一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb³⁺熒光的microRNA檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光的microRNA檢測方法，屬于光學生物傳感技術領域?；诰酆厦窴lenow片段和末端脫氧核苷酸轉移酶的共同催化作用，將microRNA有效延伸成長度較長的富鳥嘌呤DNA序列，富鳥嘌呤DNA序列通過共振能量轉移效應可增強Tb3+的熒光。Tb3+的熒光強度與microRNA濃度的對數(shù)成正比，據此實現(xiàn)microRNA的高靈敏檢測。
【專利說明】
一種基于富鳥嘌昤DNA敏化Tb3+熒光的m i croRNA檢測方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光的microRNA檢測方法，屬于光學生物傳感技術領域。
【背景技術】
[0002]成熟的microRNA是一類單鏈、非編碼蛋白、長度約為19-23個核苷酸的短的內源性RNAt3MicroRNA作為重要的基因表達的后轉錄調控因子，可調節(jié)信使核糖核酸的降解或翻譯抑制。MicroRNA在許多生物進程中起著重要作用，不僅包括癌癥的早期診斷和預后指標，還包括介入治療以及癌癥藥物的發(fā)現(xiàn)。所以，開發(fā)靈敏度高且選擇性好的microRNA檢測方法非常必要。體外聚合核苷酸因具有顯著的信號放大能力，作為一個強有力的工具廣泛應用于生物分析中。在研究microRNA的檢測方法方面，體外聚合核苷酸顯示出巨大的應用潛能，目前常用的檢測方法有聚合酶鏈反應、滾環(huán)擴增反應以及鏈置換反應等，但是這些檢測方法靈敏度低、耗時、復雜或者需要昂貴的試劑。因此，探索經濟方便、靈敏度和特異性高的mi croRNA檢測新方法非常必要。
[0003]稀土離子(Ln3+)有獨特的4f軌道，因而具有非凡的光學性質。然而，Ln3+的f-f變迀被自旋-禁止使得其吸收很弱，直接激發(fā)Ln3+發(fā)射熒光非常困難。Ln3+可以和很多配體(如，有機分子、納米粒子、多肽和寡核苷酸鏈等)螯合，通過“天線”效應而發(fā)射熒光，從而可解決以上問題。Ln3+螯合物的熒光通常源于分子間的能量轉移，從配體的三重激發(fā)態(tài)到Ln3+的電子態(tài)，鋱離子(Tb3+)是一個典型例子，經配體敏化的Tb3+螯合物具有優(yōu)越的長Stokes位移和尖銳的發(fā)射光譜等光學性質。近年來，單鏈DNA(ssDNA)作為Tb3+的配體，受到越來越多的關注。當Tb3+和ssDNA相互作用時，發(fā)生能量轉移而導致Tb3+熒光增強，尤其是Tb3+與富鳥嘌呤的ssDNA的作用使得Tb3+熒光大大增強，而雙鏈DNA卻不能增強Tb3+的熒光。因此，我們將富鳥嘌呤(G )堿基DNA序列與Tb3+之間的共振能量轉移效應應用于me i roRNA檢測中，提出一種新穎的基于稀土離子焚光增強的microRNA分析方法，并用于復雜樣品中microRNA的檢測。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA檢測方法，該方法對microRNA的檢測具有靈敏、簡單、快速的優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA檢測方法，其特征在于，當microRNA存在時，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復合物；加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復合物中引物的3’-羥基末端，催化引物延伸反應，生成與模板DNA互補的短DNA序列；末端脫氧核苷酸轉移酶將含有脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脫氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羥基末端，催化混合脫氧三磷酸核糖核苷酸沿著短DNA序列的5’端到3’端延伸而形成聚富鳥嘌呤堿基序列；加入Tb3+，富鳥嘌呤DNA序列與Tb3+相互作用發(fā)生共振能量轉移，增強了 Tb3+的熒光，Tb3+的熒光強度隨microRNA濃度的增加而增強，根據Tb3+的熒光強度判斷microRNA的濃度，據此實現(xiàn)對microRNA的高靈敏檢測。
[0006]本發(fā)明采用以下技術方案:一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光的microRNA檢測方法，
(I)雙聚合酶延伸富鳥嘌呤DNA序列:將模板DNA和mi croRNA與三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液混合，在55 °(:退火雜交10 min，冷卻至室溫后，加入聚合酶Klenow片段和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等溫反應30 min，超濾除去過量的脫氧三磷酸腺嘌呤核苷后，向得到的溶液中加入含0.6 mM脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷、0.4 mM脫氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脫氧核苷酸轉移酶的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，在37 °C水浴中等溫反應2.5 h，生成富鳥嘌呤DNA序列；
(2 )熒光法檢測mi croRNA濃度:將Tb3+加入到步驟(I)生成的富鳥嘌呤DNA序列溶液中，室溫孵育10 min后，在光程為I cm的石英池中、激發(fā)波長為290 nm、光譜掃描范圍為450nm-610 nm的條件下，測量發(fā)射波長545 nm處的焚光光譜;microRNA濃度越大，生成的長的富鳥嘌呤DNA序列越多，富鳥嘌呤DNA序列與Tb3+相互作用發(fā)生的共振能量轉移越強，Tb3+的熒光越強，根據Tb3+的熒光強度可實現(xiàn)microRNA的高靈敏檢測。
[0007]上述方法中，所述的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液的濃度為10mM，pHS7.9，含50 mM NaCl和10 mM MgCl2。所述的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液的濃度為20 mM,pH為7.9，含50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
[0008]本發(fā)明的技術效果是:本發(fā)明利用聚合酶Klenow片段和末端脫氧核苷酸轉移酶的共同催化作用，將microRNA延伸成長度較長的富鳥嘌呤DNA序列，富鳥嘌呤DNA序列通過共振能量轉移效應可增強Tb3+的熒光，Tb3+的熒光強度與microRNA濃度的對數(shù)成正比，據此實現(xiàn)microRNA的高靈敏檢測，該方法具有靈敏、簡單、快速的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0009]圖1是基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光檢測microRNA的原理圖。
[0010]圖2是(A)熒光光譜圖:(a)含和(b)不含microRNA-2U(B)將Tb3+加入到不同反應溶液中的熒光光譜圖。
[0011 ]圖3是不同濃度microRNA-21 (O，I，2，5，10，20，50，100，200，500，1000 pM)存在時的熒光光譜圖，內插圖為熒光強度與microRNA-21濃度的對數(shù)關系曲線。
[0012]圖4是分析方法的特異性:Blank，microRNA_141，microRNA_210，單堿基錯配的microRNA-2 l(SM),完全互補的mi croRNA -21 (PM)0
[0013]圖5是實際樣品檢測:Blank，A549和MCF-7。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，本發(fā)明并不限于此。
[0015]實施例1
(I)雙聚合酶延伸富鳥嘌呤DNA序列:將模板DNA(pDNA)和microRNA與三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液混合，在55 °C退火雜交10 min，冷卻至室溫，使得引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復合物;加入聚合酶Klenow片段和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等溫反應30 min，使聚合酶Klenow片段綁定在引物-模板復合物中引物的3’-羥基末端，催化引物延伸反應，生成與模板DNA互補的短DNA序列;超濾除去過量的脫氧三磷酸腺嘌呤核苷后，加入含0.6 mM脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷、0.4 mM脫氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脫氧核苷酸轉移酶的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，在37 ° C水浴中等溫反應2.5h，末端脫氧核苷酸轉移酶將含有脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脫氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羥基末端，催化混合脫氧三磷酸核糖核苷酸沿著短DNA序列的5 ’端到3 ’端延伸而形成聚富鳥嘌呤DNA序列；
(2)熒光法檢測microRNA濃度:將2 μΜ Tb3+加入到生成的富G堿基DNA序列溶液中，室溫孵育10 min后，Tb3+與富G堿基DNA發(fā)生螯合反應，在光程為I cm的石英池中、激發(fā)波長為290 nm、光譜掃描范圍為450 nm-610 nm的條件下，測量發(fā)射波長545 nm處的熒光光譜；microRNA濃度越大，生成的長的富G堿基DNA序列越多，富G堿基DNA序列與Tb3+相互作用發(fā)生的能量共振轉移越強，Tb3+在水中的熒光越強，根據Tb3+的熒光強度可實現(xiàn)microRNA的高靈敏檢測。檢測原理如圖1所示。
[0016]由圖2A可見，當存在microRNA-21，最佳激發(fā)波長為290 nm時，在545 nm處出現(xiàn)了強的熒光發(fā)射峰(曲線a)，對應于Tb3+的特征發(fā)射峰。當存在microRNA-21時，Tb3+之所以會出現(xiàn)強特征發(fā)射峰，是因為生成的大量的富G堿基DNA序列能夠通過共振能量轉移將能量傳遞給Tb3+，這也同時證明了在microRNA存在的情況下，通過雙酶聚合反應生成了大量的富G堿基DNA序列。然而，在相同的反應條件下，當沒有microRNA-21時，在545 nm處沒有明顯的熒光峰出現(xiàn)(曲線b)。以上結果表明，在沒有microRNA-21時不能合成出為Tb3+提供能量的富G堿基DNA序列，因而在545 nm處沒有Tb3+的熒光光譜峰出現(xiàn)。而當有microRNA-21存在時，在545 nm處有強的熒光光譜峰出現(xiàn)，表明合成了大量的可以與Tb3+進行共振能量轉移的富G堿基DNA序列。進而通過一系列對照實驗對檢測方法的可行性進行分析，由圖2B可見，只有當pDNA、microRNA、polymerases、dNTPs和Tb3+全部存在時，才生成富G堿基的DNA序列，才能產生顯著的Tb3+的特征光譜，進而實現(xiàn)對microRNA的檢測。
[0017]實施例2
考察了熒光光譜強度隨著microRNA-21濃度的變化規(guī)律。由圖3可見，Tb3+的熒光強度隨microRNA-21濃度的增加而增強，在microRNA-21濃度為I pM到I nM范圍內，Tb3+的熒光強度與mi croRNA-21濃度的對數(shù)呈良好的線性關系(內插圖)，該方法對microRNA-21的檢測限為100 fMo
[0018]實施例3
為了評估本方法對microRNA-21檢測的特異性，我們開展了一系列對照實驗，包括采用兩種 microRNAs(microRNA_210和 microRNA-141)、單喊基錯配(SM)microRNA_21 為陰性對照、以及不含mi croRNA-21的樣品為空白對照(BI ank )，結果如圖4所示。Mi cr oRNA_210和microRNA-141存在時，Tb3+的熒光強度與空白對照的熒光強度相比沒有顯著增加;單堿基錯配microRNA-21存在時，Tb3+的熒光強度與空白對照的熒光強度相比有較小增強;然而，完全互補(PM)microRNA-21存在時，Tb3+的熒光強度與空白對照的熒光強度相比顯著增強。由此可見，本方法可以區(qū)別完全互補和非互補的microRNA，即使它們只有一個堿基的差異也能區(qū)別出來，具有良好的特異性。
[0019]我們將本方法應用于定量檢測從人類乳腺癌細胞(MCF-7)和人類肺癌表皮細胞(A549)提取的細胞溶解產物中microRNA-21的表達含量。由圖5可見，A549細胞溶解產物中Tb3 +的熒光強度比空白對照的熒光強度有所增加，表明在A549肺癌細胞中含有少量microRNA-21。而MCF-7細胞溶解產物中Tb3+的熒光強度與空白對照的熒光強度相比顯著增強，表明MCF-7乳腺癌細胞中microRNA-21的含量比較高。以上結果表明，本方法可用于細胞溶解產物等復雜生物樣品中microRNA的定量分析，具有良好的應用前景。
【主權項】
1.一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光的microRNA檢測方法，其特征在于步驟如下: (1)雙聚合酶延伸富鳥嘌呤DNA序列:將模板DNA和microRNA與三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液混合，在55 °(:退火雜交10 min，冷卻至室溫后，加入聚合酶Klenow片段和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等溫反應30 min，超濾除去過量的脫氧三磷酸腺嘌呤核苷后，向得到的溶液中加入含0.6 mM脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷、0.4 mM脫氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脫氧核苷酸轉移酶的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，在37 °C水浴中等溫反應2.5 h，生成富鳥嘌呤DNA序列； (2)熒光法檢測microRNA濃度:將Tb3+加入到步驟(I)生成的富鳥嘌呤DNA序列溶液中，室溫孵育10 min后，在光程為I cm的石英池中、激發(fā)波長為290 nm、光譜掃描范圍為450nm-610 nm的條件下，測量發(fā)射波長545 nm處的焚光光譜;microRNA濃度越大，生成的長的富鳥嘌呤DNA序列越多，富鳥嘌呤DNA序列與Tb3+相互作用發(fā)生的共振能量轉移越強，Tb3+的熒光越強，根據Tb3+的熒光強度可實現(xiàn)microRNA的高靈敏檢測。2.根據權利要求1所述的一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA檢測方法，其特征在于:當microRNA存在時，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復合物;加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復合物中引物的3’-羥基末端，催化引物延伸反應，生成與模板DNA互補的短DNA序列;末端脫氧核苷酸轉移酶將含有脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷和脫氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脫氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羥基末端，催化混合脫氧三磷酸核糖核苷酸沿著短DNA序列的5’端到3’端延伸而形成聚富鳥嘌呤堿基序列；加入Tb3+，富鳥嘌呤DNA序列與Tb3+相互作用發(fā)生共振能量轉移，增強了Tb3+的熒光，Tb3+的熒光強度隨microRNA濃度的增加而增強，根據Tb3+的熒光強度判斷microRNA的濃度，據此實現(xiàn)對microRNA的高靈敏檢測。3.如權利要求1所述的一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA檢測方法，其特征在于步驟(I)中，所述的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液的濃度為10 !1^，？!1為7.9，含50 mM NaCl和10 mM MgCl2。4.如權利要求1所述的一種基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA檢測方法，其特征在于步驟(I)中，所述的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液的濃度為20 !1^，？!1為7.9，含.50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
【文檔編號】C12Q1/68GK106086183SQ201610441511
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】梁汝萍, 遲寶珠, 邱建丁
【申請人】南昌大學