使用質(zhì)譜檢測(cè)至少一種碳青霉烯抗性機(jī)制的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)樣品中至少一種微生物針對(duì)至少一種抗菌劑的至少一種抗性標(biāo)記的方法，其特征在于抗菌劑是碳青霉烯，且所述抗性標(biāo)記是蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或肽是來(lái)自所述微生物的蛋白質(zhì)。
【專利說(shuō)明】使用質(zhì)譜檢測(cè)至少一種碳青霉烯抗性機(jī)制的方法
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域。更精確地說(shuō)，本發(fā)明涉及用質(zhì)譜檢測(cè)樣品中至少一種微生物對(duì)碳青霉烯抗性的至少一種機(jī)制的方法。
[0002]自從巴斯德發(fā)現(xiàn)了微生物以來(lái)，微生物體以顯微鏡和生化分析來(lái)研究。這些傳統(tǒng)的方法通常冗長(zhǎng)乏味，因此很久以來(lái)一直在尋找其他分析方法。這就是為什么J.Anhalt和C.Fenselau從1975年起發(fā)起了以質(zhì)譜分析細(xì)菌[I]。
[0003]隨著這一初步工作，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法被用于微生物細(xì)胞壁中脂肪酸的研究[2]。這項(xiàng)技術(shù)廣泛采用的英語(yǔ)術(shù)語(yǔ)是FAME,即脂肪酸甲酯(Fatty Acid MethylEster) 0現(xiàn)在成為一種分類學(xué)研究的參考方法。盡管如此，它的應(yīng)用局限于某些特定的以皂化、水解和分離的方法處理樣品的實(shí)驗(yàn)室。
[0004]在1996 年，M.Claydon 等[3]以及 T.Krishnamurthy 和 P.Ross [4]的工作證明可以用MALD1-T0F(矩陣輔助的激光解吸離子化-渡越時(shí)間，Matrix Assisted LaserDesorption 1nization - Time Of Flight)質(zhì)譜鑒別不同的細(xì)菌種。該分析結(jié)合了獲取質(zhì)譜和解釋專業(yè)軟件。十分簡(jiǎn)單并且可以在幾分鐘內(nèi)得出結(jié)果。盡管如此，現(xiàn)在還只是應(yīng)用在藥物分析的實(shí)驗(yàn)室[5]。其臨床應(yīng)用現(xiàn)在還局限于鑒別細(xì)菌和酵母的種類，還沒(méi)有常規(guī)應(yīng)用于鑒別抗菌劑抗性。
[0005]為了保證最優(yōu)化的病患護(hù)理，對(duì)諸如抗生素等抗菌劑的抗性的鑒別是重要的要素。
[0006]推薦其他質(zhì)譜方法，特別是串聯(lián)質(zhì)譜，以滿足這些需要。例如，可以引用C.Fenselau等關(guān)于用四極子-TOF(Q-TOF)鑒別β -內(nèi)酰胺酶的工作[6]。
[0007]盡管如此，這些研究結(jié)果是通過(guò)通過(guò)研究?jī)x器獲得的，要求高素質(zhì)的人員，無(wú)法應(yīng)用于日常臨床。通常大于I小時(shí)/樣品的分析時(shí)間與微生物分析實(shí)驗(yàn)室的工作量是不相容的。
[0008]最近，S.Hofstadler等[7]提出了一種結(jié)合PCR擴(kuò)增微生物基因組和電噴射-TOF(ES1-TOF)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的方法。這種方法現(xiàn)在是全自動(dòng)的[8]。盡管如此，它要求PCR擴(kuò)增，其具有分子生物學(xué)固有的瑕疵，即提取產(chǎn)量，探針成本等問(wèn)題。
[0009]在這一背景下，本發(fā)明的目的在于提出一種檢測(cè)碳青霉烯抗性機(jī)制的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，也就是提供一種廉價(jià)的方法，特別是與分子生物學(xué)相比，不使用每個(gè)種特異的試劑，在短時(shí)間內(nèi)(少于I小時(shí))得出結(jié)果，不要求高素質(zhì)人員而能夠應(yīng)用于日常臨床。
[0010]為了這個(gè)目的，本發(fā)明提出了一種通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)樣品中至少一種微生物對(duì)至少一種抗菌劑的至少一種抗性機(jī)制的新方法，其特征在于:抗菌劑是碳青霉烯；以及檢測(cè)針對(duì)至少一類碳青霉烯抗生素的所述抗性機(jī)制的標(biāo)記是蛋白質(zhì)和/或多肽。
[0011]優(yōu)選地，抗性標(biāo)記是來(lái)自于所述至少一種微生物的蛋白質(zhì)。有利的是，幾種不同抗菌劑的抗性標(biāo)記可以同時(shí)檢測(cè)。
[0012]如PCT/FR2010/052181中所示，在檢測(cè)抗性機(jī)制標(biāo)記之前或同時(shí)，所述微生物的類型和/或毒力標(biāo)記能夠通過(guò)質(zhì)譜以相同的方法檢測(cè)。[0013]至少一種碳青霉烯類抗菌劑的抗性標(biāo)記理解為以所述性質(zhì)為特征的蛋白質(zhì)來(lái)源的分子。碳青霉烯是屬于β_內(nèi)酰胺家族的抗生素，其主要代表是亞胺培南、美羅培南、厄他培南和多利培南。這些分子被Bush和Jacoby分類的β -內(nèi)酰胺酶2df、2f和3a分解([9], Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 ；54 (3):969-976)。
[0014]確定對(duì)至少一種抗菌劑的抗性理解為確定微生物被抗菌劑殺死的敏感性。當(dāng)科和種不同時(shí)抗性機(jī)制涉及的蛋白也將不同。
[0015]β -內(nèi)酰胺酶一β -內(nèi)酰胺抗性細(xì)菌酶一的命名法未標(biāo)準(zhǔn)化。既根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)分為四類(Α到D)，也按照靶底物和對(duì)抑制劑的抗性功能性分組(作為概述，見(jiàn)前述Bushand Jacoby[9]) 0對(duì)分子分類，測(cè)序技術(shù)使更精確的分類成為可能:例如，已經(jīng)描述了 TEM蛋白的183種變體(標(biāo)記為TEM-1, i從I到183)。對(duì)于功能性分類,前述Bush and Jacoby提出了新的功能性亞組:
[0016]-第一組酶是屬于C類分子的頭孢菌素酶。CMY和FOX是質(zhì)粒攜帶的酶，屬于這個(gè)亞組。
[0017]-第二組酶屬于A類和D類分子。這個(gè)組自我再分為亞組2b、2be、2br、2ber、2d、2de、2df、2f等。CTX-M(2be)和TEM(包括2be、2br)是屬于這個(gè)亞組的酶。2b亞組對(duì)應(yīng)被克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的廣譜的β_內(nèi)酰胺酶。2be亞組對(duì)應(yīng)同樣也被克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的超廣譜的β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)。2br亞組對(duì)應(yīng)2b亞組中對(duì)克拉維酸、sulfobactam或三唑巴坦的抑制不敏感的β_內(nèi)酰胺酶。2bf亞組包括對(duì)碳青霉烯超廣譜的0ΧΑ。2f組對(duì)應(yīng)碳青霉烯酶β -內(nèi)酰胺酶，例如KPC。
[0018]-第三組包含水解碳青霉烯的金屬-β-內(nèi)酰胺酶，例如MP、VIM, SPM、GIM, SM、AM、KHM、D頂或 NDM。
[0019]NDM-1 β -內(nèi)酸胺酶于 2010 年被描述(Kumarasamy et al., 2010, Lancet Infect.Dis.，10:597-602)。相當(dāng)于一種金屬-β -內(nèi)酰胺酶，賦予對(duì)除氨曲南外所有β _內(nèi)酰胺的抗性。
[0020]KPCP -內(nèi)酰胺酶于 2001 年在美國(guó)被描述(Yigit et al., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:1151-1161),隨后遍及世界。相當(dāng)于A類β -內(nèi)酰胺酶,賦予對(duì)頭
孢菌素和碳青霉烯的抗性，尤其是對(duì)亞胺培南和美羅培南。
[0021]IMP β -內(nèi)酸胺酶于 1994 年在日本被描述(Osano et al., 1994, Antimicrobi0.Agents Chemother.，38:71-78),隨后遍及世界。相當(dāng)于金屬-β -內(nèi)酰胺酶,賦予對(duì)頭孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是對(duì)替莫西林和氨曲南無(wú)效。
[0022]VIM β -內(nèi)酰胺酶與1999年在歐洲被描述(Lauretti etal., 1999, Antimicrobi0.Agents Chemother., 43:1584-1590)，隨后遍及世界。相當(dāng)于金屬-β -內(nèi)酰胺酶，賦予對(duì)頭孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是對(duì)氨曲南無(wú)效。
[0023]第一個(gè)GES β -內(nèi)酰胺酶與1998年在法屬圭亞那被分離(Poirel etal., 2000, Antimicrobi0.Agents Chemother.，43:622-632)。這種酶(GES-1)賦予 ESBL抗性。從耐受GESi1-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌的第二次分離于2000年在南非完成(Poirel etal., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:2598-2603)。這種酶(GES-2)賦予對(duì)諸如亞胺培南的頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0024]INDP -內(nèi)酰胺酶首次描述于 1999 年(Bellais et al.，1999，F(xiàn)EMS Microbi0.Lett., 171:127-132)。相當(dāng)于金屬-β-內(nèi)酰胺酶，賦予對(duì)頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0025]SME β -內(nèi)酸胺酶首次描述于 1994 年(Naas et al., 1994, Antimicrobi0.AgentsChemother.，38:1262-1270)。相當(dāng)于A類β -內(nèi)酰胺酶,賦予對(duì)頭孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0026]OXAβ -內(nèi)酰胺酶(或oxacillinases)對(duì)應(yīng)D類β -內(nèi)酰胺酶。根據(jù)其的初級(jí)序列，其能夠賦予對(duì)頭孢菌素或?qū)︻^孢菌素和碳青霉烯的抗性(Poirel etal., 2010, Antimicrobi0.Agents Chemother., 54:24-38)。
[0027]本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)細(xì)菌中對(duì)于碳青霉烯的抗性機(jī)制。因此，例如，可以根據(jù)本發(fā)明的方法在其中找到對(duì)碳青霉烯的抗性機(jī)制的細(xì)菌的非窮舉性實(shí)例有:大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、芽抱桿菌(Bacillus spp)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、氣單胞菌(Aeromonas spp)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、假單胞菌(Pseudomonasotitidis)以及陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae),更廣泛地說(shuō)，攜帶blaNDM-Ι或blaKPC抗性基因的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)微生物。應(yīng)該進(jìn)一步注意的是已知抗碳青霉烯的菌株也對(duì)頭孢菌素和青霉素有抗性。
[0028]因此，根據(jù)本發(fā)明的方法也使檢測(cè)對(duì)所述抗生素的抗性機(jī)制成為可能。
[0029]本發(fā)明的方法可以應(yīng)用的樣品是任何容許含有靶微生物的樣品。樣品可以是生物學(xué)來(lái)源的，無(wú)論是動(dòng)物，蔬菜還是人。在這個(gè)實(shí)施方式中，相當(dāng)于生物流體樣品(例如全血、血清、血漿、尿液、腦脊液、組織分泌物)、組織樣品或者分離的細(xì)胞。在細(xì)菌β -內(nèi)酰胺抗性機(jī)制的標(biāo)記能夠用于檢測(cè)或者在分析前可以進(jìn)行富集、提取、濃縮、純化、培養(yǎng)等根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備的樣品可以使用。
[0030]樣品可以是工業(yè)來(lái)源或者根據(jù)非窮舉的列表可以是空氣樣品、水樣品、表面樣品、制成品的一部分或者食物產(chǎn)品。在食物樣品中，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，可以包括乳制品(酸奶、奶酪)樣品、肉、魚(yú)、蛋、水果、蔬菜、水、飲料(牛奶、果汁、蘇打水等)。這些食物樣品還可以來(lái)自醬或即食餐。最后，食物樣品可以來(lái)自動(dòng)物飼料，例如動(dòng)物膳食。
[0031]在質(zhì)譜檢測(cè)的上游，優(yōu)選地，待分析的樣品經(jīng)過(guò)預(yù)處理使樣品中存在的完整蛋白質(zhì)片段化而產(chǎn)生多肽，例如用蛋白酶消化或化學(xué)試劑反應(yīng)。事實(shí)上，裂解蛋白質(zhì)可以通過(guò)物理化學(xué)、生物學(xué)或者兩者結(jié)合處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。在可用的處理中，可以提及以羥自由基處理，特別是H2O2。羥自由基處理導(dǎo)致肽鍵的切開(kāi)在任何蛋白質(zhì)的肽鍵位置隨機(jī)發(fā)生。羥自由基濃度決定裂解數(shù)，以及所得到的肽段的長(zhǎng)度。還可以用其他化學(xué)處理，例如特異性在甲硫氨酰殘基羧基處切開(kāi)肽鍵的溴化氰(CNBr)處理。也可以在三氟乙酸中加熱蛋白質(zhì)溶液到1000°C進(jìn)行天冬氨酰殘基上的部分酸裂解。
[0032]盡管如此，酶解處理蛋白優(yōu)先于物理化學(xué)處理，因?yàn)槠涓鼙Ｗo(hù)蛋白結(jié)構(gòu)并且更易控制?！懊附狻币馕吨粋€(gè)或者多個(gè)酶在正確的條件下單獨(dú)或聯(lián)合的反應(yīng)。實(shí)施蛋白水解的酶，即蛋白酶在特定位置切割蛋白。每種蛋白酶一般識(shí)別一種氨基酸序列，并總是進(jìn)行同樣的切割。某些蛋白酶識(shí)別一個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸的序列并在其間裂解，而其他蛋白酶只識(shí)別更長(zhǎng)的序列。這些蛋白酶可以是內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶。在已知的蛋白酶中，包括如在W02005/098071中描述的:[0033]-特異性酶,例如胰蛋白酶(trypsin)在Arg和Lys的羧基處切斷肽鍵,細(xì)胞內(nèi)溶素(endolysin)在賴氨酸羰基處裂解肽鍵,糜蛋白酶(chymotrypsin)在芳香殘基(Phe、Tyr和Trp)羧基處水解肽鍵，胃蛋白酶(pepsin)在芳香殘基(Phe、Tyr和Trp)氨基處切割,來(lái)源于Staphylococcus aureus V8菌株的蛋白酶V8在Glu殘基羧基處裂解肽鍵；
[0034]-非特異性酶，例如來(lái)自細(xì)菌Bacillusthermoproteolyticus的嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)在疏水氨基酸(Xaa_The、Xaa-1Ie> Xaa-Phe)氨基端水解肽鍵，屬于細(xì)菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和鏈霉蛋白酶(pronase)實(shí)際上水解所有肽鍵并能在控制的反應(yīng)條件(酶濃度和反應(yīng)時(shí)間)下把蛋白轉(zhuǎn)化成寡肽。
[0035]如果反應(yīng)模式可以兼容，有些蛋白酶可以同時(shí)或相繼使用。在本發(fā)明范圍內(nèi)，樣品的消化優(yōu)選的由蛋白酶執(zhí)行，例如胰蛋白酶。
[0036]用化學(xué)試劑或蛋白酶產(chǎn)生多肽能通過(guò)溶液中簡(jiǎn)單反應(yīng)的方法實(shí)現(xiàn)。還可以通過(guò)微波爐[10]或高壓[11]，甚至使用超聲儀器[12]實(shí)現(xiàn)。在后面的三個(gè)實(shí)施方式中，方案快了很多。
[0037]在如此獲得的多肽中，蛋白特異性的多肽被稱為蛋白質(zhì)代表性(proteotypic)肽，也就是將要被質(zhì)譜分析的。
[0038]根據(jù)本發(fā)明細(xì)菌對(duì)碳青霉烯的抗性機(jī)制標(biāo)記是來(lái)自可以在其中找到抗碳青霉烯機(jī)制的細(xì)菌的蛋白。尤其是，所述蛋白被優(yōu)選地使用酶，更優(yōu)選地使用胰蛋白酶消化成多肽。
[0039]相似的是，含有細(xì)菌抗碳青霉烯機(jī)制特征性蛋白標(biāo)記的樣品可以預(yù)處理以達(dá)到純化的目的。純化預(yù)處理可以在如上所述的多肽產(chǎn)生步驟之前或之后進(jìn)行。
[0040]樣品純化處理在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是眾所周知的，尤其是采用離心、過(guò)濾、電泳或?qū)游黾夹g(shù)。這些分離技術(shù)可以單獨(dú)使用或者彼此聯(lián)用以獲得多維的分離。例如，多維層析可以如T.Fortin等[13]或H.Keshishian等[14]所述,通過(guò)離子交換層析和反相層析的聯(lián)用來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這些文章中，層析介質(zhì)可以是柱或者筒(固相萃取)。蛋白質(zhì)代表性肽的電泳或?qū)游黾?jí)份(或一維或多維層析的保留時(shí)間)是每種肽的特征，因此采用這些技術(shù)使選擇蛋白質(zhì)代表性肽或多肽進(jìn)行分析成為可能。這樣區(qū)別產(chǎn)生的多肽可以增加后續(xù)質(zhì)譜分析的特異性。
[0041]目的在于分離多肽的電泳或?qū)游黾夹g(shù)的一個(gè)變形在于特異性純化N-糖肽([15]以及專利申請(qǐng)W02008/066629)。盡管如此，這樣的純化只可以定量進(jìn)行了 N-糖基化的翻譯后修飾的多肽。不是所有的蛋白都會(huì)糖基化，這限制了其應(yīng)用。
[0042]作為分析和檢測(cè)不同類型分子的有力工具，用于本發(fā)明方法的質(zhì)譜是本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的。一般來(lái)說(shuō)，任何可以被電離的分子都可以根據(jù)其分子量由質(zhì)譜儀檢測(cè)。根據(jù)被測(cè)分子的自然狀態(tài)，無(wú)論蛋白還是代謝源，某些質(zhì)譜技術(shù)會(huì)更合適。然而，無(wú)論用質(zhì)譜方法檢測(cè)什么，后面都包括把靶分子電離為所謂分子離子的步驟，即本實(shí)施方式中，電離特征標(biāo)記的步驟和分離質(zhì)譜獲得的分子離子的步驟。
[0043]因此，所有的質(zhì)譜包含:
[0044]-用于電離待分析樣品中存在的標(biāo)記的電離源，即給予這些標(biāo)記正或負(fù)電荷；
[0045]-用于根據(jù)其荷質(zhì)比分離電離標(biāo)記或分子離子質(zhì)量分析儀；
[0046]-用于測(cè)量分子離子直接產(chǎn)生的信號(hào)或以后述方法自分子離子產(chǎn)生的離子的檢測(cè)儀。
[0047]電離步驟(采用質(zhì)譜所必需的)可以通過(guò)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。電離源可以使待分析分子轉(zhuǎn)化成氣態(tài)的并且電離的狀態(tài)。電離源可以用正電荷模式研究陽(yáng)離子，或者負(fù)電荷模式研究陰離子。存在幾種類型的電離源，可基于要尋找的結(jié)果和要分析的分子使用這些電離源。尤其是包括:
[0048]-電子電離(EI)、化學(xué)電離(Cl)和解吸化學(xué)電離(DCI)；
[0049]-快原子轟擊(FAB)、亞穩(wěn)態(tài)原子轟擊(MAB)或離子轟擊(SMS，LSMS)；
[0050]-電感耦合等離子體(ICP)；
[0051]-大氣壓化學(xué)電離(APCI)和大氣壓光電離(APPI)；
[0052]-Electronebulisation 或點(diǎn)噴射(ESI)；
[0053]-矩陣輔助激光解吸/電離(MALDI)、表面活化激光解吸/電離(SELDI)或硅解吸/ 電離(DIOS)；
[0054]-與亞穩(wěn)態(tài)種相互作用的電離/解吸(DART)。
[0055]具體而言，電離進(jìn)行如下:把含有靶分子的樣品導(dǎo)入電離源，在此分子在氣態(tài)下被離子化并轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)最初分子的分子離子。電噴射電離(ESI)源可以通過(guò)使分子從液態(tài)逐漸變氣態(tài)而電離。在正電荷模式中，如此得到的存在于液相中的對(duì)應(yīng)于分子的有1、2甚至3或者更多的額外質(zhì)子的分子離子帶有1、2甚至3或者更多的電荷。例如，當(dāng)靶分子是一種蛋白，分離靶蛋白后獲得的蛋白質(zhì)代表性肽使用電噴射源在正電荷模式的電離產(chǎn)生氣相的帶1、2甚至3或者更多的額外質(zhì)子多肽離子，其帶有1、2甚至3或者更多的電荷，并可以從液相移動(dòng)到氣相[16]。這類源尤其適合先用反相液相色譜分離獲得的靶分子或蛋白質(zhì)代表性肽。然而，樣品中存在的分子的電離得率(ionisation yield)會(huì)隨著濃度和存在的不同物種的天然狀態(tài)而改變。這一現(xiàn)象導(dǎo)致了本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的矩陣效應(yīng)。
[0056]MALDI電離源可以使來(lái)自固態(tài)樣品的分子電離。
[0057]根據(jù)荷質(zhì)比分離離子化標(biāo)記的步驟在質(zhì)量分析器中進(jìn)行，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何質(zhì)量分析器都適用。其可以由低分辨率分析器、四極子(quadripole或quadrupole (Q))、3D 離子陷講(iron trap, IT)或線性離子陷講(linear iron trap、LIT)也稱離子陷阱、高分辨率分析器組成，高分辨率分析器使其可以測(cè)量被分析物的確切質(zhì)量，并且特別使用了連接于扇形電場(chǎng)的扇形磁場(chǎng)、渡越時(shí)間(TOF)、傅里葉變換離子回旋加速(FT-1CR)、軌道阱。
[0058]依靠其荷質(zhì)比的分子離子的分離可以只進(jìn)行一次(單質(zhì)譜或MS)，或者可以進(jìn)行幾次連續(xù)的分離。當(dāng)執(zhí)行了兩次連續(xù)的MS分離時(shí)，該分析被稱為MS/MS或MS2。當(dāng)執(zhí)行了三次連續(xù)的MS分離時(shí)，該分析被稱為MS/MS/MS或MS3，一般地說(shuō)，當(dāng)執(zhí)行了 η次連續(xù)的MS分尚時(shí)，該分析被稱為MSn。
[0059]在使用了幾次連續(xù)的分離的技術(shù)之中，檢測(cè)或分析單一靶分子的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Selected Reaction Monitoring, SRM)模式,或者檢測(cè)或分析數(shù)種祀分子的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式是MS2分離的具體應(yīng)用。近似地,MRM3模式是MS/MS/MS分離的具體應(yīng)用。這就稱為靶向質(zhì)譜。
[0060]在單MS模式檢測(cè)的情況下，所得到的的分子離子的荷質(zhì)比與待檢測(cè)的分子有關(guān)。在MS/MS模式檢測(cè)的情況下，與MS分析相比，基本上要添加兩步:[0061]-分子離子(后稱為前體離子，precursorions)的破碎，以產(chǎn)生所謂第一代碎片離子(fragment ions),以及
[0062]-根據(jù)其與前體離子荷質(zhì)比(m/z)相應(yīng)的質(zhì)量(m/z)2、比例(m/zh分離所謂的第一代碎片離子。
[0063]因此，這樣獲得的第一代碎片離子的荷質(zhì)比與待測(cè)的靶分子有關(guān)。第一代碎片離子是來(lái)源于前體離子，經(jīng)過(guò)破碎步驟，并且其荷質(zhì)比m/z不同于前體離子的一種離子。
[0064](111/2)2和(m/zh對(duì)被稱為轉(zhuǎn)換(transitions),代表待測(cè)的典型離子。
[0065]待測(cè)的與靶分子有關(guān)的典型離子的選擇是由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)注方法進(jìn)行的。在再現(xiàn)性和可靠性方面，其選擇有利于帶來(lái)最敏感、最特異以及最有魯棒性的實(shí)驗(yàn)可能性。在所發(fā)展的用于選擇蛋白質(zhì)代表性肽(m/z) i的方法中，選擇基本上是基于響應(yīng)強(qiáng)度的。更具體地說(shuō)，可以參考V.Fusaro et al.[17]。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用諸如來(lái)自AppliedBiosystems或MRMaid的MIDAS和MRM Pilot軟件[18]的市場(chǎng)上可以買到的軟件可以預(yù)測(cè)所有可能的轉(zhuǎn)換對(duì)。還可以使用F Desiere et al.[19]構(gòu)建的稱為PeptideAtlas的數(shù)據(jù)庫(kù)編輯科學(xué)界所描述的所有肽的MRM轉(zhuǎn)換。P印tideAtlas數(shù)據(jù)庫(kù)可以在因特網(wǎng)上免費(fèi)使用。對(duì)于非蛋白質(zhì)分子，也可以使用數(shù)據(jù)庫(kù)，例如可通過(guò)Applied Biosystems公司(美國(guó))的Cliquid軟件進(jìn)入的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0066]—種選擇蛋白質(zhì)代表性肽的(m/z)2和(HiA)1的替換方法在于使用在其他研究中得到的MS/MS破碎光譜。例如，該研究可以是蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)和堅(jiān)定生物標(biāo)記的各階段。這一方法是由Thermo Scientific在用戶會(huì)議中提出的[18]。這使得從通過(guò)SIEVE軟件(Thermo Scientific )檢測(cè)而鑒定的肽產(chǎn)生候選轉(zhuǎn)換清單成為可能。J.Mead等[18]詳細(xì)說(shuō)明了選擇離子的(111/2)2和(m/zh確定標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0067]-必須避免有內(nèi)部裂解位點(diǎn)的肽，即內(nèi)部有賴氨酸和精氨酸的肽，除非賴氨酸或精氨酸后是脯氨酸；
[0068]-必須避免有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因?yàn)闀?huì)脫氨基；
[0069]-必須避免N端有谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因?yàn)闀?huì)自發(fā)環(huán)化；
[0070]-必須避免有甲硫氨酸的肽，因?yàn)闀?huì)被氧化；
[0071]-必須避免有半胱氨酸的肽，因?yàn)闀?huì)在潛在的變性、還原和封閉硫醇功能的步驟中被不可逆轉(zhuǎn)的修飾；
[0072]-有脯氨酸的肽被認(rèn)為是有利的，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生在MS/MS中非常強(qiáng)烈單峰的集中片段。然而，非常強(qiáng)烈的單峰片段并不能證實(shí)復(fù)雜混合物中轉(zhuǎn)換的同一性。事實(shí)上，只有同時(shí)出現(xiàn)幾個(gè)特征碎片才可以證明所找的前體離子確實(shí)被檢測(cè)到；
[0073]-必須避免在臨近C端的位置(位置η-1)或相對(duì)于C端的第二位(位置n_2)為脯氨酸的肽，因?yàn)樵谶@種情況下一般認(rèn)為第一代肽片段太小而不具備充分特異性；
[0074]-優(yōu)選地選擇比前體(m/z)!更大的片段以增強(qiáng)特異性。為了這一目的，必須選擇雙電荷前體離子和最集中的(m/z) i大于前體的第一代離子片段，即單電荷第一代碎片離子。
[0075]對(duì)所選的前體離子的破碎是在破碎單元中進(jìn)行的，例如三連四極子模型、離子陷阱模型或渡越時(shí)間模型，這些也能分離離子。破碎的進(jìn)行照例是在電場(chǎng)中與惰性氣體(例如IS氣和氮?dú)?碰撞，用強(qiáng)光源進(jìn)行光激發(fā)或者光分解，與電子或放射物碰撞，應(yīng)用潛在的差異(例如在渡越時(shí)間管中)，或者其他的活化模式。電場(chǎng)的性質(zhì)決定了破碎的強(qiáng)度和性質(zhì)。因此，在由惰性氣體存在時(shí)應(yīng)用的電場(chǎng)，例如在四極子中，決定了提供給離子的碰撞能。本領(lǐng)域技術(shù)人員將優(yōu)化碰撞能以提高待測(cè)的轉(zhuǎn)換的敏感性。舉例來(lái)說(shuō)，在ABSCIEX OTRAP.K,: 5500質(zhì)譜(Applied Biosystems公司，美國(guó)福斯特城)的q2中，可以于5到ISOe-V之間改變碰撞能。相似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將優(yōu)化碰撞步驟的持續(xù)時(shí)間和激發(fā)能(例如在離子陷阱中)以進(jìn)行最敏感的實(shí)驗(yàn)。舉例來(lái)說(shuō)，在AB SCIEX QTRAP(R) 5500質(zhì)譜(Applied Biosystems公司)的Q3中，持續(xù)時(shí)間(稱為激發(fā)時(shí)間)在0.010到50ms之間，激發(fā)能在O到I (任意單位)之間可以進(jìn)行改變。
[0076]最后，在常規(guī)儀器中檢測(cè)所選典型離子，特別是使用探測(cè)器和處理系統(tǒng)的方法。探測(cè)器收集離子并產(chǎn)生電信號(hào)，其強(qiáng)度取決于收集的離子的數(shù)量。得到的信號(hào)隨后被放大以使其可以被計(jì)算機(jī)處理。計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理可以集合地轉(zhuǎn)換質(zhì)譜探測(cè)器得到的信息。
[0077]SRM模式甚或MRM模式的原理是特別地選擇一個(gè)前體離子，將其破碎，然后特別地選擇一個(gè)碎片離子。對(duì)于這些應(yīng)用，三連四極子或偶聯(lián)的三連四極子/離子陷阱儀器被普遍使用。
[0078]在用于MS2模式的三連四極子(Qlq2Q3)的個(gè)案中，以分析或檢查靶蛋白為目的，第一個(gè)四極子(Ql)可以根據(jù)荷質(zhì)比(m/z)過(guò)濾在較早的消化步驟中獲得的待測(cè)蛋白質(zhì)特有的蛋白質(zhì)代表性肽相應(yīng)的分子離子。只有與要找的蛋白質(zhì)代表性肽荷質(zhì)比相同的肽才被散發(fā)到第二個(gè)四極子(q2)并作為接下來(lái)破碎的前體離子，這里的荷質(zhì)比被稱為(m/zh。q2分析器能夠使荷質(zhì)比為的肽破碎成為第一代碎片離子。破碎一般通過(guò)前體肽與諸如氮?dú)饣驓鍤獾亩栊詺怏w在q2中碰撞獲得。第一代碎片離子散發(fā)到第三個(gè)四極子(Q3)中，其根據(jù)特定的稱為(m/z)2的荷質(zhì)比過(guò)濾第一代碎片離子。只有荷質(zhì)比與要找的蛋白質(zhì)代表性肽的(m/z)2相同的碎片離子被散發(fā)到探測(cè)器中以檢測(cè)甚或定量。
[0079]當(dāng)本發(fā)明的方法采用的質(zhì)譜是串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS spectrometry) (MS2、MS3、MS4或MS5)時(shí)，可以將幾個(gè)質(zhì)量分析器連在另一個(gè)上。例如，第一個(gè)分析器分離離子，碰撞單元使其可以破碎離子，第二個(gè)分析器分離碎片離子。諸如離子陷阱和FT-1CR的某些分析器把幾個(gè)分析器組合成一個(gè)，使其可以破碎離子并直接分析碎片。
[0080]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法包括以下特征中的一個(gè)或幾個(gè):
[0081]-為得到至少一種抗菌劑的潛在抗性的屬性而采用的質(zhì)譜是MS/MS譜，其有利于產(chǎn)生待檢測(cè)或定量的分子特異的碎片，因而有利于向試驗(yàn)方法提供極大的特異性；
[0082]-MS/MS譜是MRM，這有利于利用質(zhì)譜儀的幾十毫秒的分析循環(huán)時(shí)間，使其能夠以高度的敏感性以多路復(fù)用方式檢測(cè)或定量大量不同的分子。
[0083]-同時(shí)優(yōu)選地，在適用的情況下，類型屬性和毒力因子的確定和對(duì)至少一種抗菌劑的抗性的標(biāo)記的確定是在同一個(gè)質(zhì)譜設(shè)備中進(jìn)行的，這有利于減少分析時(shí)間和設(shè)備的花費(fèi)，還會(huì)促進(jìn)結(jié)果的處理和產(chǎn)出。
[0084]除確定抗菌劑的抗性外，還需要鑒別待測(cè)樣品中的微生物。
[0085]鑒別微生物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如Murray P.R.等在臨床微生物學(xué)手冊(cè)(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版中所描述的那樣,尤其是在第一卷第三部分第十五和十六章關(guān)于細(xì)菌和酵母、第二卷第六部分第八十二章關(guān)于病毒、第二卷第十部分第一百三十五章關(guān)于原生動(dòng)物的內(nèi)容中。作為常規(guī)鑒別方法的例子，上述內(nèi)容可以包括生物屬性的確定，例如，用Vitek2(bi0M6rieuX)鑒別卡，甚或以基于某些基因的存在和其序列的研究的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，使用分子生物學(xué)技術(shù)。
[0086]鑒別可以從鑒別的樣品直接進(jìn)行，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法用為要找的微生物種量身定做的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)樣品中含有的微生物，如MurrayP.R.等在臨床微生物學(xué)手冊(cè)(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版第一卷第三部分第十四章所描述的，特別是在第一卷第四部分第二十一章中關(guān)于細(xì)菌、第二卷第六部分第八十一張關(guān)于病毒、第二卷第八部分第一百一十七章關(guān)于酵母和第二卷第十部分第一百三十四章關(guān)于原生動(dòng)物的內(nèi)容中。
[0087]因此，一般來(lái)說(shuō)，在使用生物化學(xué)方法鑒別樣品中細(xì)菌的情況下，首先需要獲得純培養(yǎng)物形式的細(xì)菌，例如在接種于瓊脂之后。在特定情況下分子生物學(xué)(PCR)可以直接用于待分析樣品。
[0088]除了培養(yǎng)微生物，還可以用活化表面的方法直接從樣品中捕獲以濃縮微生物。W.-J.Chen等[10]描述了這樣一種方法，他們以添加有活化表面的磁珠Fe304/Ti02捕獲了不同種的細(xì)菌。還可以用其他方法進(jìn)行捕獲，例如用凝集素(lectin)，或者抗體，或者萬(wàn)古霉素捕獲。捕獲可以濃縮微生物，從而減少甚至排除培養(yǎng)步驟。這相當(dāng)大的節(jié)省了時(shí)間。
[0089]鑒別還可以用質(zhì)譜進(jìn)行，根據(jù)前面描述的技術(shù)，優(yōu)選用MS、MS/MS甚或用構(gòu)成本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的連接了 MS/MS譜的MS。在這種情況下，樣品也可以經(jīng)受培養(yǎng)的步驟，例如接種到瓊脂上。
[0090]MS鑒別方法的使用的進(jìn)步在于可以在幾分鐘內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)，而且要求單分析器的質(zhì)譜儀，也就是說(shuō)比串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS的設(shè)備簡(jiǎn)單。。
[0091]通過(guò)連接了 MS/MS譜的MS鑒別方法的使用也是更進(jìn)步的?？梢詸z查MS所發(fā)現(xiàn)的離子的同一性，這樣就提高了分析的特異性。
`[0092]MRM型MS/MS鑒別方法的使用的好處在于比常規(guī)的連接了 MS/MS譜的MS方法更敏感更簡(jiǎn)單。這種方法既不要求高性能軟件以處理獲得MS譜和MS/MS譜之間的信息，也不要求在設(shè)置連接MS和MS/MS譜的機(jī)器參數(shù)時(shí)做改變。
[0093]如S.Vaidyanathan等[26]或者R.Everley等[27]描述的那樣,用MS鑒別的方法可以和電噴射源一起用于層析分離后的粗樣品。這樣，不同的m/z范圍可以鑒別微生物。
S.Vaidyanathan 等使用了 200 到 2000Th 之間的范圍，而 R.Everley 等使用了 620 到 2450Th之間的范圍。質(zhì)譜還可以去卷積以獲取蛋白的質(zhì)量而不依靠其電荷狀態(tài)。因此R.Everley等使用大約5,000到50，OOODa之間的質(zhì)量。或者，使用MS的鑒別方法也可以如Claydon等[3]和T.Krishnamurthy與P.Ross [4]所描述的那樣采用添加MALD1-T0F。分析結(jié)合了質(zhì)譜的獲取和專業(yè)軟件的翻譯。非常簡(jiǎn)單且能夠在幾分鐘內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)。這種鑒別方法在醫(yī)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室中越來(lái)越廣泛傳播。
[0094]通過(guò)樣品中存在的其蛋白采用連接MS/MS的MS鑒別細(xì)菌被很多團(tuán)隊(duì)廣泛應(yīng)用。舉例來(lái)說(shuō)，上述包括Manes N.等[29]最近的工作，他們研究腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的妝組(peptidome),或者 R.Nandakumar 等[30]或 L.Hernychova 等[31]的工作，他們了細(xì)菌的以胰蛋白酶進(jìn)行蛋白消化后的蛋白質(zhì)組。傳統(tǒng)的方法包括i )獲得質(zhì)譜，? )依次選擇質(zhì)譜中獲得的有強(qiáng)烈信號(hào)的每個(gè)前體離子，iii)依次破碎每個(gè)前體離子并獲得其 MS/MS 譜，iv )通過(guò)諸如 Mascot (Matrix Science、London、United Kingdom)或 SEQUEST (Thermo Scientific、Waltham、United States of America)的軟件查詢諸如SffISS-PROT或NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，以鑒別有很大可能性與MS/MS譜發(fā)現(xiàn)的肽相匹配的肽。如果鑒別出種特征的蛋白質(zhì)或多肽，這種方法就可以導(dǎo)致微生物的鑒別。
[0095]使用質(zhì)譜的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，在細(xì)菌對(duì)內(nèi)酰胺抗性機(jī)制的標(biāo)記的實(shí)施方式中，其對(duì)定量分子尤其有效。有鑒于此，使用了電流強(qiáng)度檢測(cè)，其與靶分子的量是成比例的。因此，測(cè)量的電流強(qiáng)度可以作為定量方法使確定存在的靶分子的量成為可能，這個(gè)量的特征在于以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位mol/m3或kg/m3、或者這些單位的倍數(shù)或分?jǐn)?shù)、或者國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位的通常的派生物(其中包括倍數(shù)或分?jǐn)?shù))表達(dá)。舉一個(gè)非限制性的例子，定量方法的特征單位諸如 ng/ml 或 fmol/L.[0096]然而，必須進(jìn)行標(biāo)定以使相當(dāng)于檢測(cè)的離子所引發(fā)的電流強(qiáng)度的測(cè)量的峰面積與待測(cè)的靶分子的量相關(guān)聯(lián)。為了這個(gè)目的，在本發(fā)明的架構(gòu)中，采用質(zhì)樸中常用的標(biāo)定。MRM實(shí)驗(yàn)通常以添加外參或者優(yōu)選地添加內(nèi)參(例如T.Fortin等[13]所描述的)來(lái)標(biāo)定。如果靶分子是使分析感興趣的分子成為可能的蛋白質(zhì)代表性肽，定量方法和靶蛋白質(zhì)代表性肽(繼而是感興趣的蛋白)的量的關(guān)聯(lián)是通過(guò)相對(duì)于其檢測(cè)的量已知的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)標(biāo)定測(cè)量到的信號(hào)而獲得的。標(biāo)定可以用標(biāo)定曲線進(jìn)行，例如以連續(xù)的注射不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)代表性肽(外標(biāo)定)，或者優(yōu)選的用重肽(heavy peptide)作為內(nèi)參進(jìn)行內(nèi)標(biāo)定，例如根據(jù)如下所述的AQUA、QconCAT或PSAQ法。“重肽”理解為蛋白質(zhì)代表性肽相應(yīng)的肽，但是其中的一或幾個(gè)碳12原子(12C)被碳13 (13C)取代，并且/或者一或幾個(gè)氮14原子(14N)被氮15 (15N)取代。
[0097]在美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0229283中也提出將重肽用作內(nèi)參(AQUA)。原理是以含有較天然的同位素更重的同位素的氨基酸人工合成蛋白質(zhì)代表性肽。例如，這些氨基酸是通過(guò)以碳13(13C)取代碳12原子(12C),或者以氮15 (15N)取代氮14原子(14N)獲得的。如此合成的人工肽(AQUA)具有與天然肽嚴(yán)格相同的物理化學(xué)性質(zhì)(除了更大的質(zhì)量)。通常在質(zhì)譜分析的上游，例如在引起感興趣的蛋白的裂解的處理和處理后獲得的肽的分餾步驟之間，人工肽以給定濃度添加到樣品。這樣，AQUA肽與待分析的天然肽在肽分餾期間共純化。于是，這兩種肽被同時(shí)注入質(zhì)譜儀以檢測(cè)。然后它們?cè)陔婋x源中經(jīng)歷同樣的電離得率。天然肽和已知濃度的AQUA肽的峰面積的比較，可以計(jì)算天然肽的濃度，從而得到待測(cè)蛋白的濃度。AQUA技術(shù)的一個(gè)變型由J.-M.Pratt等[32]以QconCAT的名稱提出。這個(gè)變型在專利申請(qǐng)W02006/128492中也進(jìn)行了描述。它由連接各種AQUA肽和產(chǎn)生重重組蛋白形式的人工多肽組成。重組蛋白以含有重同位素的氨基酸合成。用這種方法可以以較低的開(kāi)銷獲得標(biāo)定同時(shí)進(jìn)行的幾個(gè)蛋白的檢測(cè)的參照。QconCAT參照一開(kāi)始即被加入，在引起蛋白的裂解的處理上游，如果存在蛋白質(zhì)分餾、變性、還原和封閉蛋白硫醇功能的步驟，則在其之前。因此，QconCAT參照與天然蛋白經(jīng)歷同樣的引發(fā)蛋白裂解的處理周期，這使其可以從引發(fā)蛋白裂解的步驟開(kāi)始顧及得率。事實(shí)上，天然蛋白的處理，尤其是消化可能并不完全。在這種情況下，使用AQUA參照會(huì)導(dǎo)致低估天然蛋白的量。因此為了完全的檢測(cè)，可能從引發(fā)蛋白裂解的步驟開(kāi)始顧及得率是重要的。然而，V.Brun等[33]表示QconCAT參照有時(shí)不能完全再現(xiàn)處理的得率，尤其是消化天然蛋白，無(wú)疑是因?yàn)榕cQconCAT蛋白的三維構(gòu)象不同。
[0098]在此之后，V.Brun等[33]提出使用被稱為PSAQ的方法，并在專利申請(qǐng)W02008/145763中進(jìn)行描述。在這個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)參是與天然蛋白的序列相同的重組蛋白，但以中氨基酸合成。合成實(shí)在體外以重氨基酸進(jìn)行的。這一參照具有與天然肽嚴(yán)格相同的物理化學(xué)性質(zhì)(除了更大的質(zhì)量)。參照一開(kāi)始即被加入，當(dāng)存在蛋白分餾步驟時(shí)，則在其之前。PSAQ展現(xiàn)出與天然蛋白同樣的處理得率，尤其是消化處理。如果進(jìn)行肽分餾步驟，裂解后獲得的重肽也與天然肽共純化。于是，兩種肽同時(shí)被注入質(zhì)譜儀以定量分析。然后，它們?cè)陔婋x源中經(jīng)歷相同的電離得率。PSAQ方法中比較天然肽和參照肽可以顧及分析方法中所有步驟地計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。[0099]所有這些名為AQUA、QconCAT或PSAQ或其他標(biāo)定技術(shù)，用于質(zhì)譜分析尤其是MRM或MS分析的技術(shù)可以用于在本發(fā)明構(gòu)架范圍內(nèi)進(jìn)行標(biāo)定。
[0100]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)方法中所用的質(zhì)譜是MS/MS。更加優(yōu)選地，質(zhì)譜是MRM。
[0101]本發(fā)明的方法可以檢測(cè)對(duì)碳青霉烯的抗性，其特征在于檢測(cè)至少一種肽作為抗性標(biāo)記。優(yōu)選地，所述抗性標(biāo)記肽從蛋白質(zhì)NDM、KPC、GES、IMP, IND、SME, VIM或OXA中選擇。
[0102]具體而言，檢測(cè)一種由NDM蛋白的表達(dá)引發(fā)的抗碳青霉烯的機(jī)制，其特征在于檢測(cè)至少一種選自NDM蛋白及其不同序列變體SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.1078到SEQ IDN0.1080 的肽。
[0103]SEQ ID N0.1:
[0104]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0105]SEQ ID N0.1078
[0106]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMAGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNL⑶ADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0107]SEQ ID N0.1079
[0108]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMEIODQRFGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLLVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGLVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0109]SEQ ID N0.1080
[0110]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0111]優(yōu)選地，所述從序列為SEQ ID N0.2到SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.1083的肽中選
擇的肽定義如下:
[0112]
【權(quán)利要求】
1.一種通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)樣品中至少一種微生物針對(duì)至少一種抗菌劑的至少一種抗性標(biāo)記的方法，其特征在于: a)抗菌劑是碳青霉烯；以及 b)所述抗性標(biāo)記是蛋白質(zhì)或肽。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中所述質(zhì)譜是串聯(lián)質(zhì)譜。
3.權(quán)利要求2的檢測(cè)方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜是多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是來(lái)源于所述至少一種微生物的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的檢測(cè)方法，其中來(lái)源于所述微生物的蛋白質(zhì)被消化成肽。
6.權(quán)利要求5的檢測(cè)方法，其中用酶進(jìn)行所述消化。
7.權(quán)利要求6的檢測(cè)方法，其中所述酶是胰蛋白酶。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是NDM、KPC、GES、IMP,IND、SME、VIM或OXA型的蛋白質(zhì)或肽。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.2到 SEQ ID N0.9 以及 SEQ ID N0.1083 的肽的 NDM 肽。
10.權(quán)利要求9的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.2、SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.7 的肽的 NDM 標(biāo)記。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.20 到 SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.1094、SEQ ID N0.1096 和 SEQ ID N0.1097 的肽的 KPC肽。
12.權(quán)利要求11的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.20、SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.31 或者 SEQID N0.32的肽的KPC標(biāo)記。
13.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.51、SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.54到SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.61到SEQ ID N0.75、SEQID N0.77 到 SEQ ID N0.79 的肽的 GES 標(biāo)記。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.51、61、64、70、73、74、79的肽的GES標(biāo)記。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.54、55、66、67、68、69、71、77、78 的肽的 GES 標(biāo)記。
16.權(quán)利要求1-8的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.106、SEQID N0.108 到 SEQ ID N0.130,SEQ ID N0.133 到 SEQ ID N0.173,SEQ ID N0.175 到 SEQ IDN0.180的肽的IMP標(biāo)記。
17.權(quán)利要求16的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.106,SEQ IDN0.108、SEQ ID N0.109、SEQ ID N0.110、SEQ ID N0.112、SEQ ID N0.113、SEQ ID N0.115、SEQ ID N0.116、SEQ ID N0.117、SEQ ID N0.118、SEQ ID N0.121、SEQ ID N0.124、SEQ IDN0.126、SEQ ID N0.127、SEQ ID N0.128、SEQ ID N0.129、SEQ ID N0.130、SEQ ID N0.133、SEQ ID N0.134、SEQ ID N0.135、SEQ ID N0.136、SEQ ID N0.137、SEQ ID N0.138、SEQ IDN0.139、SEQ ID N0.140、SEQ ID N0.141、SEQ ID N0.142、SEQ ID N0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.145、SEQ ID N0.146、SEQ ID N0.147、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ IDN0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.152、SEQ ID N0.153、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.157、SEQ ID N0.158、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.160、SEQ IDN0.161、SEQ ID N0.162、SEQ ID N0.163、SEQ ID N0.164、SEQ ID N0.165、SEQ ID N0.166、SEQ ID N0.167、SEQ ID N0.168、SEQ ID N0.169、SEQ ID N0.170、SEQ ID N0.171、SEQ IDN0.172、SEQ ID N0.173、SEQ ID N0.175、SEQ ID N0.176、SEQ ID N0.177、SEQ ID N0.179、SEQ ID N0.180的肽的MP標(biāo)記。
18.權(quán)利要求16的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.109,SEQ IDN0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ ID N0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.165、SEQ IDN0.169,SEQ ID N0.170,SEQ ID N0.17USEQ ID N0.172,SEQ ID N0.173 的肽的 MP 標(biāo)記。
19.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.188 到 SEQ ID N0.197,SEQ ID N0.200、SEQ ID N0.20KSEQ ID N0.203 到 SEQ ID N0.262的肽的I ND標(biāo)記。
20.權(quán)利要求19的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.188,SEQ IDN0.189、SEQ ID N0.190、SEQ ID N0.191、SEQ ID N0.192、SEQ ID N0.193、SEQ ID N0.194、SEQ ID N0.195、SEQ ID N0.197、SEQ ID N0.201、SEQ ID N0.203、SEQ ID N0.204、SEQ IDN0.205,SEQ ID N0.206,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.208,SEQ ID N0.209,SEQ ID N0.210、SEQ ID N0.211、SEQ ID N0.212、SEQ ID N0.213、SEQ ID N0.215、SEQ ID N0.216、SEQ IDN0.218,SEQ ID N0.219,SEQ ID N0.220,SEQ ID N0.221,SEQ ID N0.222,SEQ ID N0.225、SEQ ID N0.226、SEQ ID N0.227、SEQ ID N0.228、SEQ ID N0.233、SEQ ID N0.234、SEQ IDN0.235,SEQ ID N0.236,SEQ ID N0.237,SEQ ID N0.238,SEQ ID N0.239,SEQ ID N0.240、SEQ ID N0.241、SEQ ID N0.242、SEQ ID N0.243、SEQ ID N0.244、SEQ ID N0.245、SEQ IDN0.246、SEQ ID N0.247、SEQ ID N0.248、SEQ ID N0.249、SEQ ID N0.250、SEQ ID N0.251、SEQ ID N0.252、SEQ ID N0.253、SEQ ID N0.254、SEQ ID N0.255、SEQ ID N0.256、SEQ IDN0.257、SEQ ID N0.258、SEQ ID N0.259、SEQ ID N0.260、SEQ ID N0.261、SEQ ID N0.262的肽的IND標(biāo)記。
21.權(quán)利要求19的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.188,SEQ IDN0.193,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.242,SEQ ID N0.243,SEQ ID N0.246,SEQ ID N0.256、SEQ ID N0.260的肽的IND標(biāo)記。
22.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.266 到 SEQ ID N0.281 以及 SEQ ID N0.283 到 SEQ ID N0.287 的肽的 SME 標(biāo)記。
23.權(quán)利要求22的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.266、SEQ IDN0.268,SEQ ID N0.269,SEQ ID N0.270,SEQ ID N0.273,SEQ ID N0.274,SEQ ID N0.277、SEQ ID N0.279、SEQ ID N0.281 的肽的 SME 標(biāo)記。
24.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.314 到 SEQ ID N0.318 以及 SEQ ID N0.320 到 SEQ ID N0.346 的肽的 VM 標(biāo)記。
25.權(quán)利要求24的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.316、SEQ IDN0.318、SEQ ID N0.321、SEQ ID N0.341、SEQ ID N0.342、SEQ ID N0.344、SEQ ID N0.346的肽的VM標(biāo)記。
26.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQIDN0.509 到 SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525 到 SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574 到 SEQ IDN0.604,SEQ ID N0.606 到 SEQ ID N0.618,SEQ ID N0.620 到 SEQ ID N0.696、SEQ ID N0.698到 SEQ ID N0.1077 以及 SEQ ID N0.1098 到 SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標(biāo)記。
27.權(quán)利要求26的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.509、SEQID N0.510、SEQ ID N0.512、SEQ ID N0.513、SEQ ID N0.514、SEQ ID N0.515、SEQ IDN0.516,SEQ ID N0.517,SEQ ID N0.518,SEQ ID N0.519,SEQ ID N0.520,SEQ ID N0.521、SEQ ID N0.522、SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525、SEQ ID N0.526、SEQ ID N0.528、SEQ IDN0.530,SEQ ID N0.531,SEQ ID N0.532,SEQ ID N0.533,SEQ ID N0.534,SEQ ID N0.535、SEQ ID N0.536、SEQ ID N0.537、SEQ ID N0.538、SEQ ID N0.539、SEQ ID N0.540、SEQ IDN0.541,SEQ ID N0.542,SEQ ID N0.543,SEQ ID N0.544,SEQ ID N0.545,SEQ ID N0.546、SEQ ID N0.547、SEQ ID N0.548、SEQ ID N0.549、SEQ ID N0.550、SEQ ID N0.551、SEQ IDN0.552,SEQ ID N0.553,SEQ ID N0.554,SEQ ID N0.555,SEQ ID N0.556,SEQ ID N0.557、SEQ ID N0.558、SEQ ID N0.559、SEQ ID N0.560、SEQ ID N0.561、SEQ ID N0.562、SEQ IDN0.563,SEQ ID N0.564,SE Q ID N0.565,SEQ ID N0.566,SEQ ID N0.567,SEQ ID N0.571、SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574、SEQ ID N0.575、SEQ ID N0.576、SEQ ID N0.577、SEQ IDN0.578,SEQ ID N0.580,SEQ ID N0.58KSEQ ID N0.583,SEQ ID N0.584,SEQ ID N0.586、SEQ ID N0.587、SEQ ID N0.588、SEQ ID N0.589、SEQ ID N0.590、SEQ ID N0.591、SEQ IDN0.593,SEQ ID N0.594,SEQ ID N0.595,SEQ ID N0.596,SEQ ID N0.597,SEQ ID N0.598、SEQ ID N0.599、SEQ ID N0.600、SEQ ID N0.601、SEQ ID N0.602、SEQ ID N0.604、SEQ IDN0.606,SEQ ID N0.607,SEQ ID N0.609,SEQ ID N0.611,SEQ ID N0.612,SEQ ID N0.613、SEQ ID N0.614、SEQ ID N0.615、SEQ ID N0.616、SEQ ID N0.618、SEQ ID N0.620、SEQ IDN0.622,SEQ ID N0.623,SEQ ID N0.624,SEQ ID N0.625,SEQ ID N0.626,SEQ ID N0.627、SEQ ID N0.632、SEQ ID N0.633、SEQ ID N0.635、SEQ ID N0.636、SEQ ID N0.637、SEQ IDN0.638,SEQ ID N0.639,SEQ ID N0.640,SEQ ID N0.641,SEQ ID N0.642,SEQ ID N0.643、SEQ ID N0.645、SEQ ID N0.648、SEQ ID N0.649、SEQ ID N0.651、SEQ ID N0.652、SEQ IDN0.653,SEQ ID N0.654,SEQ ID N0.655,SEQ ID N0.656,SEQ ID N0.659,SEQ ID N0.660、SEQ ID N0.664、SEQ ID N0.665、SEQ ID N0.666、SEQ ID N0.667、SEQ ID N0.669、SEQ IDN0.670,SEQ ID N0.672,SEQ ID N0.673,SEQ ID N0.674,SEQ ID N0.675,SEQ ID N0.676、SEQ ID N0.677、SEQ ID N0.678、SEQ ID N0.679、SEQ ID N0.680、SEQ ID N0.681、SEQ IDN0.685、SEQ ID N0.686、SEQ ID N0.687、SEQ ID N0.688、SEQ ID N0.689、SEQ ID N0.690、SEQ ID N0.691、SEQ ID N0.692、SEQ ID N0.693、SEQ ID N0.694、SEQ ID N0.696、SEQ IDN0.698、SEQ ID N0.699、SEQ ID N0.700、SEQ ID N0.701、SEQ ID N0.702、SEQ ID N0.703、SEQ ID N0.706、SEQ ID N0.707、SEQ ID N0.710、SEQ ID N0.714、SEQ ID N0.717、SEQ IDN0.719,SEQ ID N0.720,SEQ ID N0.722,SEQ ID N0.725,SEQ ID N0.726,SEQ ID N0.727、SEQ ID N0.728、SEQ ID N0.729、SEQ ID N0.732、SEQ ID N0.735、SEQ ID N0.736、SEQ IDN0.737,SEQ ID N0.738,SEQ ID N0.740,SEQ ID N0.741,SEQ ID N0.743,SEQ ID N0.744、SEQ ID N0.745、SEQ ID N0.746、SEQ ID N0.747、SEQ ID N0.748、SEQ ID N0.749、SEQ IDQI 53S ,8ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S σΜοοοε6.ΟΝ S 53s,8s.0Ν S 5MS ,S6.0Ν S Ssds.0N S 5MS 二 S.0Ν S 5MS0S.0ΝQI 53S ,816.0Ν S 5MS ,Η6.0Ν S 5MS ,Π6.0Ν S 5MS ,ΖΤ6.0Ν S 5300,26.0Ν Sσ.35,606.0Ν S 5300,806.0Ν S 5MS ,Ζ06.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS,S6.0ΝCl 53S ,CO06.0Ν ωηηSg ,Sg.?=曰 Sg ,Sg.?藝 Qi sgoog.?=曰 sg ,ggg.?=曰 σΜοο,868.ΟΝ S 5MS,Z68.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 1-l.0^ QI Sg ,Sg.差Cl 53S ,S8.ΟΝ ωηη1.0^ Qi sgogg.?=曰 Sg ,ggg.?=曰 sg ,000000.?=曰 σΜοο,Ζ88.0Ν QH ss,988.0Ν QHafMs ,Looooo_QN QHafMs^oooo_QN QHafMs ,εοοοο_QN QH ss ,S8.0ΝCl 53S 二 88.0Ν ωηηsgogg.?=曰 1.0^ Ξ Sgvgfc=曰 1.0^ Ξ σΜοο,9Ζ8.0Ν S 53s,loz8.0Ν S ss^zo0.0Ν S 5MS,U00.0Ν S 5MS ,698.0Ν S 5MS ,898.0ΝCl 53S ,Ζ98.0Ν ωηηSg ,ggg.?=曰 Sg ,Sg.?=曰 Sgdggg 曰 1.0^ Ξ 53Sο98.ΟΝ S 5300,698.0Ν S 5MS ,898.0Ν S 5MS ,ZLO00.0Ν S 5MS ,998.0Ν S 5MS ,998.0ΝCl 53S ,S8.0Ν ωηηSgvsggqhh1- S?.0^ Ξ 53S0900.0Ν ΩΗΗSg ?οο.?=QHHσΜοο,ι.ΟΝ QHaf3s,zs _QN QHafMs ?οο_QN QHafMs ?οο.0Ν QH Ss,蕁8.0Ν QHafMs ?οο_QNCl 53S 二寸8.0Ν ωηηsgoig.?=曰 Sg vgcog.?=曰 1.0^ Qi sg vgcog.?=曰 σΜοο,9ε8.ΟΝ S ss^coo0.0Ν S 5MS ,εεοο.0Ν S 53s,zco8.0Ν S 5MS ,?εοο.0Ν S 5MS0CO8.0ΝQI 53S ,6S.0Ν S 5MS ,8S.0Ν S 5MS ,Zs.0Ν S 5MS ,9S.0Ν S 5MS ,LOS.0Ν S σΜοο,藝8.0Ν QH Ssds.0Ν QH Ss 二 S.0Ν QH Ss ,818.0Ν QH Ss ?οο.0Ν QH Ss ,Η8.0ΝQI 53S ,Π8.0Ν S 5MS ?οο.0Ν S 5MS ,ποο.0Ν S 5MS0T00.0Ν S 5MS ,608.0Ν Sσ.35,Ζ08.ΟΝ ωη η1-1.0^ Ξ sg,LOog.?=qhh1-l.0^ Ξ sg ,Sg.?=曰 sg,so0.0ΝQI 53S008.0Ν S 5MS ,66Ζ.0Ν S 5MS ,86Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ6Ζ.0Ν S 5MS ,96Ζ.0Ν S σΜοο,96ζ.ΟΝ S 5MS^6Z.0Ν S 5MS ,CO6Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS06Z.0Ν S 53s,68z.0ΝQI 53S ,88Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS ,98Ζ.0Ν S 5MS ,LO00Z.0Ν S 5MS ,εοοζ.0Ν S σΜοο,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS,T00Z.0Ν S 5MS000Z.0Ν S 5MS ,6ΖΖ.0Ν S 5MS ,8ΖΖ.0Ν S 5MS,ZZZ.0Να? 53S ,9ΖΖ.0Ν ωηηi Jp.0^ <Π i Jp.0^ αι 1.0^ <Π 53S ,Uz.0Ν ωηησΜοοοζζ.ΟΝ S 5MS,69Z.0Ν S 5MS ,89Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ9Ζ.0Ν S 5MS ,99Ζ.0Ν S 5Ms,co9z.0ΝQI 53S ,Sz.0Ν S 53S09Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS ,ZLOZ.0Ν S 5MS ,9LOZ.0Ν S σΜοο,LOLOZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS ,TLOZ.0Ν S SSOLOZ.0Νstloa ο.玲狀 r-ψ V 9TS9ZS0T ZoSEQ ID N0.1015、SEQ ID N0.1018、SEQ ID N0.1019、SEQ ID N0.1020、SEQ ID N0.1022、SEQ ID N0.1024、SEQ ID N0.1025、SEQ ID N0.1026、SEQ ID N0.1027、SEQ ID N0.1028、SEQ ID N0.1030、SEQ ID N0.1031、SEQ ID N0.1034、SEQ ID N0.1036、SEQ ID N0.1041、SEQ ID N0.1042、SEQ ID N0.1044、SEQ ID N0.1045、SEQ ID N0.1046、SEQ ID N0.1048、SEQ ID N0.1049、SEQ ID N0.1050、SEQ ID N0.1052、SEQ ID N0.1053、SEQ ID N0.1054、SEQ ID N0.1058、SEQ ID N0.1059、SEQ ID N0.1060、SEQ ID N0.1062、SEQ ID N0.1063、SEQ ID N0.1064、SEQ ID N0.1067、SEQ ID N0.1068、SEQ ID N0.1069、SEQ ID N0.1070、SEQ ID N0.1071、SEQ ID N0.1072、SEQ ID N0.1073、SEQ ID N0.1074、SEQ ID N0.1075、SEQ ID N0.1076,SEQ ID N0.1098,SEQ ID N0.1099,SEQ ID N0.1100,SEQ ID N0.110USEQID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ ID N0.1106、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標(biāo)記。
28.權(quán)利要求26的檢測(cè)方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.510,512,513、514、520、521、522、523、525、530、532、537、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、556、557、558、559、560、561、562、574、581、582、583、584、596、597、598、599、600、601、602、607、609、632、633、635、636、649、655、656、667、674、675、689、690、698、714、719、720、722、727、729、741、746、748、750、751、752、755、756、757、763、767、768、772、775、781、782、790、792、793、794、795、796、797、798、801、809、811、812、813、814、824、832、834、837、838、847、851、853、854、855、856、857、858、859、860、862、868、869、870、874、875、876、877、879、880、881、882、894、895、898、902、903、904、906、907、908、912、913、914、920、922、923、937、938、939、945、946、948、949、950、951、954、956、962、964、967、969、971、972、974、975、979、980、985、988、990、993、994、995、996、997、1000、1001、1003、1004、1005、1011、1013、1015、1018、1019、1027、1030、1034、1035、1036、1042、1048、1052、1058、1060、1070、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109 的肽的 OXA 標(biāo)記。
29.權(quán)利要求26的檢測(cè) 方法，其中所述抗性標(biāo)記是選自序列為SEQID N0.1098、SEQID N0.1100、SEQ ID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103765216SQ201280030179
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月21日
【發(fā)明者】Y·沙勒捷, J-P·沙里耶, C·弗蘭切斯基, G·贊巴爾迪, T·切基尼, E·德古沙爾梅特 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司