專利名稱：碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
抗藥性細菌KPC也就是碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae carbapenamase)，最早在一株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)，屬于Bush分類的2f 組，Ambler分類的A類，能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素。目 前已有5個KPC亞型被國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌屬于2型。碳青霉烯 類藥物通常用于對付其他抗生素?zé)o法應(yīng)付的細菌感染，具有非常廣泛的抗菌活性，因能抵 抗大多數(shù)內(nèi)酰胺酶的水解，故常用于產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和/或去阻遏AmpC-內(nèi)酰 胺酶(AmpC)菌株引起嚴重感染的治療。但是碳青霉烯耐藥腸桿菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來 了極大困難。從2000年以后，KPC酶家族陸續(xù)在美國的新英格蘭和亞特蘭大地區(qū)被發(fā)現(xiàn)， 主要在克雷伯菌屬中，也在其他菌株中被發(fā)現(xiàn)。由于腸桿菌是臨床上重要的醫(yī)院感染菌，其 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥給臨床抗感染治療帶來了極大困難。KPC細菌被視為突破了 臨床治療的最后一道防線碳青霉烯類抗生素的生物體，碳青霉烯類抗生素都對它起不了作 用。據(jù)報道，巴西衛(wèi)生部門2010年10月19日表示，截至10月15日，這種KPC超級細 菌已經(jīng)在首都巴西利亞造成15人死亡，另有135人被感染，發(fā)病數(shù)量在過去幾個星期以來 人數(shù)不斷激增。美國衛(wèi)生員說，現(xiàn)有抗生素幾乎全都無法控制的一種超級細菌，已出現(xiàn)在美 國35州醫(yī)院，其中紐約和新澤西出現(xiàn)感染最多。這種具有新基因的超級細菌也在世界其他 地方擴散。美國醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的這些細菌尤其容易感染危重病人，而且4亡率高達30%至60%。 美國疾病預(yù)防控制中心說，雖然KPC細菌在紐約和新澤西州最常見，可是美國一半以上的 州都發(fā)現(xiàn)其蹤影。10年前美國各地醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的KPC細菌，只有對碳青霉烯類抗生素具 有抗藥性，現(xiàn)在比率已超過8%。我國KPC-2酶基因主要見于我國華東地區(qū)，而其它地區(qū)鮮 有報道。由于KPC細菌對臨床抗生素的使用產(chǎn)生極大影響，因此有必要建立一種碳青霉烯 酶肺炎克雷伯氏菌(KPC)快速、有效的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因設(shè)計引物和TaqMan探針，提 供一種檢測碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒及其檢測方法，可實現(xiàn)對碳青霉 烯酶肺炎克雷伯氏菌進行快速、準確、特異檢測。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性 引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒 光探針序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘
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下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘熒光探針5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計，試劑盒中其他組成，可按本 領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，該試劑盒可用作碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的定性檢測，也可加入標 準品進行定量檢測。優(yōu)選的，所述試劑盒中還可包括碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因標準品，所述標 準品序列如下 :ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。以標準品的梯度濃度的DNA溶液進行熒光PCR檢測，根據(jù)拷貝濃度的對數(shù)值 與標準品Ct值的關(guān)系可繪制得到標準曲線，測得樣品DNA的Ct值后，對照標準曲線即可獲 得樣品DNA的拷貝濃度。本發(fā)明還涉及一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣本DNA;(2)取特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進行PCR擴 增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5'-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3‘熒光探針5‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團；所述陰性對照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，通常選擇非靶細菌，如副溶血性弧菌、 志賀菌、沙門菌、非耐藥肺炎克雷伯氏菌等。(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線 剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈 良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性。為達到定量檢測的要求，所述方法可同時以梯度濃度的標準品DNA溶液在 與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值為 橫坐標、標準品Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照標準 曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度；所述標準品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。所述PCR反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，優(yōu)選的，所述PCR擴增 反應(yīng)條件如下95°C變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。PCR反應(yīng)液通常按如下組成配制(終濃度)PCR buffer終濃度為1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的熒光探針、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (約50ng/ μ 1)的模板，反應(yīng)總體積通常為20 50 μ L。PCR buffer終濃度 為IX，是指緩沖液中各組分終濃度與IXPCR buffer相同，通常采用市購2XPCR buffer,體積用量為PCR反應(yīng)液體系總體積的1/2。IXPCR buffer組成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgCl2L 5mM。本發(fā)明建立了利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)檢測碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的 方法，并經(jīng)檢測臨床樣本，表明該方法切實可行。由于本方法采用了 PCR擴增技術(shù)，使得碳 青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌檢測的敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應(yīng)用，使得其特異 性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率，使得我們可以在極少的標本中獲得足夠 的監(jiān)測信息。本發(fā)明采用了目前較先進的特異性熒光探針雜交定量PCR檢測技術(shù)，在保持高敏 感性的前提下盡量減少假陽性干擾。在實時熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR 模板的定量不論是直接PCR還是競爭性PCR，基本上都要通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果 經(jīng)計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)擞浀腜CR 產(chǎn)物以ELISA的方式進行檢測，再由此推測起始模板的量，但這些方法實際上都屬于半定 量水平，因為即使PCR條件已優(yōu)化到最佳程度，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會給 結(jié)果分析帶來影響，從而影響定量這的結(jié)果。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們可以 真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特 異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被檢測基因的特異性大大提高。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的檢測敏感性高，特 異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可實現(xiàn)對碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌快速、準 確、特異檢測。


圖1為實時熒光定量PCR標準品檢測碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌實時熒光定量 PCR標準品檢測結(jié)果，從左至右分別為ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2UO1Copies/ μ L標準品。圖2為實時熒光定量PCR標準曲線。標準曲線為Y =-3. 494XlgX+34. 916 ;Υ:對 應(yīng)的CT值；X 碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因的copies。圖3為不同濃度的5例臨床標本熒光定量PCR檢測結(jié)果，CT值分別為24. 32、 25. 09,28. 15,28. 91 和 32. 97，拷貝數(shù)分別為 6. 58 X IO4Copies/μ L、3. 09 X IO4Copies/μ L、 7. 41 X IO2Copies/μ L、2. 25 X 102copies/μ L 和 0. 003copies/μ L。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 1、材料細菌基因組DNA提取試劑購自大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購自美國 LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司，測序試劑、 377 型測序儀、Bio-Rad icycler PCR 儀、Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 儀(Qiagen 公 司)。2、引物及探針設(shè)計與合成
以碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列(注冊號為AY034847)為模板，使用 Primer Express (V2. 0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點，從中選擇最佳組合。標準品PCR序列上游引物5，-GGCACGGCAAATGACTATGC-3，，下游引物5，-CCCTCGAGCGCGAGTCTAGC-3，，檢測用PCR序列為上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘熒光探針5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。均由上海輝睿生物科技有限公司合成。3、檢測標準品制備采用ABI 394寡核苷酸合成儀根據(jù)碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列中標準 品PCR序列的位置，全基因合成140bp的寡核苷酸片段。用標準品上下游引物在Bio-Rad i eye Ier PCR儀上進行PCR擴增PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L標準品上游引物(10 μ Μ)IuL標準品下游引物(10 μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 6 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補足至20 μ L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 20秒進行35個循環(huán)擴 增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，并將陽性克隆 經(jīng)測序驗證?；厥?40bp片段，即為標準品，測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。4、結(jié)果經(jīng)測序，上述設(shè)計標準品完全與預(yù)期相符，回收的標準品片段序列如下 ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggccgtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcggctagactcg cgctcgaggg(SEQ ID No. 4)。實施例2 熒光定量PCR法檢測臨床樣本1、標本檢測5例人工模擬標本，采用基因組DNA提取試劑提取基因組DNA，分別取LOyL做模 板，用檢測用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR儀(Qiagen公司)上進行PCR 擴增。
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PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L檢測用上游引物(10 μ Μ)IuL檢測用下游引物(10 μ Μ)IuL檢測用熒光探針(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L

dNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補足至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。以非耐藥肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)為陰性對照于相同條件下進行PCR檢 測，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過 閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。同時在相同條件下以不同濃度標準品進行檢測，并繪制標準曲線。待測樣本的測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測樣本中的碳青霉烯酶 肺炎克雷伯氏菌基因的數(shù)量。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)、志賀菌(ATCC 12022)、沙門菌(ATCC 50035)、金 黃色葡萄球菌(ATCC 25933)、非耐藥肺炎克雷伯氏菌(ATCC 13883)和空腸彎曲菌(ATCC 33560)菌株按照上述方法進行PCR檢測，檢測結(jié)果均呈陰性，說明本發(fā)明方法特異性好。2、樣品檢測結(jié)果標準品檢測結(jié)果參見圖1，標準曲線參見圖2。5例臨床標本檢出碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌陽性，檢測結(jié)果參見圖3 :5例陽 性臨床標本熒光定量PCR檢測結(jié)果，CT值分別為24. 32、25. 09、28. 15、28. 91和32. 97， 拷貝數(shù)分別為 6· 58X IO4Copies/μ L、3. 09X IO4Copies/μ L、7. 41 X IO2Copies/μ L、 2. 25 X 102copies/ μ L 和 0. 003copies/ μ L。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求 書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引 物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性 引物和熒光探針序列如下上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括碳青霉烯酶肺 炎克雷伯氏菌基因標準品，所述標準品序列如下ggcacggcaaatgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacacccgggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcgcgctcgaggg。
3. 一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣本DNA;(2)取特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進行PCR擴增反 應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下 上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團；(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好 超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好 的對數(shù)增長，則判斷為陽性。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時以梯度濃度的標準品DNA溶 液在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值為橫 坐標、標準品Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照標準曲線，獲 得樣品DNA的拷貝濃度；所述標準品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgccgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaacaaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應(yīng)條件如下95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的熒光檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒中特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-ACT GGG CGC GCACCTA-3′，下游引物5′-TCG CTGTGC TTG TCATCC TT-3′，熒光探針5′-FAM-CCG TCT ACACCCGGG CGC C-TAMRA-3′，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在使用本發(fā)明檢測試劑盒，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可實現(xiàn)對碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的快速、準確、特異檢測。
文檔編號G01N21/64GK102002529SQ20101055497
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者張政, 程蘇云, 羅蕓, 金大智, 韓建康 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心