用于檢測egfr基因t790m突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測EGFR基因T790M突變的試劑盒，包括檢測體系，檢測體系包括突變型檢測引物和探針(引物T790?FY、引物T790?RY和探針T790?PT)、野生型特異結(jié)合的PNA序列(T790M?PNA)，以及內(nèi)控引物和探針(引物NK?FY、引物NK?RY和探針NK?PT)；探針序列的5’端結(jié)合熒光報告基團，3’端結(jié)合熒光淬滅基團，且突變型檢測探針和內(nèi)控探針熒光報告基團不同。本發(fā)明是為T790M檢測特定設(shè)計的檢測組合，可以高靈敏度、高特異性地對T790M突變進行檢測，樣本只需外周血DNA，無創(chuàng)傷，可實時監(jiān)控病情，為肺癌新藥Tagrisso對T790M突變患者治療提供用藥指導(dǎo)。
【專利說明】
用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及腫瘤檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測EGFR基因 T790M突變的試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們對腫瘤的認識達到了分子水平。許多腫瘤相關(guān) 基因已被發(fā)現(xiàn)，腫瘤藥物的靶向治療也得到了很好的療效，根據(jù)不同藥物的療效與腫瘤基 因類型有相關(guān)性，采取檢測腫瘤基因類型能幫助臨床醫(yī)生采取精準的治療方案。美國食品 藥品監(jiān)督管理局于2003年5月批準了美國阿斯利康(Aotrazeneca)公司生產(chǎn)的小分子基因 靶點藥物吉非替尼（Gefitinib，也稱為易瑞沙/Iressa)用于治療晚期非小細胞肺癌 (NSCLC)。吉非替尼是一種口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，它對EGFR突變 的肺癌患者有很好的治療敏感性，通過抑制該酶的活性來抑制腫瘤的增長、增殖，卻無明顯 的化療副作用。
[0003] 但是據(jù)估計，約30-40 %的亞洲NSCLC患者在確診時攜帶EGFR突變，高達2/3的患者 在接受當(dāng)前已上市EGFR-TKI治療后病情進展產(chǎn)生T790M耐藥突變，使得EGFR-TKI失去了治 療效果，疾病無法控制。而Tagrisso將為這類患者提供一種重要的治療選擇，該藥可靶向參 與腫瘤發(fā)生的T790M耐藥突變的有效治療。英國制藥巨頭阿斯利康(AstraZeneca)在研肺癌 新藥Tagrisso(omisertinib，AZD9291)獲日本監(jiān)管機構(gòu)批準，用于對表皮細胞生長因子受 體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療有抵抗的EGFR T790M突變陽性(EGFR基因外顯子20 第790位密碼子出現(xiàn)C>T轉(zhuǎn)換，引起EGFR蛋白中該位點的氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔?即T790M)、手術(shù)無法治愈的或復(fù)發(fā)性非小細胞肺癌(NSCLC)的治療。對EGFR-TIK產(chǎn)出耐藥 的，明確檢測到T790M突變陽性的患者接受了 &8488〇(〇11^86^丨11訃4209291)治療后01^為 61 %，中位無進展生存期（PFS)為9.6個月。所以服用EGFR-TKI的肺癌患者需要定期檢查 T790M突變，監(jiān)控EGFR-TKI耐藥進展，幫助醫(yī)生選擇最佳治療方案，避免耽擱治療有效時機。
[0004] 目前，針對腫瘤基因突變的檢測方法主要有直接測序法、熒光定量PCR法和高分辨 率熔解曲線法。這些方法所需要的DNA樣本一般來自石蠟包埋的腫瘤組織，每次檢測需要手 術(shù)取組織或穿刺取樣，這種方法對病人身體會有不同程度的傷害，只能檢測較晚期的腫瘤， 導(dǎo)致治療滯后，治愈率低；而且腫瘤組織上的不同區(qū)域基因突變情況不同無法做到精確取 樣，所以組織樣本無法實現(xiàn)腫瘤遺傳信息的實時監(jiān)控，準確掌握腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)過程。 而實時監(jiān)控，準確掌握疾病發(fā)展的動態(tài)過程，恰恰是醫(yī)療大數(shù)據(jù)、精準醫(yī)學(xué)和個性化治療迫 切需求的。
[0005] 近年的研究發(fā)現(xiàn)，從腫瘤患者的外周血游離DNA中，可以檢測到全身各處原發(fā)灶的 多種異?；?，是一種無創(chuàng)性腫瘤診斷的新方法，也為腫瘤早期診斷提供了新的希望。目前 針對ctDNA的檢測方法有熒光定量PCR法、數(shù)字PCR法和二代測序分析法，但由于游離DNA在 血液中的含量較少，而且游離DNA中的T790M突變DNA就更少，現(xiàn)有的EGFR多位點聯(lián)合qPCR方 法檢測試劑盒的靈敏度（只有1 %的靈敏度)和精密度很難達到要求，而且大多EGFR多位點 檢測不能做到T790M位點的單獨分型，市場上需要一種單獨檢測T790M突變的試劑盒。數(shù)字 PCR雖然有較高的靈敏度但是它的檢測通量小、設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、易污染，造成臨床推廣 很困難。二代測序ctDNA分析技術(shù)有較好的檢測靈敏度和多重基因檢測能力，同時也能檢測 未知突變，但是一次檢測在上萬元費用，不利于單個明確的T790M目標(biāo)基因的檢測，給患者 帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。
[0006] 腫瘤患者的T790M耐藥進展需要定期進行基因檢測，現(xiàn)有的檢測技術(shù)需要手術(shù)獲 取腫瘤組織樣本，然而每次檢測都需要做手術(shù)取樣本的方法在醫(yī)學(xué)上和操作上都非常不可 行，為精準治療帶來很大障礙。比如組織取樣只能分布取樣，然后腫塊的每一個區(qū)域的基因 突變情況都有著很大的不同，檢測結(jié)果具有隨機性。而且當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫塊的時候病情已經(jīng)有了 很大的進展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明設(shè)計了一種用于檢測EGFR基因 T790M突 變的試劑盒，可以從人類外周血中富集提取循環(huán)腫瘤游離DNA(ctDNA)為模板進行qPCR基因 突變檢測，避免了通過手術(shù)或穿刺對患者身體的傷害。該研發(fā)該試劑盒的另一個目的是提 高檢測靈敏度。本發(fā)明的再一目的是提高檢測特異性。
[0008] 本發(fā)明提供的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，包括檢測體系，所述檢測體 系包括突變型檢測引物和探針、野生型特異結(jié)合的PNA序列，以及內(nèi)控引物和探針；
[0019] 探針序列的5'端結(jié)合熒光報告基團，3'端結(jié)合熒光淬滅基團，且突變型檢測探針 和內(nèi)控探針序列兩端結(jié)合的熒光報告基團不同。
[0020] 上述引物和探針設(shè)計，采用了 ARMS、Taqman和PNA聯(lián)合技術(shù)。
[0021 ] 等位基因特異性擴增(Alleles specific amplification，ASA)-又稱擴增阻礙突 變系統(tǒng)（Amplification refractory mutation system，ARMS)，利用PCR引物的3'端末位喊 基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設(shè)計等位基因特異性PCR擴增引物，在嚴格 的條件下，只有在引物3'堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴增帶，從而檢測出突變，該法省 去了探針雜交操作。
[0022] TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3 ' -5 '外切核酸 酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就 代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。 探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基 團(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有焚光淬滅基團（Quencher，Q)。
[0023] 肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)是20世紀90年代初發(fā)現(xiàn)的新型DNA/RNA同 類物，是一種人工合成的以電中性的肽鏈酰胺2-氨乙基甘氨酸組成、多聚酰胺鍵取代DNA中 的戊糖磷酸二酯鍵骨架而形成的類似核苷酸的物質(zhì)。由于特異的T790M野生型PNA與T790M 野生型DNA穩(wěn)固結(jié)合后不被DNA聚合酶3 ' -5 '端酶切功能所切割，阻礙T790M野生型DNA的PCR 擴增，從而實現(xiàn)T790M突變型的篩選。
[0024] 本發(fā)明通過ARMS+Taqman+PNA聯(lián)合技術(shù)，以腫瘤患者外周血血漿中提取的游離DNA 為檢測模板，檢測靈敏度能夠達到〇. 1~〇 . 5 %，解決了現(xiàn)有的EGFR多位點聯(lián)合qPCR方法檢 測的靈敏度和特異性很難達到要求，且大多EGFR多位點檢測不能做到T790M位點的單獨分 型的問題。
[0025] 優(yōu)選地，上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，突變型檢測探針結(jié)合的熒光 報告基團為FAM，熒光淬滅基團為BHQ1;內(nèi)控探針序列結(jié)合的熒光報告基團為J0E，熒光淬滅 基團為BHQ1。
[0026]優(yōu)選地，以上所述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，還包括外控體系，所述 外控體系包括外控qPCR反應(yīng)引物和探針，核苷酸序列為：
[0030] 探針WK-PT的5'端結(jié)合熒光報告基團，3'端結(jié)合熒光淬滅基團，且熒光報告基團與 內(nèi)控探針結(jié)合的熒光報告基團不同。
[0031] 外控體系擴增有效DNA片段的反應(yīng)組，用于對有效DNA量的監(jiān)控。同一個反應(yīng)組里 的不同探針需要有信號區(qū)分，所以外控體系探針WK-PT的熒光報告基團應(yīng)不同于內(nèi)控探針 NK-PT的熒光報告基團。
[0032] 優(yōu)選地，上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，探針WK-PT的5 '端結(jié)合的熒 光報告基團為FAM，3'端結(jié)合的熒光淬滅基團為BHQ1。
[0033] 優(yōu)選地，上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，還包括無菌水、緩沖液 bufferlOX、dNTPs，以及HS TaqJS Taq是熱啟動Taq DNA聚合酶。
[0034]優(yōu)選地，上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其中各成分用量為：
[0035]檢測體系：

[0039] 本發(fā)明還提供了上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒的使用方法，包括以 下步驟：
[0040] (1)提取待檢測外周血的DNA作為待檢測樣品，準備好突變型陽性對照和超純水陰 性對照；
[0041 ] (2)待檢測樣品、陽性對照和陰性對照分別加入熱啟動Taq DNA聚合酶，混勻;混合 后的待檢測樣品、陽性對照和陰性對照三個樣品，分別加入到檢測體系和外控體系中，即每 個樣品對應(yīng)一個檢測體系和一個外控體系;進行實時熒光定量PCR反應(yīng);收集FAM和J0E熒光 信號；
[0042] (3)檢測結(jié)果判定：
[0043] 外控體系FAM信號Ct值需要滿足：12^Ct<22;陽性對照的ACt需要滿足:20<Λ Ct<26;陰性對照的Ct值需要滿足:Ct>28;
[0044]然后按照以下標(biāo)準進行結(jié)果判定：
[0046]其中，Λ Ct值=檢測信號CT值-外控信號CT值，CT值是熒光信號值閾值下的PCR擴 增循環(huán)數(shù)。
[0047] 優(yōu)選地，上述用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒的使用方法，熒光定量PCR反 應(yīng)程序如下：
[0048] 第一階段：95°C5min;
[0049] 第二階段:951€2〇8,621€2〇8，15個循環(huán)；
[0050] 第三階段：95°C20s，60°C40s，31個循環(huán)；
[00511信號收集:第三階段60°C時收集FAM和J0E信號。
[0052]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0053] 本發(fā)明從腫瘤患者的外周血游離DNA中，通過ARMS+Taqman+PNA聯(lián)合技術(shù)設(shè)計的檢 測試劑盒，可以高靈敏度、高準確性地檢測到腫瘤組織各處來源的T790M異常基因，提供了 一種無創(chuàng)性腫瘤診斷的新方法，也為腫瘤早期診斷提供了新的希望?，F(xiàn)有的EGFR多位點聯(lián) 合qPCR方法檢測試劑盒的靈敏度和精密度很難達到要求，而且大多EGFR多位點檢測不能做 到T790M位點的單獨分型。本發(fā)明是為T790M檢測單獨設(shè)計的檢測組合，專為肺癌新藥 Tagrisso對T790M突變患者治療的用藥指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0054]圖1:實時熒光定量PCR反應(yīng)程序示意圖；
[0055] 圖2:陰性樣品實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果分析圖；
[0056] 圖3:陽性樣品實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果分析圖。
【具體實施方式】
[0057] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的 理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0058] 實施例1:臨床樣本處理
[0059] 本實施例是從非小細胞肺癌患者外周血中提取腫瘤游離DNA，具體詳述如下。
[0060] 1、樣本處理
[00611 (1)20位腫瘤患者，每位抽取5ml靜脈血分別放入EDTA抗凝管中，這些患者是做過 石蠟包埋組織檢測的，他們的T790M突變類型已知，做好標(biāo)記4°C保存。需要在3小時內(nèi)將外 周血進行離心分離出血漿。
[0062] (2)將抗凝血放于離心機中離心，離心條件為800g，lOmin，用移液器分別將最上層 的血漿層取到新的2ml EP管中，20份血漿做好標(biāo)記放入-70°C保存。采用武漢海吉力生物科 技出品的ctDNA提取試劑盒提取DNA，提取到的DNA做好標(biāo)記放-20冰箱°C保存。
[0063] 實施例2:游離DNA提取
[0064] 一、使用前準備：
[0065]需自備的試劑耗材有純水、無水乙醇、1.5/5ml離心管。試劑中的1.5ml離心管專用 于收集步驟"6"的洗脫液。
[0066] 按照武漢海吉力生物科技出品的ctDNA提取試劑盒(含有Wl、W2、溶液GH，溶液TE， 和蛋白酶K，即Proteinase K)使用說明進行操作。
[0067]每瓶W1在首次使用前加入10ml無水乙醇（自備)并混勻;每瓶溶液W2在首次使用前 加入24ml無水乙醇（自備）并混勻；每管蛋白酶K首次使用前用550μ1純水（自備）溶解后使 用。
[0068] 洗脫前加熱溶液ΤΕ至60°C，有助于提高提取收率。
[0069]全部離心操作均在室溫下進行。
[0070] 二、操作步驟
[0071] 1.將20份血漿樣本分別吸取500~ΙΟΟΟμΙ，加入與血漿等體積的溶液GH，混勻。加 入 10μ1 Proteinase Κ，游禍混合lSsecJiO溫育10min。
[0072] 2.加入與GH等體積的無水乙醇（自備），充分混勻。將混勻液全部移入套有收集管 的mini離心柱中。最高轉(zhuǎn)速(>12000g)離心2min。小心取出離心柱（勿讓離心柱碰到溶液）， 棄去收集管中廢液，將離心柱放回收集管中。
[0073] 3.加550μ1溶液W1于離心柱中，最高轉(zhuǎn)速(>12000g)離心lmin。取出離心柱然后棄 去離心管中廢液，將離心柱放回收集管。
[0074] 4.加550μ1溶液W2于離心柱中，最高轉(zhuǎn)速(>12000g)離心lOsec。取出離心柱然后棄 去離心管中廢液，將離心柱放回收集管。
[0075] 5 ·最高轉(zhuǎn)速(>12000g)離心 2min。
[0076] 6.將離心柱取出并放入試劑盒自帶的1.5ml離心管中，加入50~100μΙ溶液TE，靜 止2~3min，最高轉(zhuǎn)速(>12000g)離心lmin，DNA溶液即被收集在1.5ml離心管中。
[0077] 7.定量:將提取的20份DNA用紫外分光光度計進行定量，調(diào)整DNA濃度到1~3ngAi 1〇
[0078]實施例3:實時熒光PCR法擴增臨床樣本DNA
[0079] 進行實驗操作的PCR實驗室應(yīng)具有3個不同分區(qū)，分別為試劑準備間、樣本提取間 和擴增間。
[0080] 試劑配制如下：
[0081] 1.檢測體系：
[0084] 2.外控體系：

[0086] 實驗過程如下：
[0087] (1)在試劑準備間取一支超純水用于試劑檢測的陰性對照，試劑按上表配好后分 裝于8聯(lián)PCR反應(yīng)條中，每個反應(yīng)孔為35μ1，一個檢測孔和一個外控孔為一人份檢測組，每條 8聯(lián)PCR反應(yīng)條可以檢測4個人份。
[0088] (2)在樣本制備間取出陽性對照，先解凍再混勻。然后將裝好試劑的8聯(lián)PCR反應(yīng) 條、熱啟動Taq DNA聚合酶和陽性對照分別快速離心。
[0089] (3)在樣本制備間分別取20份樣本的游離DNA各10μ 1與1 μ 1的熱啟動Taq DNA聚合 酶在渦旋器上混勻。取超純水陰性對照和陽性對照各1〇μ1，分別加入ΙμL熱啟動Taq DNA聚 合酶在渦旋器上混勻。
[0090] (4)輕輕揭開8聯(lián)PCR反應(yīng)條蓋，將混好熱啟動Taq DNA聚合酶的樣品、陰性對照和 陽性對照，加入到8聯(lián)PCR條中。每個PCR反應(yīng)孔加 5μ1。
[0091] (5)蓋上8聯(lián)PCR反應(yīng)條蓋，簡單離心。
[0092] (6)將8聯(lián)PCR反應(yīng)條放入實時定量PCR儀中。
[0093] (7)設(shè)置PCR程序(參見圖1):
[0094] 第一階段：95°C5min;
[0095] 第二階段：95 °C 20s，62 °C 20s，15個循環(huán)；
[0096] 第三階段：95°C20s，60°C40s，31 個循環(huán)；
[0097]信號收集:第三階段60°C時收集FAM和J0E信號。
[0098]經(jīng)過80分鐘后，得到熒光定量PCR的結(jié)果。陰性樣品和陽性樣品的結(jié)果分析參見圖 2和圖3。
[0099] (8)T790M突變檢測結(jié)果分析
[0100]檢測結(jié)果，外控體系FAM信號Ct值需要滿足：12 < Ct<22;陽性對照的Act需要滿 足：20<ACt<26;陰性對照的Ct值需要滿足:Ct>28;如果上述這幾項條件中有一項不符 合要求，需要重新做實驗。
[0101]然后按照以下標(biāo)準進行結(jié)果判定：
[0103] 其中，Λ Ct值=檢測信號CT值-外控信號CT值，CT值是熒光信號值閾值下的PCR擴 增循環(huán)數(shù)。
[0104] 判定結(jié)果參見下表1。
[0105]表1結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計
[0106]
[0107]以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
【主權(quán)項】
1. 用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，包括檢測體系，所述檢測體系 包括突變型檢測引物和探針、野生型特異結(jié)合的PNA序列，以及內(nèi)控引物和探針； (1) 突變型檢測引物和探針序列如下： 引物 T790-FY: CACCATGCGAAGCCACTCTGAC， 引物 T790-RY: GCCGAAGGGCATGAGCTACA， 探針 T790-PT: atgagctgcacggtggaggtgaggc; (2) 野生型特異結(jié)合的PNA序列如下： T790M-PNA：GAGCTGCGTGATGAGC； (3) 內(nèi)控引物和探針序列如下： 引物 NK-FY: CACCATGCGAAGCCACTCTGAC， 引物 NK-RY: GCGATCATAATTCCTCTGCACATAGG， 探針 NK-PT: ccacctcacagttattgaacatcctctggagg; 探針序列的5'端結(jié)合熒光報告基團，3'端結(jié)合熒光淬滅基團，且突變型檢測探針和內(nèi) 控探針序列兩端結(jié)合的熒光報告基團不同。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，突變型 檢測探針結(jié)合的熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為BHQl;內(nèi)控探針序列結(jié)合的熒光報告 基團為JOE，熒光淬滅基團為BHQl。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，還包 括外控體系，所述外控體系包括外控qPCR反應(yīng)引物和探針，核苷酸序列為： 引物 WK-FY: CTTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG， 引物 WK-RY: CCTCTGCACATAGGTAATTTCCAAATTC， 探針 WK-PT: ccacctcacagttattgaacatcctctggagg; 探針WK-PT的5'端結(jié)合熒光報告基團，3'端結(jié)合熒光淬滅基團，且熒光報告基團與內(nèi)控 探針結(jié)合的熒光報告基團不同。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，探針WK-PT的5'端結(jié)合的熒光報告基團為FAM，3'端結(jié)合的熒光淬滅基團為BHQ1。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，還包括 無菌水、緩沖液buffer 10X、dNTPs，以及HS Taq。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測EGFR基因 T790M突變的試劑盒，其特征在于，各成分 用量為： 檢測體系： 試齊 IJ_____ 無菌水 一 658μ1 緩沖液 bufferlOX__IOX__280μ1_ dNTPs__2.5mM__105μ1_ 引物 T790-FY__l〇m__28μ1_ 引物 T790-RY__l〇m__28μ1_ 探針 Τ790-ΡΤ__l〇m__14μ1_ PNA序歹}J__l〇m__35μ1_ 引物NK-FY I ΙΟμΜ I 28μ1 引物 NK-RY__l〇m__28μ1_ 探針 NK-PT__l〇m__14μ1_ HSTaq__2 · 5UM__17.5μ1_ 外控體系:___ 試齊 IJ_____ 無囷水 一 742yl 緩沖液 bufferlOX__IOX__280μ1_ dNTPs__2.5mM__105μ1_ 引物 WK-FY__l〇m__28μ1_ 引物 WK-RY__l〇m__28μ1_ 探針 wK-ρτ__iom__?4μL_ HSTaq__2 · 5UM__17.5μ1_7. 權(quán)利要求6所述的用于檢測EGFR基因 Τ790Μ突變的試劑盒的使用方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 提取待檢測外周血的DNA作為待檢測樣品，準備好突變型陽性對照和超純水陰性對 昭. (2) 待檢測樣品、陽性對照和陰性對照分別加入熱啟動Taq DNA聚合酶，混勻;混合后的 待檢測樣品、陽性對照和陰性對照三個樣品，分別加入到檢測體系和外控體系中，即每個樣 品對應(yīng)一個檢測體系和一個外控體系；進行實時熒光定量PCR反應(yīng);收集FAM和JOE熒光信 號； (3) 檢測結(jié)果判定： 外控體系FAM信號Ct值需要滿足：12 ^ Ct<22;陽性對照的ACt需要滿足:20<ACt< 26;陰性對照的Ct值需要滿足:Ct>28; 然后按照以下標(biāo)準進行結(jié)果判定:__ 檢測體系FAM信號Ct及ACt I結(jié)果判定 (^<29且厶(^<6___ Ct<29 且 6<ACt<10__IIPH_ Ct 2 29且 ACt 2 10或無值___ 其中，Λ Ct值=檢測信號CT值-外控信號CT值，CT值是熒光信號值閾值下的PCR擴增循 環(huán)數(shù)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測EGFR基因 Τ790Μ突變的試劑盒的使用方法，其特征在 于，熒光定量PCR反應(yīng)程序如下： 第一階段:95°C5min; 第二階段:95 °C 20s，62 °C 20s，15個循環(huán)； 第三階段:951€2〇8,6〇1€4〇8,31個循環(huán)； 信號收集:第三階段60 °C時收集FAM和JOE信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886648SQ201610393487
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】郭驍, 趙珊珊, 趙平鋒
【申請人】武漢海吉力生物科技有限公司