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檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑和方法

文檔序號(hào):10715922閱讀:712來(lái)源:國(guó)知局
檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑和方法。本發(fā)明公開(kāi)的成套試劑,由BMPR2?PG、ACVRL1?PG、SMAD4?PG、SMAD9?PG、KCNK3?PG、NOTCH3?PG、CAV1?PG、ENG?PG和VIP?PG這九個(gè)引物組組成,這九個(gè)引物組的各單鏈DNA的序列分別如序列表中序列1?330所示。實(shí)驗(yàn)證明,利用本發(fā)明的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑的檢測(cè)結(jié)果與利用高通量測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果一致,表明可以利用本發(fā)明的成套試劑檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變。
【專利說(shuō)明】
檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑 和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary Arterial Hypertension,PAH)是一種極度嚴(yán)重的疾病。 雖然近年來(lái)一些新的藥物及基因治療、活體肺移植、房間隔造痿等新療法的應(yīng)用,使患者5 年或10年平均生存率提高,但其治療方案多只是緩解癥狀,而不能改變疾病的進(jìn)程與臨床 后果。其中一個(gè)重要原因是PAH的致病突變還未完全清楚,其發(fā)病機(jī)制與臨床表型的關(guān)系還 未明確。骨形成蛋白2型受體、五羥色胺、五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體,前列環(huán)素受體、前列環(huán)素合酶、電 壓門控的鉀通道、一氧化氮、內(nèi)皮素-1,內(nèi)皮素 A受體、B受體和活性氧等基因編碼區(qū)域的改 變都可能與PAH的形成有關(guān)。因此,對(duì)上述蛋白質(zhì)基因調(diào)控的理解,將有助于更為深刻的認(rèn) 識(shí)PAH的病因、預(yù)后以及治療等。
[0003] 最早鑒定PAH的致病基因和突變的方法是候選基因法,及最新興起的目標(biāo)區(qū)域(已 被前期研究識(shí)別)高通量測(cè)序方法,然而,這些方法費(fèi)時(shí)及花費(fèi)較高,在臨床上應(yīng)用受到限 制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因 (BMPR2基因、ACVRLl 基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因)是否 發(fā)生突變。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明首先提供了檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變 的成套試劑。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑,?ΒΜΡΚ2-PG、ACVRLI-PG、SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAVl-PG、ENG-PG和/或VIP-PG組 成;所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因?yàn)锽MPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基 因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和/或VIP基因;
[0007] 所述BMPR2-PG可為由序列表中序列1-30所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列 2a-l與序列2a所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,a為1至15中的任一個(gè)自然數(shù);
[0008] 所述ACVRLI-PG可為由序列表中序列31 -46所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2b-l與序列2b所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,b為16至23中的任一個(gè)自然數(shù);
[0009] 所述SMAD4-PG可為由序列表中序列47-64所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2c-l與序列2c所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,c為24至32中的任一個(gè)自然數(shù);
[0010] 所述SMAD9-PG可為由序列表中序列65-76所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2d-l與序列2d所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,d為33至38中的任一個(gè)自然數(shù);
[0011] 所述KCNK3-PG可為由序列表中序列77-84所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2e-l與序列2e所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,e為39至42中的任一個(gè)自然數(shù);
[0012] 所述N0TCH3-PG可為由序列表中序列85-136所示的單鏈DNA組成的引物組,其中, 序列2f_l與序列2f所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,f為43至68中的任一個(gè)自然數(shù);
[0013] 所述CAVl-PG可為由序列表中序列137-142所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2g-l與序列2g所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,g為69至71中的任一個(gè)自然數(shù);
[0014] 所述ENG-PG可為由序列表中序列143-164所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2h-l與序列2h所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,h為72至82中的任一個(gè)自然數(shù);
[0015] 所述VIP-PG可為由序列表中序列165-172所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序 列2i-l與序列2i所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,i為83至86中的任一個(gè)自然數(shù)。
[0016] 上述成套試劑中,所述BMPR2-PG為由能與BMPR2基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引 物組;
[0017] 所述ACVRLl -PG為由能與ACVRLl基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0018] 所述SMAD4-PG為由能與SMAD4基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0019 ] 所述SMAD9-PG為由能與SMAD9基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0020] 所述KCNK3-PG為由能與KCNK3基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0021] 所述N0TCH3-PG為由能與N0TCH3基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0022]所述CAVl -PG為由能與CAVl基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0023]所述ENG-PG為由能與ENG基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組;
[0024]所述VIP-PG為由能與VIP基因特異結(jié)合的單鏈DNA組成的引物組。
[0025] 上述成套試劑中,所述BMPR2-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述BMPR2-PG進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得BMPR2基因的全長(zhǎng)序列,BMPR2基因的全長(zhǎng)序列 可通過(guò)將所述BMPR2-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0026] 所述ACVRL1-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述ACVRL1-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得ACVRLl基因的全長(zhǎng)序列,ACVRLl基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所 述ACVRLl -PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0027] 所述SMAD4-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述SMAD4-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得SMAD4基因的全長(zhǎng)序列,SMAD4基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述 SMAD4-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0028] 所述SMAD9-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述SMAD9-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得SMAD9基因的全長(zhǎng)序列,SMAD9基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述 SMAD9-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0029] 所述KCNK3-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述KCNK3-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得KCNK3基因的全長(zhǎng)序列,KCNK3基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述 KCNK3-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0030] 所述N0TCH3-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述N0TCH3-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得N0TCH3基因的全長(zhǎng)序列,N0TCH3基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所 述N0TCH3-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0031] 所述CAVl-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述CAVl-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得CAVl基因的全長(zhǎng)序列,CAVl基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述CAVl-PG 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0032] 所述ENG-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述ENG-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得ENG基因的全長(zhǎng)序列,ENG基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述ENG-PG的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到;
[0033] 所述VIP-PG可滿足以下條件:通過(guò)利用所述VIP-PG進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序獲得VIP基因的全長(zhǎng)序列,VIP基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將所述VIP-PG的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得到。
[0034] 所述PCR擴(kuò)增均可為以相應(yīng)的全長(zhǎng)基因?yàn)槟0暹M(jìn)行的PCR擴(kuò)增。
[0035] 上述成套試劑中,所述成套試劑中各單鏈DNA的摩爾數(shù)比例可以根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的 樣品進(jìn)行調(diào)整,所述成套試劑中各單鏈DNA的摩爾數(shù)液均可相同。
[0036]所述成套試劑中的各單鏈DNA均可獨(dú)立包裝,也可包裝在一起;也可將其中的成對(duì) 引物單獨(dú)包裝,也可以將其中的至少兩個(gè)成對(duì)引物包裝在一起;也可根據(jù)檢測(cè)的目的基因 的不同將針對(duì)同一基因的引物組分別進(jìn)行單獨(dú)包裝或?qū)⑨槍?duì)幾個(gè)基因的引物組包裝在一 起(即將所述 BMPR2-PG、所述 ACVRL1-PG、所述 SMAD4-PG、所述 SMAD9-PG、所述 KCNK3-PG、所述 N0TCH3-PG、所述CAV1-PG、所述ENG-PG和所述VIP-PG均分別包裝或?qū)⑵渲械闹辽賰蓚€(gè)包裝 在一起)。
[0037] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明還提供了檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突 變的系統(tǒng)。
[0038] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的系統(tǒng),包括所述成套試 劑和Yl;所述Yl為進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑和/或儀器。
[0039] 上述系統(tǒng)中,所述系統(tǒng)可為包括所述成套試劑和所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑 的試劑或試劑盒。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑可為2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix。 2 XΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix為ΚΑΡΑ Biosystems產(chǎn)品。
[0040] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明還提供了檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突 變的方法。
[0041] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法, 包括:以待測(cè)人離體肺組織的基因組DNA為模板,利用所述成套試劑進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與野生型的BMPR2基因(在NCBI中的序列號(hào)為ΝΜ_ 001204)、ACVRL1基因(在NCBI中的序列號(hào)為ΝΜ_000020)、SMAD4基因(在NCBI中的序列號(hào)為 NM_005359)、SMAD9基因(在NCBI中的序列號(hào)為NM_001127217)、KCNK3基因(在NCBI中的序列 號(hào)為NM_002246)、N0TCH3基因(在NCBI中的序列號(hào)為NM_000435)、CAVl基因(在NCBI中的序 列號(hào)為匪_001172895)4如基因(在%81中的序列號(hào)為匪_000118)和¥1?基因(在%81中的 序列號(hào)為NM_003381)中相應(yīng)基因的序列進(jìn)行比對(duì),確定所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生 突變。
[0042]上述方法中,所述多重PCR擴(kuò)增可在55°C的退火溫度下進(jìn)行。所述多重PCR擴(kuò)增可 在55°C的退火溫度下退火30秒。所述多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體可為:98°C5min;98°C 3〇86。,551€3〇86(3,721€4586(3,循環(huán)20次;72 1€511^11。
[0043]上述方法中,所述多重PCR擴(kuò)增可在反應(yīng)體系1中進(jìn)行;所述反應(yīng)體系1可由所述待 測(cè)人血液的基因組DNA、所述成套試劑、2 XKAPA HiFi HotStart ReadyMix和水組成。所述 反應(yīng)體系1中所述待測(cè)人離體肺組織的基因組DNA的濃度可為50ng/20yl,所述成套試劑的 濃度可為12.5mM。
[0044] 上述方法還可包括:對(duì)所述多重PCR的產(chǎn)物依次進(jìn)行A-加尾、連接接頭和擴(kuò)增。
[0045] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用:
[0046] XI、所述成套試劑在制備預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)品中的應(yīng)用;
[0047] X2、所述成套試劑在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用;
[0048] X3、所述成套試劑在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變 產(chǎn)品中的應(yīng)用;
[0049] X4、所述成套試劑在檢測(cè)或輔助檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變中的 應(yīng)用;
[0050] X5、所述系統(tǒng)在制備預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)品中的應(yīng)用;
[0051] X6、所述系統(tǒng)在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用;
[0052] X7、所述系統(tǒng)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變產(chǎn)品 中的應(yīng)用;
[0053] X8、所述系統(tǒng)在檢測(cè)或輔助檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變中的應(yīng) 用;
[0054] X9、所述方法在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用。
[0055] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明還提供了預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)人是否患有肺動(dòng)脈高壓的 方法。
[0056] 本發(fā)明所提供的預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)待測(cè)對(duì)象是否患有肺動(dòng)脈高壓的方法,包括:利 用所述檢測(cè)所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法確定所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因 是否發(fā)生突變,所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因發(fā)生突變的待測(cè)對(duì)象患有肺動(dòng)脈高壓的風(fēng)險(xiǎn)高于 或候選高于所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因不發(fā)生突變的待測(cè)對(duì)象。
[0057]實(shí)驗(yàn)證明,利用本發(fā)明的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑對(duì)三 個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者家系中的81?1?2、4(^此1、5獻(xiàn)04、5獻(xiàn)09、此疆3、勵(lì)了013、04¥^吣和¥1?基 因的序列進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)家系1中的肺動(dòng)脈高壓患者的BMPR2基因的第1038位由胸腺嘧啶 (T)突變?yōu)榱税奏?C),其他基因均未發(fā)生突變,而非肺動(dòng)脈高壓患者的這九個(gè)基因均未 發(fā)生突變;家系2中的BMPR2基因的第1042位由鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)榱讼汆堰?A),其他基因均 未發(fā)生突變,而非肺動(dòng)脈高壓患者的這九個(gè)基因均未發(fā)生突變;非家系3中的肺動(dòng)脈高壓患 者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶(C)突變?yōu)榱诵叵汆奏?T),其他基因均未發(fā)生突變, 而非肺動(dòng)脈高壓患者的這九個(gè)基因均未發(fā)生突變。這些結(jié)果與利用高通量測(cè)序方法進(jìn)行檢 測(cè)的結(jié)果一致。表明,本發(fā)明的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑可以用 來(lái)檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變。
[0058]因此,
【申請(qǐng)人】針對(duì)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因,建立了基于多重PCR的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相 關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法。利用該方法可確定目標(biāo)基因是否發(fā)生突變進(jìn)而可篩查PAH的 已知致病突變,為患者快速作出基因診斷。也可以針對(duì)通過(guò)排查已知致病突變收集到的已 知突變陰性的PAH家系,建立隊(duì)列,進(jìn)行全外顯子的基因測(cè)序,搜尋與疾病共分離的致病新 突變。
[0059]考慮到合并BMPR2、ACVRLI、SMAD4、SMAD9、KCNK3、N0TCH3、CAVI、ENG、VIP基因突變 PAH可能的不良預(yù)后,應(yīng)對(duì)PAH患者,尤其是遺傳性PAH、特發(fā)性PAH和/或合并HHT的患者及親 屬行基因突變檢測(cè),為提早確診病變,為無(wú)癥狀親屬提供發(fā)病危險(xiǎn)度預(yù)測(cè)有重要意義,對(duì)合 并突變的潛在發(fā)病者,建議每3年復(fù)查超聲心動(dòng)圖,結(jié)合臨床癥狀的嚴(yán)密觀察,對(duì)PAH的早期 診斷和干預(yù)以改善臨床預(yù)后有重大意義。對(duì)兒童PAH患者,也應(yīng)積極行基因檢測(cè)以盡早為病 因的明確提供依據(jù),檢測(cè)雙親以發(fā)現(xiàn)攜帶致病基因突變的高患病風(fēng)險(xiǎn)者,同時(shí)測(cè)定父母再 行生育后代患病的風(fēng)險(xiǎn)度。
[0060] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種新的肺動(dòng)脈高壓致病基因突變位點(diǎn),其與肺 動(dòng)脈高壓相關(guān),通過(guò)檢測(cè)是否為該突變位點(diǎn),預(yù)測(cè)待測(cè)樣本是否患有肺動(dòng)脈高壓,其可以作 為治療肺動(dòng)脈高壓的靶點(diǎn),為日后研究肺動(dòng)脈高壓藥物提供新的治療途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0061] 圖1為三個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者樣本家系圖。其中,圖A、圖B和圖C分別為肺動(dòng)脈高壓患 者樣本家系1、家系2和家系3,箭頭所示患者為該家系中肺動(dòng)脈高壓先證者。
[0062]圖2為三個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者樣本家系中肺動(dòng)脈高壓患者DNA的測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。其 中,A為家系1中肺動(dòng)脈高壓患者BMPR2基因的第1038位附近的DNA測(cè)序結(jié)果,B為家系2中肺 動(dòng)脈高壓患者BMPR2基因的第1042位附近的DNA測(cè)序結(jié)果,C為家系3中肺動(dòng)脈高壓患者 ACVRLl基因的第1450位附近的DNA測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0063]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述,給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0064] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。
[0065] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0066] 下述實(shí)施例中的2 XKAPA HiFi HotStart ReadyMix為KAPA Biosystems產(chǎn)品,產(chǎn) 品目錄號(hào)為KK2601。
[0067] 實(shí)施例1、利用檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑檢測(cè)肺動(dòng)脈高 壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變
[0068] -、檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑的制備
[0069] 檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑,由BMPR2-PG、ACVRL1-PG、 SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAVl -PG、ENG-PG 和 VIP-PG 組成;
[0070] BMPR2-PG為由序列表中序列1-30所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2a-l與 序列2a所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,a為I -15中的自然數(shù);BMPR2-PG可滿足以下條件:通過(guò)利 用BMPR2-PG以BMPR2基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲得 BMPR2基因的全長(zhǎng)序列,BMPR2基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將BMPR2-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn) 行拼接得到;
[0071] ACVRLI-PG為由序列表中序列31 -46所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2b-1 與序列2b所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,b為16-23中的自然數(shù);ACVRLl -PG可滿足以下條件:通 過(guò)利用ACVRL1-PG以ACVRLl基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以 獲得ACVRLl基因的全長(zhǎng)序列,ACVRLl基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將ACVRL1-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 序列進(jìn)行拼接得到;
[0072] SMAD4-PG為由序列表中序列47-64所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2c-l 與序列2c所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,c為24-32中的自然數(shù);SMAD4-PG可滿足以下條件:通 過(guò)利用SMAD4-PGG以SMAD4基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以 獲得SMAD4基因的全長(zhǎng)序列,SMAD4基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將SMAD4-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序 列進(jìn)行拼接得到;
[0073] SMAD9-PG為由序列表中序列65-76所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2d-l 與序列2d所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,d為33-38中的自然數(shù);SMAD9-PG可滿足以下條件:通 過(guò)利用SMAD9-PG以SMAD9基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲 得SMAD9基因的全長(zhǎng)序列,SMAD9基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將SMAD9-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列 進(jìn)行拼接得到;
[0074] KCNK3-PG為由序列表中序列77-84所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2e-l 與序列2e所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,e為39-42中的自然數(shù);KCNK3-PG可滿足以下條件:通 過(guò)利用KCNK3-PG以KCNK3基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲 得KCNK3基因的全長(zhǎng)序列,KCNK3基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將KCNK3-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列 進(jìn)行拼接得到;
[0075] N0TCH3-PG為由序列表中序列85-136所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2f-1與序列2f所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,f為43-68中的自然數(shù);N0TCH3-PG可滿足以下條件: 通過(guò)利用N0TCH3-PG以N0TCH3基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可 以獲得N0TCH3基因的全長(zhǎng)序列,N0TCH3基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將N0TCH3-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的序列進(jìn)行拼接得到;
[0076] CAVl-PG為由序列表中序列137-142所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2g-l 與序列2g所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,g為69-71中的自然數(shù);CAV卜PG可滿足以下條件:通過(guò) 利用CAVl-PG以CAVl基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲得 CAVl基因的全長(zhǎng)序列,CAVl基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將CAVl-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼 接得到;
[0077] ENG-PG為由序列表中序列143-164所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2h-l 與序列2h所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,h為72-82中的自然數(shù);ENG-PG可滿足以下條件:通過(guò) 利用ENG-PG以ENG基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲得ENG 基因的全長(zhǎng)序列,ENG基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將ENG-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得 到;
[0078] VIP-PG為由序列表中序列165-172所示的單鏈DNA組成的引物組,其中,序列2i-l 與序列2i所示的單鏈DNA為成對(duì)引物,i為83-86中的自然數(shù);VIP-PG可滿足以下條件:通過(guò) 利用VIP-PG以VIP基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以獲得VIP 基因的全長(zhǎng)序列,VIP基因的全長(zhǎng)序列可通過(guò)將VIP-PG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行拼接得 到。
[0079] 檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑中各單鏈DNA獨(dú)立包裝,各單 鏈DNA的摩爾數(shù)均相同。
[0080] 二、肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的檢測(cè)
[0081] 三個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者樣本家系圖如圖1所示,圖1中A為家系1的家系圖,B為家系2 的家系圖,C為家系3的家系圖。其中家系1有三個(gè)患者,其余均非肺動(dòng)脈高壓患者,另外二個(gè) 散發(fā)肺動(dòng)脈高壓患者(即家系2中患者和家系3中患者),其父母為均非肺動(dòng)脈高壓患者。
[0082] 按照下述方法利用步驟一的檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑 分別對(duì)該家系每個(gè)人的肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變進(jìn)行檢測(cè):
[0083] 1、基因組DNA的提取:
[0084] 取待檢測(cè)樣本抗凝全血,利用QIAGEN公司DNA提取試劑盒提取得到待檢測(cè)樣本基 因組DNA;
[0085] 2、多重PCR擴(kuò)增
[0086] 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:待檢測(cè)樣本基因組DNA 50ng;步驟一的檢測(cè)肺動(dòng)脈高 壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑(該成套試劑中所有單鏈DNA在該反應(yīng)體系中的總濃 度為 12.5mM);2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 10μ1;(ΜΗ2〇補(bǔ)至20μ1。
[0087] 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:98°C預(yù)變性5min; 98 °C變性30sec,55 °C退火30sec,72 。(:延伸45sec,循環(huán)20次;72°C終末延伸5min。
[0088] 將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用QIAGEN公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化,得到純化 后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0089] 3、建立文庫(kù)(用于二代測(cè)序,該步驟為二代測(cè)序上機(jī)前樣本制備)
[0090] 3 .IA-加尾
[0091 ] 反應(yīng)體系為:步驟2的純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μ1,10 Xblue buffer(Enzymatics, BOl I) I · 25μ1,dATP( lmM)2 · 5μ1 (Enzymatics公司),Klenow(3 ' -5 ' exo_) (Enzymatics公司, P7010-HC-L) 0 · 75μI,總體積為12 · 5μI。
[0092] 將上述反應(yīng)體系在37度下孵育30min,然后向反應(yīng)體系中加入25μ1 AMPure XP磁 珠 (Beckman Coulter ,Α63880,是一種能夠獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的核酸純化試劑盒;純化后 的核酸純度高,無(wú)鹽離子殘留,無(wú)需離心或過(guò)濾)進(jìn)行分選,得到成功加尾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 將成功加尾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶于8μ1溶解緩沖液中得到加尾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0093] 3.2接頭連接
[0094] 反應(yīng)體系:步驟3.1的加尾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7.5yl,2XRapid ligation buffer (Enzymatics 公司,BlOl ) 12 · 5μ1,Adapters( ΙΟμΜ) (Adptor 序列:InPEAl, GATCGGAAGAGCACACGTCT;InPEA2,ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT,經(jīng)退火后使用) 2.5yl,T4DNA Ligase(Enzymatics公司,1^603-!1(:-〇2.5以1,總體積為2541。
[0095] 將上述反應(yīng)體系在20度下孵育15min,然后向反應(yīng)體系中加入25μ1 AMPure XP磁 珠 (Beckman Coulter ,Α63880,是一種能夠獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的核酸純化試劑盒;純化后 的核酸純度高,無(wú)鹽離子殘留,無(wú)需離心或過(guò)濾)進(jìn)行分選,得到接頭連接成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物,將接頭連接成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶于23μ1溶解緩沖液中得到連接接頭的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0096] 3.3前擴(kuò)增
[0097] 反應(yīng)體系:步驟3.2的連接接頭的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11.5μl,PE1.0(25μM)(PE1.0序 列:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)0·5μ1,ΡΕ 2.0+ index(25yM)0.5yl,2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 12·5μ1,總體積為25μ1。其中,PE 2.0+index中的各單鏈DNA的序列如下:
[0098] InPE-2.0-1:
[0099] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0100] InPE-2.0-2:
[0101] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0102] InPE-2.0-3:
[0103] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0104] InPE-2.0-4:
[0105] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0106] InPE-2.0-5:
[0107] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0108] InPE-2.〇-6:
[0109] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0110] InPE-2.0-7:
[0111] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0112] InPE-2.0-8:
[0113] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0114] InPE-2.0-9:
[0115] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0116] InPE-2.0-10:
[0117] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0118] InPE-2.0-1I:
[0119] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0120] InPE-2.0-12:
[0121] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0122] InPE-2.0-13:
[0123] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0124] InPE-2.0-14:
[0125] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0126] InPE-2.0-15:
[0127] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0128] InPE-2.0-16:
[0129] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0130] InPE-2.0-17:
[0131] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0132] InPE-2.0-18:
[0133] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0134] InPE-2.0-19:
[0135] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0136] InPE-2.0-20:
[0137] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0138] 反應(yīng)條件為:98°C 預(yù)變性 2min;98°C 變性 30sec,65°C 退火 30sec,72°C 延伸 45sec, 循環(huán)16次;72°C終末延伸5min。
[0139] 反應(yīng)結(jié)束后將得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并用QIAGEN公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行 凝膠回收,將回收產(chǎn)物進(jìn)行定量(測(cè)序所需滿足的回收產(chǎn)物DNA的濃度為10-20ngAU)后進(jìn) 行ILUMINA Hiseq40000二代測(cè)序(ILUMINA公司二代測(cè)序平臺(tái))。
[0140] 測(cè)序結(jié)果表明該回收產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接得到了BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因這9個(gè)基因的全長(zhǎng)序 列,將這些序列與野生型的BMPR2基因(在NCBI中的序列號(hào)為NM_001204)、ACVRL1基因(在 NCBI中的序列號(hào)為NM_000020)、SMAD4基因(在NCBI中的序列號(hào)為NM_005359)、SMAD9基因 (在NCBI中的序列號(hào)為匪_001127217)、隊(duì)疆3基因(在叱81中的序列號(hào)為匪_002246)、 N0TCH3基因(在NCBI中的序列號(hào)為M1_000435)、CAV1基因(在NCBI中的序列號(hào)為匪_ 001172895)、ENG基因(在NCBI中的序列號(hào)為NM_000118)和VIP基因(在NCBI中的序列號(hào)為 NM_003381)中相應(yīng)基因的序列進(jìn)行比對(duì),確定待檢測(cè)樣本的各肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā) 生突變。
[0141] 結(jié)果顯示,家系1中的三個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者的BMPR2基因的第10 3 8位由胸腺嘧啶 (T)突變?yōu)榱税奏?C),導(dǎo)致BMPR2蛋白質(zhì)第347位由半胱氨酸突變?yōu)榱司彼?這三個(gè)肺 動(dòng)脈高壓患者的ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、 ENG基因和VIP基因的DNA序列均未發(fā)生突變。家系1中其他的非肺動(dòng)脈高壓患者的BMPR2基 因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP 基因的DNA序列均未發(fā)生突變。
[0142] 家系2中肺動(dòng)脈高壓患者的BMPR2基因的第1042位由鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)榱讼汆堰?(A),導(dǎo)致BMPR2蛋白質(zhì)第348位由纈氨酸突變?yōu)榱水惲涟彼?該患者的ACVRLl基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未發(fā)生 突變。該患者的父母的BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3 基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未發(fā)生突變。
[0143] 家系3中肺動(dòng)脈高壓患者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶(C)突變?yōu)榱诵叵汆?啶(T),導(dǎo)致ACVRLl蛋白質(zhì)第488位由精氨酸突變?yōu)榱松彼?該患者的BMPR2基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未發(fā)生 突變。該患者的父母的BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3 基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未發(fā)生突變。
[0144] 另外,利用現(xiàn)有的高通量測(cè)序方法(目的基因捕獲結(jié)合二代測(cè)序方法,由北京邁基 諾基因科技有限責(zé)任公司完成)對(duì)三個(gè)肺動(dòng)脈高壓患者樣本家系中的肺動(dòng)脈高壓患者及非 肺動(dòng)脈高壓患者的BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基 因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因進(jìn)行測(cè)序,該高通量測(cè)序結(jié)果表明這三個(gè)家系中的每個(gè)個(gè) 體的BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、 ENG基因和VIP基因的全長(zhǎng)序列與利用本發(fā)明的利用檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突 變的成套試劑檢測(cè)得到的這9個(gè)基因的全長(zhǎng)序列相同。
[0145] 通過(guò)在BMPR2基因的第1038位兩側(cè)設(shè)計(jì)引物,利用該引物分別對(duì)家系1中的三個(gè)肺 動(dòng)脈高壓患者的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三個(gè)肺動(dòng)脈 高壓患者的BMPR2基因的第1038位由胸腺嘧啶(T)突變?yōu)榱税奏?C)(圖2),與上述結(jié)果一 致。
[0146] 通過(guò)在BMPR2基因的第1042位兩側(cè)設(shè)計(jì)引物,利用該引物分別對(duì)家系2中的肺動(dòng)脈 高壓患者的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該肺動(dòng)脈高壓患 者的BMPR2基因的第1042位由鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)榱讼汆堰?A)(圖2),與上述結(jié)果一致。
[0147] 通過(guò)在ACVRLl基因的第1450位兩側(cè)設(shè)計(jì)引物,利用該引物分別對(duì)家系3中的肺動(dòng) 脈高壓患者的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該肺動(dòng)脈高壓 患者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶(C)突變?yōu)榱诵叵汆奏?T)(圖2 ),與上述結(jié)果一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的成套試劑,由BMPR2-PG、ACVRL1-PG、 SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAV1-PG、ENG-PG和/或 VIP-PG 組成;所述肺動(dòng)脈 高壓相關(guān)基因?yàn)锽MPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、 CAV1基因、ENG基因和/或VIP基因; 所述BMPR2-PG為由序列表中序列1-30所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述ACVRL1-PG為由序列31 -46所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述SMAD4-PG為由序列47-64所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述SMAD9-PG為由序列65-76所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述KCNK3-PG為由序列77-84所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述NOTCH3-PG為由序列85-136所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述CAV 1-PG為由序列137-142所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述ENG-PG為由序列143-164所示的單鏈DNA組成的引物組; 所述VIP-PG為由序列165-172所示的單鏈DNA組成的引物組。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的成套試劑,其特征在于:所述成套試劑中各單鏈DNA的摩爾數(shù) 均相同。3. 檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的系統(tǒng),包括權(quán)利要求1或2所述成套試劑和 Y1;所述Π 為進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑和/或儀器。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng),其特征在于:所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑為2 X ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix。5. 檢測(cè)或輔助檢測(cè)權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法,包括: 以待測(cè)人離體肺組織的基因組DNA為模板,利用權(quán)利要求1或2所述成套試劑進(jìn)行多重PCR擴(kuò) 增,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、 SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因 、CAV 1基因、ENG基因和VIP基因中相應(yīng)基因的序列進(jìn)行 比對(duì),確定所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變; 所述多重PCR擴(kuò)增在55 °C的退火溫度下進(jìn)行。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述多重PCR擴(kuò)增在55°C的退火溫度下退 火30秒。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述多重PCR擴(kuò)增在反應(yīng)體系1中進(jìn)行; 所述反應(yīng)體系1由所述待測(cè)人離體肺組織的基因組DNA、權(quán)利要求1或2所述成套試劑、2 X ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix和水組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于:所述反應(yīng)體系1中所述成套試劑的濃度為 12.5mM〇9. 下述任一應(yīng)用: XI、權(quán)利要求1或2所述成套試劑在制備預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)品中的應(yīng)用; X2、權(quán)利要求1或2所述成套試劑在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用; X3、權(quán)利要求1或2所述成套試劑在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓 相關(guān)基因是否發(fā)生突變產(chǎn)品中的應(yīng)用; X4、權(quán)利要求1或2所述成套試劑在檢測(cè)或輔助檢測(cè)權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān) 基因是否發(fā)生突變中的應(yīng)用; X5、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在制備預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)品中的應(yīng)用; X6、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用; X7、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因 是否發(fā)生突變產(chǎn)品中的應(yīng)用; X8、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在檢測(cè)或輔助檢測(cè)權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否 發(fā)生突變中的應(yīng)用; X9、權(quán)利要求5-8中任一所述方法在預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用。10.預(yù)測(cè)或輔助預(yù)測(cè)待測(cè)對(duì)象是否患有肺動(dòng)脈高壓的方法,包括:利用權(quán)利要求5-8中 任一所述的方法確定權(quán)利要求1中所述肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因是否發(fā)生突變,所述肺動(dòng)脈高 壓相關(guān)基因發(fā)生突變的待測(cè)對(duì)象患有肺動(dòng)脈高壓的風(fēng)險(xiǎn)高于或候選高于所述肺動(dòng)脈高壓 相關(guān)基因不發(fā)生突變的待測(cè)對(duì)象。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086190SQ201610464314
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】杜杰, 樸春梅, 劉婷婷, 鄭帥
【申請(qǐng)人】北京市心肺血管疾病研究所
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