報(bào)道的如報(bào)道的（Xie等，（2012)J.Nat.Chem.4:802-809)。預(yù)期了本公開內(nèi)容的 探針，包括巧光團(tuán)中的變化形式，對(duì)耐受碳青霉締類的腸桿菌科(CRE)的快速和準(zhǔn)確檢測(cè)有 用，W用于具有CRE感染的患者的早期診斷和治療。
[0185] 還預(yù)期了，多種可檢測(cè)的標(biāo)記部分可被滲入進(jìn)本公開內(nèi)容的修飾的頭抱菌素探 針，使得多于一種的細(xì)菌菌株(各自產(chǎn)生可區(qū)分的物類的金屬-e-碳青霉締酶)可W同時(shí)是 可檢測(cè)的。最有利地，在碳青霉締類被碳青霉締酶的水解后，此類可檢測(cè)的部分提供可檢測(cè) 的信號(hào)增加。在本公開內(nèi)容的探針的一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物是巧光標(biāo)記物。通過標(biāo)記物至 頭抱菌素的附連，存在由激發(fā)福射誘發(fā)的巧光的巧滅。在其他實(shí)施方案中，標(biāo)記物可W是從 探針釋放并進(jìn)入周圍的液體介質(zhì)的染料，或甚至是放射性標(biāo)記物。被釋放的染料然后可從 未裂解的探針分離，用于檢測(cè)。
[0186] 因此，本公開內(nèi)容的一個(gè)方面包括了包含可被金屬-0-內(nèi)酷胺酶選擇性裂解的可 檢測(cè)的探針的組合物的實(shí)施方案，所述探針包含具有6,7-反式構(gòu)型的頭抱菌素和附連至其 的可檢測(cè)的標(biāo)記物。
[0187] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針可具有式I或式II:
[0188；
[0189] 其中，Ri可選自由W下組成的組:烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基 團(tuán)、巧光團(tuán)及巧光巧滅劑。
[0190] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，Ri可選自由W下組成的組：甲基、乙 基、異丙基、叔下基、芐基-及甲苯橫酷氧基-。
[0191] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物可通過-0-、-N-或-S- 連接被附連至頭抱菌素。
[0194] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針可選自由W下組成的組：
[0192] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是(2-氧代-2護(hù)色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有結(jié)構(gòu)：
[0193]
[019(
[019；
[019引本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面包括了選擇性檢測(cè)金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的方法的實(shí)施 方案，所述方法包括使懷疑具有金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的樣品與包含可被金屬-e-內(nèi)酷胺酶 選擇性裂解的可檢測(cè)的探針的組合物接觸，所述探針包含具有6,7反式構(gòu)型的頭抱菌素部 分和可檢測(cè)的標(biāo)記物;允許金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性裂解頭抱菌素部分的有效時(shí)間段，從而從 該頭抱菌素部分釋放可檢測(cè)的標(biāo)記物，藉此生成可檢測(cè)的信號(hào);并且檢測(cè)該信號(hào)，其中可檢 測(cè)的信號(hào)指示樣品包含金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性或金屬-e-內(nèi)酷胺酶活性的來源。
[0199]在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，探針具有式I或式II:
[0200；
123 其中，Ri可選自由W下組成的組:烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基 團(tuán)、巧光團(tuán)、蛋光素酶底物及巧光巧滅劑。 2 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，扣選自由W下組成的組：甲基、乙基、 異丙基、叔下基、芐基-及甲苯橫酷氧基-。 3 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物可W是染料、巧光標(biāo) 記物、放射性標(biāo)記物或巧滅劑。
[0204] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物可通過-0-、-N-或-S- 連接被附連至探針。
[0205] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是(2-氧代-2H-色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有結(jié)構(gòu)：
[020d
[0207]在一些實(shí)施方案中，探針可選自由W下組成的組：
[0208；
[0210]
[0211]
[0212] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，樣品可W是細(xì)菌培養(yǎng)物。
[0213] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，樣品可從動(dòng)物受試者或人受試者分 離。
[0214] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，樣品可W是從來自人受試者或動(dòng)物受 試者的樣品產(chǎn)生的細(xì)菌培養(yǎng)物。
[0215] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，樣品可包含克雷伯桿菌屬物種或埃希 氏桿菌屬物種中的至少一種。
[0216] 在本公開內(nèi)容的該方面的一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物可W是蛋光素酶底 物，并且所述方法還可包括使反應(yīng)混合物與蛋光素酶接觸，從而在釋放的蛋光素酶底物的 存在下生成可檢測(cè)的生物發(fā)光信號(hào)。
[0217] 應(yīng)注意，比率、濃度、量和其他數(shù)值數(shù)據(jù)可范圍格式在本文中表示。應(yīng)該理解， 為方便和簡(jiǎn)潔，使用運(yùn)樣的范圍格式，并且因此，應(yīng)該W靈活的方式解釋為不僅包括明確列 舉作為范圍的界限的數(shù)值，而且還包括在該范圍內(nèi)包括的所有單獨(dú)的數(shù)值或子范圍，如同 每個(gè)數(shù)值和子范圍被明確地列舉。為了說明，"約0.1%至約5%"的濃度范圍應(yīng)被解釋為不 僅包括約0.1 wt %至約5wt %的明確列舉的濃度，而且還包括在指示的范圍內(nèi)的單獨(dú)的濃度 (例如，1%、2%、3%、和 4%)W 及子范圍（例如，0.5%、1.1%、2.2%、3.3%、和4.4%)。術(shù)語 。約"可包括被修飾的數(shù)值的±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9% 或±10%或更多。另外，短語"約V至V"包括"約V至約V"。
[0218] 應(yīng)強(qiáng)調(diào)，本公開內(nèi)容的W上描述的實(shí)施方案僅僅是實(shí)現(xiàn)的可能的實(shí)例，并且僅為 了對(duì)本公開內(nèi)容的原理的清楚理解而提出。可對(duì)本公開內(nèi)容的W上描述的實(shí)施方案進(jìn)行許 多變化和修改，而基本上不偏離本公開內(nèi)容的精神和原則。所有此類修改和變化都意圖在 本文中被包括在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。
[0219] 提出W下實(shí)施例，W便對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何進(jìn)行本文公開并要求保護(hù) 的方法和使用探針的完整的公開內(nèi)容和描述。已經(jīng)做出努力W確保關(guān)于數(shù)字(例如量、溫度 等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮某些誤差和偏差。除非另外指明，否則份數(shù)是重量份數(shù)，溫度是W °C，并且壓力是在大氣壓或接近大氣壓。標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力定義為20°C和1個(gè)大氣壓。 實(shí)施例
[0。0] 實(shí)施例1
[0221] 碳青霉締酶和非碳青霉締酶的內(nèi)酷胺酶的克?。河糜趯⑷L(zhǎng)0-內(nèi)酷胺酶克隆進(jìn) pBAD/Myc-His載體（Invitrogen)的引物，如表2中所示。
[0222] 表2:用于克隆0-內(nèi)酷胺酶的引物 「02231
L〇224」基因組DNA或質(zhì)粒DM從各自過表足特定酶的細(xì)菌菌株（肺炎克雷伯桿菌或大腸桿 菌)純化作為用于PCR的模板。利用對(duì)于各自酶的F(正向）引物、R(反向）引物和模板DNA(其 序列示于圖16和表2中）使用Pf X 50DNA聚合酶和制造商的方案（Invitrogen)來進(jìn)行PCR。 純化的PCR產(chǎn)物用Ncol和Sail限制性內(nèi)切酶消化并使用T4DNA連接酶（Invitrogen)克隆進(jìn) pBAD/Myc-His載體。連接的質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌化21或ToplO細(xì)胞中。插入的DNA序列通過 測(cè)序分析來證實(shí)。
[0。引實(shí)施例2
[0。6] 酶從細(xì)菌細(xì)胞的純化:所有的酶如Dohedy等，（1990)J .Med.化em. 33: 2513-2521 中描述的來純化，其通過引用W其整體并入本文。簡(jiǎn)言之，包含6x His的(6-內(nèi)酷胺酶（在 化21或Top 10細(xì)菌中的pBAD/Myc-Hi S載體)在30 °C通過0.2 %阿拉伯糖誘導(dǎo)超過化進(jìn)行過表 達(dá)，直到在60化m處的光密度(0化00)達(dá)到0.8。蛋白然后用制造商的方案使用腳G腳ST邸.RTM 蛋白提取試劑（Novagen)和Ni-NTA瓊脂糖珠（Qiagen)來純化（洗涂緩沖液1:在pH 7.4， 0.01M PBS、150mM NaCl;用于3-次洗涂的洗涂緩沖液2:在pH 7.4 0.01M PBS中的20mM咪 挫;洗脫緩沖液，在抑7.4 0.01M PBS中的250mM咪挫）。在純化之后，洗脫的蛋白使用PD-10 柱(GE healthcare)純化。純度通過12%十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳(SDS-PAGE， 如在圖15中所示)來確定且然后濃度通過化a壯ord測(cè)定試劑盒(BioRad)來確定。
[0。7] 實(shí)施例3
[022引實(shí)驗(yàn)部分：所有的化學(xué)品購自商業(yè)來源（例如Aldrich、Alfa Aesar和TCI America)，且不經(jīng)進(jìn)一步純化地使用。分析性化C用巧光指示器(254nm)用0.25mm硅膠60F板 來進(jìn)行。板用紫外光來可視化。HPLC在配備有GP50梯度累和內(nèi)聯(lián)二極管陣列UV-Vis檢測(cè)器 的Dionex冊(cè)LC系統(tǒng)（DionexCo;rporation)上來進(jìn)行。反相C18(曲enomenax,5lim,4.6x 250mm或Dionex，5皿，21.2X 250mm)柱與包含0.1%S氣乙酸的MeCN/出0梯度流動(dòng)相血/ min或12血/min的流一起使用，用于分析或純化。1h和1化NMR譜在Varian 400MHz磁共振譜 儀上來獲取。對(duì)于iH醒R譜的數(shù)據(jù)報(bào)告如下:化學(xué)位移被報(bào)告為相對(duì)于氯仿-d(S7.26，S)的 S，W百萬分率(ppm)為單位;多重性報(bào)告如下:S(單峰）、d(雙峰）、t(S重峰）、q(四重峰）、dd (雙二重峰）、m(多重峰)或br(加寬）；偶合常數(shù)被報(bào)告為W化dzWz)計(jì)的J值;對(duì)于給定共 振的質(zhì)子數(shù)目（n)被指示nH，且基于頻譜集成值。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)在M1000酶標(biāo)儀（TECAN, research triangle park,NC)中來進(jìn)行。
[0。9] 實(shí)施例4
[0230] 4-甲氧基芐基3-(氯甲基)-7-重氮基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2- 締-2-簇酸醋化合物2的制備：
[0231]
[0232] 化合物2根據(jù)先前公開的程序來制備（Doherty等，（1990) J.Med.化em. 33 :2513- 2521，通過引用W其整體并入本文）。將在水中的化N〇2(0.35g，5mmol)的混合物(20mL)添加 至在20血C出Cb中的ACLE(2.Og，5mmol)的溶液。將所得的兩相混合物冷卻至0°C，然后伴隨 劇烈攬拌在30min內(nèi)逐滴添力日2N出SO冰溶液(3.8mL)。將反應(yīng)在0°C連續(xù)地?cái)埌?小時(shí)。隨后， 將有機(jī)層分離，且用C此Cb洗涂?jī)纱嗡畬?。將有機(jī)層合并，用鹽水洗涂，經(jīng)MgS〇4干燥，并過 濾，W獲得2的黃色溶液。將該溶液在下一步中立即使用。 腳引實(shí)施例5
[0234] (6R，7S)-4-甲氧基芐基3-(氯甲基）-7-烷氧基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)
[4.2.0] 辛-2-締-2-簇酸醋(3)的制備.在0°C，將多種醇（約10當(dāng)量至約100當(dāng)量)添加至化 合物2在C此Cb中的溶液。對(duì)甲苯橫酸（1當(dāng)量）隨后在20min伴隨攬拌成批地添加（氣體逸 出）。然后除去冰浴并且在室溫繼續(xù)攬拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)通過化C監(jiān)測(cè)。在反應(yīng)完成之后，濃 縮反應(yīng)混合物并用乙酸乙醋稀釋，且隨后用飽和的化肥化水溶液、水和鹽水萃取。有機(jī)層經(jīng) 無水MgS化干燥，并在真空中濃縮。剩余物最后在快速柱上用己燒/EtOAc(4:l)色譜分析，W 獲得所期望的化合物3。通過使用醇類甲醇、乙醇、異丙醇、叔下醇、節(jié)醇和甲苯橫酷酸合成 的化合物3的實(shí)例分別是化合物3-1至3-6:
[0235；
123 (6R，7S)-4-甲氧基芐基3-(氯甲基）-7-甲氧基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán) 2
[4.2.0] 辛-2-締-2-簇酸醋（3-l):產(chǎn)率 = 38%。lHNMR(400MHz，CDCl3)S7.37(d，J = 8.細(xì)z， 3 2H)、6.89(d，J = 8.7Hz，2H)、5.30(d，J=11.8Hz，lH)、5.22(d，J=11.8Hz，lH)、4.69(d，J = 1.細(xì)z，lH)、4.52(d，J=l.細(xì)z，lH)、4.42(d，J=11.9Hz，lH)、4.31(d，J=11.7Hz，lH)、3.81 (s，3H)，3.65(d，J=18. lHz，lH)、3.56-3.49(m，3H)，3.40(d，J=18.1Hz，1H)〇i3c 匪R (101MHz，CDCl3)Sl61.32、161.25、160.15、130.96、127.09、126.92、122.48、114.20、90.18、 68.52、58.50、56.41、55.52、43.62、28.69。
[0237]
[023引 （6R，7S)-4-甲氧基芐基3-(氯甲基）-7-乙氧基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)
[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸醋（3-2):產(chǎn)率=20 %。1h NMR( 400MHz，CDC13) S7.37 (d，J = 8.4Hz， 2H)、6.89(d，J = 8.細(xì)z，2H)、5.30(d，J= 11.8Hz，1H),5.21 (d，J= 11.8Hz，lH)、4.67(d，J = 1.8Hz，lH)、4.55(dd，J=1.8,0.4Hz，lH)、4.41(d，J = 11.8Hz，lH)、4.31(d，J=11.8Hz，lH)、 3.81(s，3H)、3.77-3.68(m，2H)、3.64(d，J = 18.0Hz，lH)、3.40(d，J=18.0Hz，lH)，1.29- 1.23(m，4H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl61.56、161.35、160.14、130.98、127.17、126.95、 122.31、114.19、89.02、68.51、67.27、57.12、55.52、43.65、28.71、15.：M。
[0239]
[0240] (6R，7S)-4-甲氧基芐基3-(氯甲基）-7-異丙氧基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán) [4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸醋（3-3):產(chǎn)率=23 %。1h NMR( 400MHz，CDC13) S7.34 (d，J = 8.細(xì)Z， 2H)、6.87(d J = 8.細(xì)z，2H)、5.26(dJ = 5.細(xì)z，lH)、5.20(dJ = 4.4Hz，lH)、4.73(dJ = 1.7Hz，lH)、4.68(d，J=l.細(xì)z，lH)、4.40(d，J= 11.8Hz，1H)、4.33(d，J= 11.8Hz，1H) ,3.77 (s，3H)、3.60(d，J=18.1Hz，lH)、3.42(d，J = 22.2Hz，lH)，1.21(dd，J=17.6,6.1Hz，6H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl67.94、160.92、158.69、130.95、130.90、126.84、124.72、122.25、 114.23、114.19、87.81、74.69、68.55、61.17、59.24、55.51、43.29、28.67、22.58。
[0241]
1234 (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-(叔下氧基)-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán) 2
[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（3-4):產(chǎn)率=33%。4醒1?(4001化，〔0(：13)87.36((1，1 = 2.1化， 2H)、6.89(d，J = 3.9Hz，2H)、5.30(d，J=11.8Hz，lH)、5.20(d，J=11.8Hz，lH)、4.74(d，J = 3 1.9Hz，lH)、4.68(d，J=1.9Hz，lH)、4.42(d，J=11.8Hz，lH)、4.33(d，J=18.2Hz，lH)、3.78 4 (s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.42(d，J = 23.2Hz，lH)、1.25(s，9HKUc 醒R(l〇lMHz， CDC13)S168.01、162.66、158.68、130.97、130.91、126.84、124.70、122.02、114.24、83.09、 76.69、68.57、61.19、55.52、43.30、28.70、28.10。
[0243]
[0244] (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-(節(jié)氧基）-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)
[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（3-5):產(chǎn)率=18%。4醒1?(4001化，〔0(：13)87.82((1，1 = 8.4化， 2H)、7.41-7.31(m，5H)、6.88(d，J = 8.8Hz，2H)、5.22(dd，J = ：M.3，ll.細(xì)z，2H)、5.11(d，J = 1.8Hz，lH)、4.74(d，J=l.細(xì)z，lH)、4.67(s，lH)、4.36(dd，J = 27.1，11.9Hz，2H)、3.79(s, 3H)、3.59(d，J=18.1Hz，lH)、3.38(d，J=18.1Hz，lHKUc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl60.85、 160.19、156.85、146.53、131.82、131.00、130.54、128.76'128.55、127.80'127.20、126.73、 126.67、125.12、114.25、83.70、68.63、65.45、57.31、55.53、28.52、22.04。
[0245]
123456 (6R，7S)-4-甲氧基芐基3-(氯甲基)-8-氧代-7-(甲苯橫酷氧基)-5-硫雜-1-氮雜 雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（3-6):產(chǎn)率=20%。111醒1?(4001化，〔0(：13)87.83((1，1 = 8.2Hz，lH)、7.36(dd，J = 22.4,8.3Hz，3H)、7.02(d，J = 8.1Hz，lH)、6.89(d，J = 8.細(xì)z，2H)、 6.74(dJ = 8.4Hz，lH)、5.23(ddJ = 35.8，11.7Hz，2H)、5.11(ddJ = 1.8，1.2Hz，lH)、4.79- 4.73(m，lH)、4.37(dd，J = ：M.3、11.9Hz，2H)、3.81(s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.40(d， J=18.1Hz，lH)、2.47(s，3H)cUc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.44、160.84、160.16、156.87、 146.56、131.78、130.97、130.56、128.81、128.50、126.66、125.21、114.14、83.68、68.58、 64.97、57.25、55.49、43.19、28.46、22.01。 2 實(shí)施例6 3 (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-烷氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締-7-基)氧基）甲 基)-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（6)的制備:化合物6根據(jù)化adley等， 4 (1999)Int.J.Antimic;rob.Agents 11 :93-100及Papp-Wallace等，（2011) Antimicrob.Agents化emother. 55:4943-4960來合成，其通過引用[^其整體并入本文。將 艦化鋼(1.0當(dāng)量)添加至3(1.0當(dāng)量)在丙酬中的溶液。將所得的混合物在室溫?cái)埌枰恍r(shí)， 并然后在減壓下去除溶劑。添加水并用乙酸乙醋萃取S次。然后將合并的有機(jī)層用化2S2O3 5 水溶液和鹽水洗涂，經(jīng)MgS化干燥。將粗產(chǎn)物在下一步直接使用。在室溫，將W上產(chǎn)物（1.0當(dāng) 量）、1(2(：03(3.0當(dāng)量)和7-徑基香豆素(2.0當(dāng)量)在乙臘中的混合物攬拌2.5小時(shí)。溶劑隨后 在減壓下被去除，且剩余物被溶解于水中并用乙酸乙醋萃取。將合并的有機(jī)層用化2S2O3水 6 溶液和鹽水洗涂，經(jīng)MgS化干燥。使用在短硅膠柱上的快速層析去除無機(jī)雜質(zhì)和過量的7-徑 基香豆素的大部分。將所得的包含兩種異構(gòu)體的化合物4溶解于C此Cb中，并且然后在0°C， W數(shù)批添加3-氯過氧苯甲酸(m-CPBA，68%，1.0當(dāng)量）。在0°C攬拌30min之后（用化C監(jiān)測(cè)）， 將反應(yīng)混合物用C此Cb稀釋，并隨后用化2S2O3(水溶液）、化H(X)3(水溶液）和鹽水洗涂。經(jīng) MgS化干燥，隨后用在短硅膠柱上的快速層析純化，W獲得化合物5。將S氣乙酸酢（TFAA) (5.0當(dāng)量)逐滴添加至在0°C在無水丙酬中的化合物5(1.0當(dāng)量)和化K5.0當(dāng)量）的混合物。 將所得的混合物在0°C攬拌一小時(shí)，并然后在減壓下去除溶劑和揮發(fā)性試劑。將剩余物溶解 于化肥化（水溶液）中并用乙酸乙醋萃取。在硅膠柱上的快速層析純化之后，獲得作為固體 的標(biāo)題化合物6?；衔?的實(shí)施方案(化合物6-1至6-6)分別分別通過使用醇類甲醇、乙醇、 異丙醇、叔下醇、節(jié)醇和甲苯橫酷酸合成：
[024(
[0250] (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基）甲 基)-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-1):產(chǎn)率=33%。111醒1?(4001化， CDCl3)S7.61(d J = 9.甜z，lH)、7.32(dJ = 8.2Hz，3H)、6.82(dJ = 8.7Hz，2H)、6.75(dd，J = 8.6,2.4Hz，lH)、6.70(d，J = 2.3Hz，lH)、6.24(d，J = 9.甜z，lH)、5.24(s，2H)，4.81(q，J = 12.4Hz，2H)、4.68(d，J=1.7Hz，lH)、4.52(d，J=1.7Hz，lH)、3.75(s，3H)、3.63(d，J = 18.3Hz，2H)、3.52(s，3H)、3.46(d，J=18.3Hz，2H)</3c NMR(101MHz，CDCl3)Sl61.34、 160.15、155.88、143.50、131.00、129.19、126.94、122.72、114.20、113.81、113.34、112.79、 102.09、90.32、68.47、67.29、58.47、56.29、55.51、27.82。
[0251]
(6R，7S)-4-甲氧基芐基7-乙氧基-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締 -7-基）氧基）甲 基)-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-2):產(chǎn)率=30%。111醒1?(4001化， CDCl3)S7.63(d，J = 9.6Hz，lH)、7.34(dd，J = 8.6,3.1Hz，3H)、6.84(d，J = 8.7Hz，2H)、6.76 (dd J = 8.6,2.甜z，lH)、6.72(dJ = 2.3Hz，lH)、6.27(dJ = 9.甜z，lH)、5.25(dJ=l.細(xì)z， 2H)、4.82(q，J=12.5Hz，2H)、4.67(d，J=l.細(xì)z，lH)、4.56(d，J=l.細(xì)z，lH)、3.77(s，3H)、 3.76-3.62(m，2H)、3.62(d，J=18.3Hz，lH)、3.46(d，J=18.3Hz，lH)、1.26(t，J = 7.0Hz， 3H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.30、161.71、161.62、161.23、160.17、155.91、143.45、 131.04、129.15、126.92、122.53、114.21、113.87、113.35、112.77、102.16、89.19、68.48、 67.32、67.25、60.65、57.03、55.51、27.83、15.34。
[0 巧 3]
[0254] (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-異丙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基） 甲基)-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋(6-3):產(chǎn)率 = 29%。lHNMR(400MHz， CDCl3)S7.64(d，J = 9.5Hz，lH)、7.43-7.27(m，3H)、6.86(dd，J=10.8,5.4Hz，2H)、6.80- 6.69(m，2H)、6.28(dd，J = 9.5,2.6Hz，lH)、5.26(dt，J=16.6,8.4Hz，2H)、4.96-4.79(m, 2H)、4.74(dd J = 25.3，1.8Hz，lH)、4.58(dd J = 21.2，1.8Hz，lH)、3.78(s，3H)，3.64(d J = 7.3Hz，lH)、3.58(d J= 17.2Hz，1H)、3.46(dJ= 18.3Hz，lH)、1.24(dd J= 18.7,6.1Hz, 6H)〇i3c 醒R(101MHz，CDCl3)Sl67.89、162.69、161.47，160.14、155.66、144.40、131.08、 131.01、129.33、127.08、126.87、123.25、114.27、114.23、113.48、113.38、113.29、102.15、 87.76、74.92、68.58、67.31、58.40、55.52、27.84、22.63、22.52。
[0 巧5]
[0256] (6r，7s)-4-甲氧基芐基7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締 -7-基）氧 基）甲基）-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-4):產(chǎn)率=33 % NMR (400MHz，CDCl3)S7.62(d，J = 9.5Hz，lH)、7.34(t，J = 8.0Hz，3H)、6.84(d，J = 8.5Hz，2H)、 6.79-6.71(m，2H)、6.26(d，J=9.5Hz，lH)、5.28-5.19(m，2H)、4.85-4.75(m，2H)、4.65(d，J = 1.4Hz，lH)、4.55(d，J=1.4Hz，lH)、3.77(s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.46(dd，J = 9.4,8.8Hz，2H)、1.26(s，9H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.37、167.94、162.76、161.74、 161.18、161.09、160.17、158.79、155.89、143.45、131.02、129.19、127.34、126.89、126.57、 125.21'122.18、114.22、113.86、113.38、112.74、102.15、83.25、68.57、67.12'61.35、 59.11、55.51、28.09、21.29。
[0 巧 7]
[0258] (6R，7S)-4-甲氧基芐基7-(節(jié)氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締 -7-基)氧基） 甲基)-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋(6-5):產(chǎn)率 = 23%。lHNMR(400MHz， CDCl3)S7.62(d，J = 9.5Hz，lH)、7.36(d，J = 0.5Hz，4H)、7.：34(s，lH)，7.33(d，J = 3.2Hz， lH)、6.85(d，J = 8.7Hz，3H)、6.80-6.64(m，3H)、6.27(d，J = 9.5Hz，lH)、5.26(d，J=1.5Hz， 2H)、4.87(t J = 3.細(xì)z，lH)、4.83(dJ = 4.1Hz，lH)、4.80(dJ = 3.1Hz，lH)、4.79-4.76(m, IH)、4.64(d，J= 1.細(xì)z，lH)、4.59(d，J=1.8Hz，1H)、3.77(s，3H)、3.58(d，J= 18.2Hz，1H)、 3.42(d，J=18.3Hz，lH)〇Uc NMR(101MHz，CDCl3)Sl61.59、161.50、161.22、161.16、160.18、 155.91'143.42、136.23、131.05、129.14、128.94、128.79、128.60、126.92、122.93、114.26、 114.22、113.88、113.36、112.74、102.17、88.52、83.92、73.55、68.49、67.28、57.12、55.51、 27.75。
[0 巧9]
[0260] (6R，7S)-4-甲氧基芐基8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締-7-基）氧基）甲基）-7-(甲 苯橫酷氧基）-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（6-6):產(chǎn)率=12%醒R (400MHz，CDCl3)S8.01(s，lH)、7.84(d J = 8.5Hz，2H)、7.63(d J = 9.6Hz，lH)、7.42-7.27 (m，5H)、6.85(d，J = 8.7Hz，2H)、6.76(dd，J = 8.6,2.5Hz，lH)、6.72(d，J = 2.4Hz，lH)、6.28 (d J = 9.甜z，lH)、5.28-5.17(m，2H)，5.12(dJ=l.細(xì)z，lH)、4.86(qJ=12.7Hz，2H)、4.78 (d，J= 1.7Hz，IH)、4.62(s，IH)、3.78(s，3H)、3.62(d，J= 18.3Hz，lH)、3.46(d，J= 18.3Hz, lH)、2.47(s，3H)。
[0261] 實(shí)施例7
[O%2] 最終的巧光探針的制備:將化合物6添加至C出CI2: TFA: TIPS:此0 = 30:65:2.5:2.5 的溶液(4mL)，并且在0°C攬拌混合物30min(用HPLC監(jiān)測(cè)）。在C18柱上RP-HPLC純化，獲得所 期望的最終探針。
[0%3]
[0264](郵，78)-7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締 -7-基）氧基）甲基）-5-硫雜-1- 氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-1).產(chǎn)率=77%。4醒1?(4001化，(16-0150)57.97 (d J = 9.細(xì)z，lH)、7.62(dJ = 8.細(xì)z，lH)、7.01(dJ = 2.2Hz，lH)、6.95(dd，J = 8.6,2.4Hz， lH)、6.28(d，J = 9.5Hz，lH)、5.01(d，J=1.6Hz，lH)、4.86(dd，J = 26.5，11.9Hz，2H)、4.75 (d，J=1.7Hz，lH)、3.70(d，J=18.1Hz，lH)、3.55(d，J=18.1Hz，lH)，3.43(s，3H)〇Uc 醒R (101MHz，d6-DMS0)5163.45、161.94、161.80、160.89、155.93、144.93、132.96、130.26、 128.14、121.16、113.46、102.18、89.60、67.80、57.99、55.90、27.65。]?5:對(duì)于(：1姐15順曰〇75+ ([M-扣+ )計(jì)算值:412.37;發(fā)現(xiàn)值化ound) :412.06。
[02 化]
[0266] (63,75)-7-乙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締 -7-基)氧基）甲基)-5-硫雜-1- 氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-2).產(chǎn)率=80%。4醒1?(4001化，(16-0150)57.98 (d J = 9.細(xì)z，lH)、7.63(dJ = 8.細(xì)z，lH)、7.01(dJ = 2.4Hz，lH)、6.96(dd，J = 8.6,2.4Hz， 1H)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.95(d，J=l.細(xì)z，lH)、4.85(d，J= 15.7Hz，2H)、4.77(d，J = 1.4Hz，lH)、3.74-3.65(m，2H)，3.62(d，J = 7.0Hz，lH)、3.55(d，J=18.1Hz，lH)、1.16(t，J = 7. OHz，3H) eMS:對(duì)于Cl姐i6N〇7S-( [M-扣-)計(jì)算值:402.41;發(fā)現(xiàn)值:402.00。
[0%7]
[0268] (6R，7S) -7-異丙氧基-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫雜- 1 -氮雜雙環(huán)[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸（（S) -CC-3).產(chǎn)率=83 %。1h 醒R(400MHz，ds-DMSO) S 7.98(d，J = 9.2Hz，lH)、7.62(d，J = 8.7Hz，lH)、7.01(d，J = 2.4Hz，lH)、6.95(dd，J = 8.6， 2.甜z，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.89(d，J=11.9Hz，lH)、4.84(d，J=1.7Hz，lH)、4.81 (d J=11.9Hz，lH)、4.77(d，J=1.7Hz，lH)、3.82(dd，J=12.2,6.1Hz，lH)、3.70(d，J = 18.0Hz，lH)、3.54(d，J=18.1Hz，lH)、1.15(dd，J = 9.3,6.1Hz，6H)〇Uc Mffi(l〇lMHz，d6- DMS0)S163.48、162.50、161.81、160.90、155.94、144.95、130.26、128.23、121.00、113.48、 102.19、87.32、74.02、67.80、58.05、40.81、40.60、40.39、40.18、39.97、39.77、39.56、 27.67、22.97、22.89。]?5:對(duì)于〔2地18側(cè)75-([]\1-扣-)計(jì)算值:416.43;發(fā)現(xiàn)值:416.03。
[0269]
[0270] (6R，7S)-7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2護(hù)色締 -7-基)氧基）甲基)-5-硫 雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-4).產(chǎn)率=75%。4醒1?(4001化，(16-0150) 57.98(d J = 9.2Hz，lH)、7.62(d J = 8.7Hz, 1H)、7.01 (dj = 2.4Hz，1H)、6.95(dd，iH NMR (400MHz，DMS0)S7.98(d，J = 9.Wz，lH)、7.62(d，J = 8.7Hz，lH)、7.01(d，J = 2.3Hz，lH)、 6.98-6.92(m，lH)、6.29(d，J = 9.甜z，lH)、4.89(d，J=12.0Hz，lH)、4.83(d，J=1.7Hz，lH)、 4.80(s，lH)，4.76(d J=l.細(xì)z，lH)、3.68(dJ= 18.0Hz，lH)、3.53(d J= 18.0Hz，1H)、1.19 (s，9H)〇Uc 匪R(101MHz，d6-DMS0)Sl63.53、163.14、161.81、160.91、155.93、144.96、 130.26、121.16'113.50、102.19'82.72、76.56'67.79、59.09'28.16、27.61 oMS:對(duì)于 C21 出 oN〇7S_ ([ M-扣-)計(jì)算值:430.46;發(fā)現(xiàn)值:430.00。
[0271]
[0272] (6R，7S)-7-(節(jié)氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫雜- 1 -氮雜雙環(huán)[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸（（S) -CC-5).產(chǎn)率=72 %。1h NMR(400MHz，ds-DMSO) S 7.98(d J = 9.4Hz，lH)、7.63(d J = 8.4Hz，lH)、7.36(dd J=12.8,4.2Hz，4H)、7.01(s，lH), 6.95(d，J = 8.9Hz，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.94(s，lH)，4.91(s，lH)、4.87(d，J = 1.7Hz，lH)、4.82(d，J = 11.9Hz，lH)、4.73(d，J=11.4Hz，lH)、4.63(d，J=11.5Hz，lH)、3.60 (ddJ = 52.7，18.1Hz，2H)d13c 匪R(101MHz，CD3〇D)S162.23、146.95、144.47、143.24、 129.39、128.46、128.31、128.24、126.45、124.31、113.02、112.59、101.55、88.27、72.94、 67.09、56.94、26.94dMS:對(duì)于 C2 化 8NO7S- ([ M-H]-)計(jì)算值:464.48;發(fā)現(xiàn)值:464.17。
[0273]
[0274] (6R，7S)-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基）甲基)-7-(甲苯橫酷氧基)- 5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（S)-CC-6).產(chǎn)率=70%。4醒1?(4001化，(16- DMS0)S7.98(d，J = 9.甜z，lH)、7.88(d，J = 8.4Hz，2H)、7.62(d，J = 8.細(xì)z，lH)、7.52(d，J = 8.4Hz，2H)、7.00(d，J = 2.4Hz，lH)、6.94(dd，J = 8.6,2.4Hz，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、 5.62(d，J=1.5Hz，lH)、5.06(d，J=1.7Hz，lH)、4.90(dd，J = 36.4，12.3Hz，2H)、3.60(dd，J =41.3，18. IHz，3H)、2.43(s，3H) dMS :對(duì)于C2祖isN〇9S2-( [M-H]-)計(jì)算值：528.54;發(fā)現(xiàn)值： 527.88。
[0275]
[0276] (6R，7S)-7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫 雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸5-氧化物（（s)-CC-7)1h NMR(400MHz，CD30D)S7.87 (d，J = 9.6Hz，lH)、7.54(d，J = 8.4Hz，lH)、6.95(dd，J = 11.6,3. lHz，2H)、6.25(d，J = 9.5Hz，lH)，5.44-4.98(m，2H)，4.61(d，J = 50.3Hz，2H)、4.15(d，J=16.5Hz，lH)、4.06(d，J =18.細(xì)z，lH)、3.90(d，J= 16.0Hz，1H)、3.74-3.59(m，lH)、1.31 (s，lH) oMS:對(duì)于C21H20NO8S ([M-H]-)計(jì)算值:446.46;發(fā)現(xiàn)值:445.98。 腳7] 實(shí)施例8
[027引
[0279] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.09(d，J = 9.1Hz，lH)、7.98(s，lH)、7.86(d，J = 7.8Hz， 2H)、7.51(d，J = 8.1Hz，2H)、7.32(dd，J = 9.2，l.細(xì)z，lH)、5.41(s，lH)、4.96(dd，J = 25.3， 11.細(xì)z，2H)、4.84(s，lH),3.52(d，J=17.4Hz，lH)、3.35(d，J=17.0Hz，4H)、2.42(s，3H)〇Uc 醒R(101MHz，CD3〇D)S172.08、166.42、162.95、158.54、157.99、157.77、147.87、146.62、 137.69、131.99、130.37、128.19、127.43、126.52、124.76、117.30、105.14、84.02、78.20、 67.01、57.19、48.50、48.29、48.08、47.87、47.65、47.44、47.23、34.79、26.87、20.66〇MS:對(duì) 于 C2 姐 21 化 〇9S4( [M+H] +)計(jì)算值：648.02;發(fā)現(xiàn)值：648.40。
[0280] 實(shí)施例9
[0281]
[0282] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.04(d，J = 9.1Hz，lH)、7.79(d，J = 2.3Hz，lH)、7.20(dd，J = 9.1，2.甜z，lH)、5.47-5.36(m，lH)、4.88-4.82(m，2H)、4.77(dJ = 1.0Hz，lH)、3.88-3.80 (m，lH)、3.80-3.75(m，lH)、3.73(s，lH)、3.68(d，J = 8.3Hz，lH)、3.58(d，J=18.1Hz，2H)、 1.15(dd，J = 8.7，6. IHz，6H) dMS :對(duì)于C22出 1化O7S3([M+H] +)計(jì)算值：536.05;發(fā)現(xiàn)值：536.40。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，所述組合物包含可被金屬-β-內(nèi)酰胺酶選擇性裂解的探針，所述探針包 含具有6,7_反式構(gòu)型的頭孢菌素和附連至其的可檢測(cè)的標(biāo)記物。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述探針具有式I或式II:其中，R:選自由以下組成的組:烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基團(tuán)、熒光 團(tuán)及熒光猝滅劑。3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中Ri選自由以下組成的組：甲基、乙基、異丙基、叔丁 基、芐基-及甲苯磺酰氧基_。4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物通過-0-、_N-或-S-連接被附 連至所述頭孢菌素。5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是具有以下結(jié)構(gòu)的（2-氧代-2H-色烯-7-基）（111)或（43)-2-(6-氧代-1，3-苯并噻唑-2-基）-4,5-二氫噻唑-4-羧酸 (IV)：6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述探針選自由以下組成的組：7. -種選擇性檢測(cè)金屬-β-內(nèi)酰胺酶活性的方法，所述方法包括使懷疑具有金屬-β-內(nèi) 酰胺酶活性的樣品與包含可被金屬-β_內(nèi)酰胺酶選擇性裂解的探針的組合物接觸，所述探 針包含具有6，7_反式構(gòu)型的頭孢菌素部分和可檢測(cè)的標(biāo)記物；允許金屬-β-內(nèi)酰胺酶活性 裂解所述頭孢菌素部分的有效時(shí)間段，從而從所述頭孢菌素部分釋放所述可檢測(cè)的標(biāo)記 物，藉此生成可檢測(cè)的信號(hào)；并且檢測(cè)所述信號(hào)，其中可檢測(cè)的信號(hào)指示所述樣品包含金 屬-β_內(nèi)酰胺酶活性或金屬-β_內(nèi)酰胺酶活性的來源。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述探針具有式I或式II:其中Ri選自由以下組成的組:烷基、被取代的烷基、芳族基團(tuán)、被取代的芳族基團(tuán)、熒光 團(tuán)及熒光猝滅劑。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中心選自由以下組成的組：甲基、乙基、異丙基、叔丁基、 芐基-及甲苯磺酰氧基-。10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是染料、熒光標(biāo)記物、放射性標(biāo) 記物、螢光素酶底物或猝滅劑。11. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物通過-0-、-N-或-S-連接被附連 至所述探針。12. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是具有以下結(jié)構(gòu)的（2-氧代-2H-色烯-7-基）（111)或（43)-2-(6-氧代-1，3-苯并噻唑-2-基）-4,5-二氫噻唑-4-羧酸 (IV)：13. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述探針選自由以下組成的組：14. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品是細(xì)菌培養(yǎng)物。15. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品已從動(dòng)物受試者或人受試者分離。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述樣品是由來自人受試者或動(dòng)物受試者的樣品 產(chǎn)生的細(xì)菌培養(yǎng)物。17. 如權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包含克雷伯桿菌屬物種(Klebsiella sp.) 或埃希氏桿菌屬物種(Escherichia sp.)中的至少一種。18. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是螢光素酶底物，并且所述方 法還包括使反應(yīng)混合物與螢光素酶接觸，從而在釋放的螢光素酶底物的存在下生成可檢測(cè) 的生物發(fā)光信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C07D501/14GK106061949SQ201580004972
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年1月15日
【發(fā)明人】饒江洪, 史海斌
【申請(qǐng)人】小利蘭·斯坦福大學(xué)理事會(huì)