一種產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶a在畢赤酵母中的表達(dá)及其酶制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)及酶制劑制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是是半纖維素完全降解所需的關(guān)鍵酶之一，該類酶可水解存半纖維素中的羥基肉桂酸類化合物與阿拉伯木聚糖及某些膠質(zhì)之間的酯鍵。目前，在一些細(xì)菌和真菌等微生物均發(fā)現(xiàn)了阿魏酸酯酶的存在。阿魏酸酯酶在生物能源、飼料、造紙、保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有較大應(yīng)用潛力。在酶制劑研發(fā)過程中，利用基因工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)單一酶制劑具有生產(chǎn)條件易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)。構(gòu)建高效的酶制劑生產(chǎn)菌株對生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本具有重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)黃青霉在以麩皮為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵液中具有阿魏酸酯酶A活性?？寺‘a(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A基因并在基因工程菌株中高效表達(dá)并制備該酶制劑，對開發(fā)該酶的潛在應(yīng)用價值具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供的一種產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)及其酶制劑的制備方法，本發(fā)明利用PCR技術(shù)對來源于產(chǎn)黃青霉的阿魏酸酯酶A編碼基因進(jìn)行克隆并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株中以構(gòu)建成組成型表達(dá)的基因工程重組菌株，通過對發(fā)酵液的超濾濃縮、陽離子交換層析、冷凍噴霧干燥等技術(shù)制備得到高純度的粉狀酶制劑。
[0004]本發(fā)明的目的是提供以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)，利用已報(bào)道的產(chǎn)黃青霉全基因組中的阿魏酸酯酶A序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:
Pcf-F: 5’ 一GCCGTTACGAAGGGCGTCTCTG—3’
PcF-R: 5’ 一TTACCAGCTGCAAGCTCCGCTC—3’
通過信號肽預(yù)測和內(nèi)含子分析并設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出成熟的阿魏酸酯酶A編碼序列，PCR條件具體為:94 V預(yù)變性5min，94 °C變性30 s，60 °C退火30 s和72 °C延伸I min，共35個循環(huán)。
[0005]所用引物序列為:
PcF-1F:5’ — taggaggt gaattc GCCGTTACGAAGGGCGTC— 3’，
PcF-1R:5’ 一 GCCATGGAAGCACCGAGACTATGGCCTGTGACTGTCAACGC—3 ；
PcF-2F- 5’ 一GCGTTGACAGTCACAGGCCATAGTCTCGGTGCTTCCATGGC—3’ ，
PcF-2R: 5，— taggaggt gcggccgc TTACCAGCTGCAAGCTCCGC— 3，；
將擴(kuò)增出的成熟阿魏酸酯酶A編碼序列用R0RI和Not\進(jìn)行雙酶切并連入經(jīng)過相同雙酶切后的PGAPZaA (該質(zhì)粒可通過商業(yè)渠道購買，公司名稱:Invitrogen)形成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母pastoris X-33)感受態(tài)細(xì)胞中形成組成型表達(dá)阿魏酸酯酶A的基因工程菌株。
[0006]利用上述表達(dá)阿魏酸酯酶A的基因工程菌株制備產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶酶A制劑的方法如下:將重組基因工程菌株接種發(fā)酵后，具體的接種發(fā)酵條件為:將高活性表達(dá)菌株接入含有30 L YPD培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐，28-30 °C，200 rpm培養(yǎng)2天。發(fā)酵液離心后收集上清液，通過超濾濃縮、陽離子交換技術(shù)和冷凍噴霧干燥等技術(shù)可制備出純度大于95%的酶制劑。
[0007]本發(fā)明更具體的說主要包括以下過程:
將產(chǎn)黃青霉孢子接入10mL液體察氏培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm培養(yǎng)5天。過濾收集菌體，液氮研磨后通過CTAB法提取產(chǎn)黃青霉的基因組DNA。通過PCR技術(shù)克隆出產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A編碼序列并將該序列轉(zhuǎn)化如畢赤酵母X33菌株。挑取單克隆于10mL YH)液體培養(yǎng)基中并在30°C，200 rpm培養(yǎng)2天。將發(fā)酵液離心，以2-氯對硝基苯酚為底物檢測阿魏酸酯酶A活性。將高活性表達(dá)菌株接入含有30 L YH)培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐，28~30 V,200 rpm培養(yǎng)2天。發(fā)酵液離心后超濾濃縮以制備阿魏酸酯酶A濃縮液，隨后對濃縮液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化并噴霧干燥制備酶制劑。
[0008]通過本方法可獲得高純度的產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A酶制劑，對該酶的進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0009]以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍的限制。
[0010]實(shí)施例1產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A編碼序列的克隆
利用已報(bào)道的產(chǎn)黃青霉基因組DNA中序列信息，設(shè)計(jì)引物對阿魏酸酯酶A基因進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物為:Pcf-F: 5’ 一GCCGTTACGAAGGGCGTCTCTG— 3’
PcF-R: 5’ 一TTACCAGCTGCAAGCTCCGCTC—3’
反應(yīng)條件為:94 V預(yù)變性5min，94 °C變性30 s，60 °C退火30 s和72 °C延伸I min，共35個循環(huán)，電泳后回收基因片段并進(jìn)行DNA測序。將產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A基因與已報(bào)道的黑曲霉阿魏酸酯酶A基因進(jìn)行序列比對分析擴(kuò)增DNA序列中的信號肽編碼序列和內(nèi)含子。根據(jù)序列比對結(jié)果設(shè)計(jì)引物以去掉以上序列中的信號肽編碼序列和內(nèi)含子。所用引物為:
PcF-1F:5’ — taggaggt gaattc GCCGTTACGAAGGGCGTC— 3’，
PcF-1R:5’ 一 GCCATGGAAGCACCGAGACTATGGCCTGTGACTGTCAACGC—3 ；
PcF-2F- 5’ 一GCGTTGACAGTCACAGGCCATAGTCTCGGTGCTTCCATGGC—3’ ，
PcF-2R: 5，— taggaggt gcggccgc TTACCAGCTGCAAGCTCCGC— 3，；
利用上述引物通過交疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼成熟產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A蛋白的DNA序列(見序列表)。將以上DNA序列回收后用&0RI和Notl進(jìn)行雙酶切，連入經(jīng)過相同雙酶切后的PGAPZaA載體并42 °C熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a。將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌進(jìn)行過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒備用。
[0011]實(shí)施例2阿魏酸酯酶A組成型表達(dá)菌株的構(gòu)建
將實(shí)施例1中提取的質(zhì)粒并經(jīng)內(nèi)切酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化畢赤酵母{Pichia pastoris X-33)感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含有100 μ g/ml博來霉素的YPDS平板(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨醇，2%瓊脂粉)。培養(yǎng)3天后，挑取多個單克隆于含有100 mLYH)培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，30 °C, 200 rpm，震蕩培養(yǎng)2天。離心后收集上清液。
[0012]將上述上清液進(jìn)行酶活分析，比較各重組工程菌的阿魏酸酯酶A表達(dá)能力。酶活測定條件如下:將0.15 mL上清液加入加入2.85 mL反應(yīng)液(2.7 mL的含2.5%TritonX_100的100 mM、pH 6.4的磷酸鈉緩沖液和0.15 mL的含有40mM 2-氯對硝基苯酚底物的二甲基亞砜溶液混合而成)，40 °C反應(yīng)10 min。挑取酶活最高的重組菌株進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。
[0013]實(shí)施例3 50L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A
將實(shí)施例2中確定的阿魏酸酯酶A高效表達(dá)菌株接種到含有500 mL已滅菌的YPD培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)的2L三角瓶中，28 °C、220rpm條件下培養(yǎng)48小時。隨后，將500 mL種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入含有30 L已滅菌YH)培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，28~30V、200 rpm條件下培養(yǎng)32~48小時。。
[0014]實(shí)施例4 產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A的制備
利用超濾設(shè)備(分子截留量為10000道爾頓)將阿魏酸酯酶A清液進(jìn)行濃度約8倍，然后用100 mM醋酸鈉緩沖液(pH5.5)將阿魏酸酯酶A濃縮液調(diào)整pH為pH5.5，通過陽離子交換層析純化阿魏酸酯酶A，獲得的蛋白質(zhì)純度高于95%。最后用冷凍噴霧干燥設(shè)備用制成粉狀阿魏酸酯酶A。噴霧冷凍溫度:〈-15°C冷阱溫度-60°C。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)，其特征在于:利用已報(bào)道的產(chǎn)黃青霉全基因組中的阿魏酸酯酶A序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:Pcf-F: 5’ 一GCCGTTACGAAGGGCGTCTCTG—3’PcF-R: 5’ 一TTACCAGCTGCAAGCTCCGCTC—3’ 通過信號肽預(yù)測和內(nèi)含子分析并設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出成熟的阿魏酸酯酶A編碼序列，所用引物序列為:PcF-1F:5’ — taggaggt gaattc GCCGTTACGAAGGGCGTC— 3’，PcF-1R:5’ 一 GCCATGGAAGCACCGAGACTATGGCCTGTGACTGTCAACGC—3 ；PcF-2F- 5’ 一GCGTTGACAGTCACAGGCCATAGTCTCGGTGCTTCCATGGC—3’ ，PcF-2R: 5，— taggaggt gcggccgc TTACCAGCTGCAAGCTCCGC— 3，； 將擴(kuò)增出的成熟阿魏酸酯酶A編碼序列用R0RI和Not\進(jìn)行雙酶切并連入經(jīng)過相同雙酶切后的pGAPZ a A形成重組質(zhì)粒； 將重組質(zhì)粒用fepHl內(nèi)切酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母pastoris X-33)感受態(tài)細(xì)胞中形成組成型表達(dá)阿魏酸酯酶A的基因工程菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)，其特征在于:PCR條件具體為:94 V預(yù)變性5min，94 °C變性30 s，60 °C退火30 s和72 °C延伸I min，共35個循環(huán)。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的表達(dá)阿魏酸酯酶A的基因工程菌株制備產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A酶制劑的方法，其特征在于:將重組基因工程菌株接種發(fā)酵后，發(fā)酵液離心后收集上清液，通過超濾濃縮、陽離子交換技術(shù)和冷凍噴霧干燥等技術(shù)可制備出純度大于95%的酶制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)阿魏酸酯酶A的基因工程菌株制備產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A酶制劑的方法，其特征在于:重組基因工程菌株接種發(fā)酵的具體條件為:將高活性表達(dá)菌株接入含有30 L YPD培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐，28-30 V，200 rpm培養(yǎng)2天。
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)及其酶制劑的制備方法，其特征在于：利用PCR技術(shù)從產(chǎn)黃青霉基因組ＤＮＡ中擴(kuò)增出阿魏酸酯酶A編碼基因并將其連入pGAPZαA載體中構(gòu)建成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33菌株后得到可組成型表達(dá)阿魏酸酯酶A的工程菌株。將該菌株發(fā)酵液通過超濾濃縮、陽離子交換和冷凍干燥技術(shù)等可制備得到高純度的酶制劑。通過本方面的方法可獲得高純度的產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A酶制劑，對該酶的進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)具有重要意義。
【IPC分類】C12R1-84, C12N15-81, C12N9-18
【公開號】CN104651333
【申請?zhí)枴緾N201510127043
【發(fā)明人】張帥兵, 蔡靜平, 賈峰, 胡元森, 王金水, 屈建航, 李海峰, 翟丹丹
【申請人】河南工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月23日