專利名稱：Ral GTP鳥嘌呤解離刺激因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)所述多肽的方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽是Ral GTP酶的鳥嘌呤解離刺激因子(RalGDS)家族的一個新成員。
Ras基因與細胞的生長、分化和轉移性有密切關系，特別是該基因的突變往往與癌癥的發(fā)生有關(Barbacid，M.(1987)Annu.rev.Biochem.56，.779-827)Ras通過與被稱之為效應物的底物作用發(fā)揮其功能。目前已發(fā)現(xiàn)了多種Ras的效應物，包括Raf、PI(3)激酶的p110亞基、RalGDS家族、Byr2(S pombe)、Adenylyl cyclase(S.cerevisiae)Rin、AF6、canoe、PKC-ζ和MEKK-1等(McCormick，F(xiàn).and Wittinghofer，A.(1996)Current Opinion in Biotechnology.7，449-456)。Ras可以通過幾個不同的信號傳遞途徑發(fā)揮功能，目前了解得最為清楚的是Raf/MAPK(mitogen-activated protein kinase)途徑。
但是近幾年越來越多的研究表明，存在著Ras-RalGDS-Ral這樣一個不依賴于Raf的新的途徑，從而RalGDS家族在Ras功能中起著重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的RalGDS家族成員大多數(shù)都被證明具有催化結合于Ral蛋白上的GDP(非活化狀態(tài))解離的功能，從而促使Ral向其活化狀態(tài)(與GTP結合)轉化。實驗表明，許多RalGDS家族成員都能與Raf協(xié)同作用，增強其在誘導癌變方面的作用，并且，這種協(xié)同作用不是通過增強Raf途徑的作用而實現(xiàn)的。有的RalGDS家族成員還被發(fā)現(xiàn)能與TC21的活化狀態(tài)結合，它們可能參與了TC21在誘導腫瘤方面的作用。除Ras(或TC21)外，許多RalGDS家族成員還能與Rap蛋白結合。Rap也是Ras家族的一個成員，但是，與眾不同的是，它能夠抑制Ras致癌作用，RalGDS在其中的作用值得研究。另外，在對鼠RalGDS的研究中，還發(fā)現(xiàn)RalGDS可能有除Ral以外的底物，這說明RalGDS家族還可能在其它的信號傳遞途徑中發(fā)揮作用。
1993年，Albright，C.F.等首先在小鼠的3T3/ΔXB細胞系和大鼠的成纖維細胞系cDNA文庫中，通過尋找編碼與CDC25和ste6蛋白保守區(qū)同源的基因的辦法發(fā)現(xiàn)了RalGDSa和RalGDSb基因的全長(Albright，C.F.et al.(1993)EMBO J.12(1)，339-347)。次年，Kikuchi，A.等在尋找Ras結合蛋白時，運用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了小鼠基因RGL(RalGDS-like)的Ras結合區(qū)域RID，以此為探針篩庫而得到該基因全長。RGL與RalGDS具有70％氨基酸同源性，在CDC25同源區(qū)兩者的同源性更高，故在而認為RGL和RalGDS構成一個家族(Kikuchi，A.et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14，7483-7491.)。RLF(RalGDS-like factor)則是最初作為一個新的CDC25家族成員，在1996年由Wolthuis，R.M.等發(fā)現(xiàn)的小鼠基因，它是在尋找Rap 1A的結合蛋白時在酵母雙雜交系統(tǒng)中得到的(Wolthuis，R.M.et al.(1996)Oncogene 13，353-362)。該基因編碼了一個778個氨基酸的蛋白，這一蛋白與RalGDS和RGL都約有30％的氨基酸是相同的，尤其在RLF的羧基端保守性更強，也被認為是RalGDS家族的一個新的成員。Peterson，S.N.等于1996年用酵母雙雜交系統(tǒng)尋找Rap1b的結合蛋白時，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)了一個人cDNA的部分克隆。通過同源比較發(fā)現(xiàn)，這一部分cDNA與RalGDS和RGL具有重要的同源性，它包括了完整的羧基端和部分的RBD，他們把它命名為RGL2(peterson，S.N.et al.(1996)J.Biol.Chem.271(47)，29903-29908)。
1997年，在兔中又得到了一個可能是RalGDS家族成員的基因的部分序列(D’Adamo，D.R.et al.(1997)Oncogene 14，1295-1305)。D’Adamo，D.R.等在經(jīng)DNBA誘導的兔鱗狀上皮細胞中，運用裸鼠致瘤實驗(nude mouse tumorigenesis assay)分離到一全長cDNA——rsc(rabbit aquamous cell carcinoma)。分析發(fā)現(xiàn)這一基因是一個癌基因，它由兩個不同的基因斷裂拼接而成閱讀框中前785bp編碼的氨基酸序列與人的HHR23A基因有大于95％的相同性；隨后的1.4kb則與小鼠的RalGDS有60％相同，而在氨基酸水平上則為40％。后者意味著這可能是RalGDS家族的一個新的基因，它被命名為rgr(RalGDS related)。rgr也具有CDC25同源的催化功能區(qū)，在這一區(qū)域它與RalGDS的氨基酸相同率高達72％。Rgr蛋白同樣具有對Ral的GDS活性，而對Ras或Ran則沒有。缺失分析表明具有致癌潛力的部分僅存于rsc的rgr部分。
人類的RalGDS也已被部分克隆(Spaargaren，M.and Bischoff，L.R.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12609-12613；Hofer，F(xiàn).et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11089-11093)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼RalGDS家族的一個新成員，本發(fā)明的RalGDS新成員命名為hRalGDS(GenBank Accession No.AF027169)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的RalGDS蛋白家族成員，命名為hRalGDS。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產(chǎn)所述的新的RalGDS家族成員的方法。
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)所述多肽的方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽是RalGDS家族的一個新成員。本發(fā)明的RalGDS同系物命名為hRalGDS(GenBank Accession No.AF027169)。編碼本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，術語“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存的其他物質中分開，則為分離的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為3585個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO1，其中開放讀框位于160-2718位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人胎盤λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物5’-CAGCTTCGTCCCGGAGTCTCCTG-3’和反向引物5’-GATGCCCTTGGCAATCTTGAGTC-3’，進行PCR，獲得568bp的目的片段。然后標記該片段，以該標記片段為探針與擴增后的人胎盤λgt11cDNA文庫雜交，挑取陽性克隆，經(jīng)同樣的探針及篩選過程對得到的陽性克隆進行復篩后，最終得到若干陽性單克隆。鑒定測序后得到部分序列。以此序列為參考，又設計了反向引物5’-TGGAGGCTGAGCTGATGCCGGAG-3’和5’-TCGCATGAAGCTGTTTGGACTCAAG-3’，將它們分別與載體引物S1、S2進行搭配擴增，并將擴增產(chǎn)物測序。將所測得的序列拼接后得到如SEQ ID NO1的全長cDNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的hRalGDS蛋白或多肽。一般來說有以下步驟用本發(fā)明的編碼hRalGDS的DNA片段(或變異體)或含有該DNA片段的重組表達載體轉化合適的宿主細胞；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸序列的表達載體及用所述的表達載體遺傳工程化的宿主細胞。表達載體的一個重要特征是含有適當?shù)膯幼雍头g控制元件。多種表達載體可從商業(yè)途徑得到。常用的載體包括(但不限于)質粒，噬菌體，粘粒，酵母表達載體，病毒，Ti質粒等，但最常用的載體首選質粒。常用的宿主細胞包括(但不限于)細菌，酵母，昆蟲細胞，動物細胞或植物細胞等，但最常用的宿主細胞為細菌，尤其是大腸桿菌。另一個較常用的表達系統(tǒng)是哺乳動物細胞系，如Hela，COS細胞系或CHO細胞系等。
可用本領域中熟練人員已知的方法構建含hRalGDS編碼序列的重組表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術，DNA合成技術，體內重組技術等(J Sambrook等1989，分子克隆實驗手冊)。
本發(fā)明還涉及針對本發(fā)明的多肽的抗體，有多種方法可用于生產(chǎn)針對hRalGDS抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用hRalGDS蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
hRalGDS單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(chǎn)(Morrison等，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗hRalGDS的單鏈抗體。
以下將通過實施例對本發(fā)明進行進一步的描述，但實施例僅是舉例性的，并非對本發(fā)明的限制。實施例1 hRalGDS的cDNA的克隆和測序1.引物擴增以人胎盤λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸5’-CAGCTTCGTCCCGGAGTCTCCTG-3’為正向引物，寡核苷酸5’-GATGCCCTTGGCAATCTTGAGTC-3’為反向引物，進行PCR，PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的568bp目的片段。2.探針及其標記以上述PCR目的片段為探針，用α-32P-dATP(DuPont公司)對其進行隨機引物標記，條件為37℃1小時，具體操作見MegaprimeDNA標記系統(tǒng)說明書(Amersham)。3.cDNA文庫擴增及印跡標記(篩選文庫)將人胎盤λgh11cDNA文庫進行擴增，克隆數(shù)達100萬個，然后將擴增好的cDNA文庫印跡到Hybond TM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標記好的探針變性后與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAI X光膠片于-80℃下進行放射自顯影，72小時后沖片。4.挑取克隆及初篩克隆的復篩通過上述雜交篩選獲得13個初篩陽性克隆，用上述相同的探針雜交和篩選過程對這13個陽性克隆進行復篩，最終得到6個陽性單克隆。5.單克隆的鑒定和測序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用探針序列設計新的反向引物5’-TGGAGGCTGAGCTGATGCCGGAG-3’和5’-TCGCATGAAGCTGTTTGGACTCAAG-3’，分別與λgt11左右臂上的引物S1及S2(S15’-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3’；S25’-CACCAGACCAACTGGTAATG-3’)進行搭配擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷每個克隆從探針出發(fā)向5’或3’步移(延伸)的長度，從中選出向兩端延伸最長的克隆，電泳鑒定它們分別向5’和3’延伸的長度，前者的插入片段約為2.3kb，后者的插入片段約為1.0kb。將這兩個克隆S1、S2擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM109，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共3585bp，詳細序列見SEQ ID NO1，其中開放讀框位于160-2718位核苷酸。
根據(jù)得到的cDNA序列推導出hRalGDS的氨基酸序列，共852個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO2。實施例2 hRalGDS的表達譜分析和染色體定位多種組織Northern(MTNTM)印跡膜(16種組織)購自Clontech公司，以上實施例1步驟中的568bp克隆片段為探針，探針的標記方法同實施例1步驟2，Northern雜交按用戶手冊操作。
16種組織的Northern雜交結果顯示(h)RalGDS基因為廣譜表達基因，在胸腺、前列腺、胎盤、卵巢、小腸、大腸、外周血白細胞、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎及等12種組織中均有表達，表達量稍有差異，在脾、腦、心臟和胰腺中較高表達。根據(jù)國際blastn nr數(shù)據(jù)庫檢索，將該基因定位于9號染色體9q34。
實施例3人RalGDS在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以人胎盤λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，將編碼人RalGDS的cDNA序列用對應于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人RalGDS cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GTTGGTCGAC ATGGTAGATT GCCAGAGCT-3’，該引物含有SalI限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人RalGDS編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為5’-gcttAAGCTT TCAGAAGATG CCCTTGGC-3’，該引物含有HindIII限制性限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人RalGDS的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人RalGDS的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人RalGDS。用6M鹽酸胍(PH5.0)從柱中洗脫人RalGDS。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(PH0.5)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約94kDa。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與推測的蛋白序列一致。
實施例4人RalGDS在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，以人胎盤λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，將編碼人RalGDS的cDNA序列用對應于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人RalGDS cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GTTGAAGCTT ATGGTAGATT GCCAGAGCT-3’該引物含有HindIII限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人RalGDS編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為5’-GCTTGAATTC TCAGAAGATG CCCTTGGC-3’該引物含有EcoRI限制性限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人RalGDS的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(fl ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用EcoRI和HindIII消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，測序驗證人RalGDS的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為94KDa。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與推測的蛋白序列一致。
根據(jù)上文教導，本發(fā)明可有各種改進和變動，因此，在所附權利要求范圍內，本發(fā)明可以與具體所述不同的方式實施。
序列表(1) 一般信息(i)申請人復旦大學(ii) 發(fā)明名稱Ral GTP酶的鳥嘌呤解離刺激因子(iii) 序列數(shù)2(iv) 聯(lián)系地址(A) 收信人永新專利商標代理有限公司(B) 街道金融大街27號(C) 城市北京市(D) 國家中國(E) 郵政編碼100032(vi) 本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii) 律師/代理人信息(A) 姓名林曉紅(B) 注冊號72002027(C) 卷號I98602CB(ix) 電訊信息(A) 電話8610-66211834(B) 傳真8610-66211845(2) SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A) 長度3585bp(B) 類型核酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓撲結構線性(iii) 分子型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO11 CGAGGGCCGC AGAGTCCTGG GCCCGGCGGG GACCGGAGGC CGCGCCATGA GCCCCGCAGC61 CGGGCGCACC CCTGCGCCGC GCGCGGGCCC AGGCGAGCGG CCTCTGCGAG CCCCGGGTCC121 CGCCCTGGGG CCGGCGATGT GCCACCGAGG CTGAGGATGA TGGTAGATTG CCAGAGCTCC181 ACGCAGGAGA TCGGTGAGGA GCTGATCAAC GGAGTCATCT ACTCCATCTC CCTGCGCAAG241 GTGCAGCTGC ACCACGGAGG CAACAAGGGG CAGCGCTGGC TCGGGTATGA GAATGAGTCG301 GCCCTGAACC TTTATGAGAC TTGCAAGGTG CGGACCGTGA AGGCTGGCAC GCTGGAGAAG361 CTGGTGGAGC ACCTGGTGCC AGCCTTCCAG GGCAGCGACC TCTCCTACGT CACCATCTTC421 CTGTGTACCT ATAGAGCCTT CACCACCACC CAACAGGTCC TGGACCTGCT GTTCAAAAGG481 TACGGTAGAT GTGACGCCCT CACGGCCTCC TCTAGATACG GCTGCATCCT CCCCTATTCC541 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CAAGAACTTC TCGTCACTGT ATGCCATCCT CTCTGCCCTG1441 CAGAGCAACT CCATCCACCG TCTGAAGAAG ACGTGGGAAG ACGTTTCCAG GGACAGTTTC1501 CGGATCTTTC AGAAGCTGTC AGAGATCTTC TCAGATGAGA ACAACTACTC ATTGAGCCGG1561 GAGCTGCTCA TCAAGGAGGG CACCTCCAAG TTTGCCACCC TGGAGATGAA CCCCAAGAGA1621 GCCCAGAAAC GGCCGAAGGA GACGGGCATC ATCCAGGGCA CCGTTCCCTA CCTGGGCACG1681 TTCCTCACCG ACCTGGTGAT GCTGGACACT GCCATGAAGG ACTATCTGTA TGGCAGACTC1741 ATCAACTTTG AGAAGAGGAG GAAGGAGTTC GAGGTGATCG CCCAGATCAA GCTGCTGCAG1801 TCGGCCTGCA ACAACTACAG CATCGCGCCA GATGAGCAAT TTGGGGCCTG GTTCCGGGCC1861 GTGGAGCGGC TCAGCGAGAC TGAGAGCTAC AACCTGTCGT GCGAGCTGGA GCCCCCATCC1921 GAGTCAGCCA GCAACACCCT CAGGACCAAG AAGAACACAG CCATTGTCAA GCGCTGGAGC1981 GACCGCCAGG CCCCCAGCAC TGAGCTCAGT ACCAGTGGCA GCTCCCACTC CAAGTCCTGT2041 GACCAGCTCA GGTGTGGCCC CTACCTCAGC AGCGGGGACA TCGCTGACGC GCTCAGCGTG2101 CACTCGGCCG GCTCCTCTAG CTCCGACGTG GAGGAGATCA ACATCAGCTT CGTCCCGGAG2161 TCTCCTGATG GCCAGGAAAA GAAGTTCTGG GAATCAGCCT CACAGTCATC CCCGGAGACC2221 TCCGGCATCA GCTCAGCCTC CAGCAGCACC TCGTCCTCCT CAGCCTCCAC CACGCCCGTG2281 GCTGCCACAC GCACCCACAA GCGCTCTGTC TCAGGGCTCT GCAACTCCAG CTCCGCGCTG2341 CCGCTCTACA ACCAGCAGGT GGGCGACTGC TGTATCATCC GCGTCAGCCT GGACGTGGAC2401 AATGGCAACA TGTACAAGAG CATCCTGGTG ACCAGCCAAG ATAAGGCTCC GGCTGTAATC2461 CGCAAGGCCA TGGACAAACA CAACCTGGAG GAGGAGGAGC CGGAGGACTA TGAGCTGCTG2521 CAGATTCTCT CAGATGACCG GAAGCTGAAG ATCCCTGAAA ACGCCAACGT CTTCTATGCC2581 ATGAACTCTA CTGCCAACTA TGACTTTGTC CTGAAGAAGC GGACCTTCAC CAAGGGAGTG2641 AAGGTCAAGC ACGGAGCCAG CTCCACCCTC CCTCGCATGA AGCAGAAAGG ACTCAAGATT2701 GCCAAGGGCA TCTTCTGAGG GCATCCTCCC AGGGTCTGGC TGGCTGGTAG CCAAGCACTT2761 ATGGACCAGA GTGGCCCAGG CCAGCTGGGC GCCTTCCTCC CACCTGCCAG CCCAGGGTAC2821 CCCAGACTCC AGTTTCATCC TGAACCTCTC CCGCTGCTGG GATTGACGCC TGCCATTGGT2881 CAGGCTGACC TGGCCTCCCG TGGACCACTC GCTGCCTTAG GTGCCTTCTG CTCTCTGGAA2941 CCAGAGGACT AGCTGACTTT TGCCAAGGAG CAGTGCCAAC GGGCATGGCA TGGTGCCCTG3001 CCTGCCCCCG GGCGCCACCT CTGTACACTT CCCTGACACC TTCCCAGGTG TGGGTCACTG3061 CCACCTGTGC CCATGGGCAC CCCAGAGCAC CCACTGTGAC CACTGCAGTT CTCTCATGCC3121 CACAGGCACT GGCCTGTGAC CTTCGCAGGG GTCCCGGCCC CTCCCACCAC TCTAGCCTTT3181 CTCAGGCTGC ACCAAAGATT CCATCATCAG GGCCAACTGA GAGTGAGGGA GTCTCACCCA3241 CCGCTTACCC CAGCCCTCCC CTGGGAGCAG AGAGAGAAAC CCTCTTCATG GACCAGACTC3301 TGCACCCGGT GAGTGAGGAC AGTCCCAGCT GAGTCCCATC GATGTTGAAT CTCATGCCAC3361 TGCAAGTGCC ATTCACCACT GCGTCCTGGG CTTTACGAGA CCATGCAAGA CGGGGGTTAG3421 TGAGGAAGGA GGATTTGGGG TGGGGGTGGG GTGATTGAAT ATTTGTATAA AAAGCAAAAA3481 GAAAAAAAAA ATGTTTGTTT ACTGATTGGG GAGGGGCAAT ATTTATTTGT TGTAAATAGC3541 AAATGCTAGA CTTGAATATT ATATTAAAAT CCTGTTTCTA CTATA(3) SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A) 長度852個氨基酸(B) 類型氨基酸(C) 拓撲結構線性(iii) 分子型多肽(xi) 序列描述SEQ ID NO21 MVDCQSSTQEIGEELINGVIYSISLRKVQLHHGGNKGQRWLGYENESALNLYETCKVRTV61 KAGTLEKLVEHLVPAFQGSDLSYVTIFLCTYRAFTTTQQVLDLLFKRYGRCDALTASSRY121 GCILPYSDEDGGPQDQLKNAISSILGTWLDQYSEDFCQPPDFPCLKQLVAYVQLNMPGSD181 LERRAHLLLAQLEHSEPIEAEPEALKPTPELELALTPAPAPSPVPAPAPEPEPAPTPAPG241 SELEVAPAPAPELQQAPEPAVGLESAPAPALELEPAPEQDPAPSQTLELEPAPAPVPSLQ301 PSWPSPVVAENGLSEEKPHLLVFPPDLVAEQFTLMDAELFKKVVPYHCLGSIWSQRDKKG361 KEHLAPTIRATVTQFNSVANCVITTCLGNRSTKAPDRARVVEHWIEVARECRILKNFSSL421 YAILSALQSNSIHRLKKTWEDVSRDSFRIFQKLSEIFSDENNYSLSRELLIKEGTSKFAT481 LEMNPKRAQKRPKETGIIQGTVPYLGTFLTDLVMLDTAMKDYLYGRLINFEKRRKEFEVI541 AQIKLLQSACNNYSIAPDEQFGAWFRAVERLSETESYNLSCELEPPSESASNTLRTKKNT601 AIVKRWSDRQAPSTELSTSGSSHSKSCDQLRCGPYLSSGDIADALSVHSAGSSSSDVEEI661 NISFVPESPDGQEKKFWESASQSSPETSGISSASSSTSSSSASTTPVAATRTHKRSVSGL721 CNSSSALPLYNQQVGDCCIIRVSLDVDNGNMYKSILVTSQDKAPAVIRKAMDKHNLEEEE781 PEDYELLQILSDDRKLKIPENANVFYAMNSTANYDFVLKKRTFTKGVKVKHGASSTLPRM841 KQKGLKIAKGIF
權利要求
1.一種分離出的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽或者所述多肽的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長多肽相同的生物學功能。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.如權利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
5.如權利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽。
6.如權利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示的編碼序列。
7.含有權利要求2所述的多核苷酸的載體。
8.一種宿主細胞，其用權利要求7的載體轉化、轉染或轉導。
9.如權利要求8所述的宿主細胞，該宿主細胞為原核細胞。
10.如權利要求9所述的宿主細胞，該宿主細胞為大腸桿菌。
11.如權利要求8所述的宿主細胞，該宿主細胞為真核細胞。
12.如權利要求11所述的宿主細胞，該宿主細胞為COS-7、CHO、Hela細胞。
13.如權利要求11所述的宿主細胞，該宿主細胞為酵母細胞。
14.生產(chǎn)多肽的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)權利要求8-13的宿主細胞，使之表達所述的多肽。
15.一種多肽，所述的多肽是具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽或所述多肽的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長多肽相同的生物學功能。
16.如權利要求15所述的多肽，所述的多肽具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列。
17.抗權利要求15或16所述多肽的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的多核苷酸,由該多核苷酸編碼的多肽,以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)多肽的方法。更具體的說,本發(fā)明的多肽是Ral GTP酶的鳥嘌呤解離刺激因子(RalGDS)家族的一個成員。
文檔編號C07K14/435GK1257923SQ98125688
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月21日 優(yōu)先權日1998年12月21日
發(fā)明者余龍, 鄭其平, 張宏來, 趙勇, 傅強 申請人:復旦大學