專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
重組人粒細(xì)胞刺激因子(granulocytecolony-stimulating factor, G-CSF)是指特異作用于造血系統(tǒng)中粒祖細(xì)胞，促機(jī)其增殖，向成熟中性粒細(xì)胞分化，并維持細(xì)胞的存活及其生物功能的一種造血生長(zhǎng)因子，是刺激骨髓細(xì)胞集落形成的集落刺激因子的一種。對(duì)骨髓移植時(shí)的中性白細(xì)胞增加、癌癥化療時(shí)引起的嚴(yán)重中性粒細(xì)胞缺乏癥、以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細(xì)胞缺乏癥均有明顯療效。采用基因工程技術(shù)重組G-CSF的生活學(xué)活性與天然的相似，可以大規(guī)模生產(chǎn)，以滿(mǎn)足臨床需要。目前，比較常用的方法是利用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，多以不溶性包涵體的形式存在，由于包涵體不具有生活學(xué)活性，因此還需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性處理，恢復(fù)其生物學(xué)活性，再經(jīng)過(guò)純化處理，得到原液。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CNY718739A公開(kāi)了一種“重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法”，該方法包括:a.選用工程菌DH5 a - PBV220 一 hGCSF菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b.對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c.對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，得到變性所得物；d.對(duì)變性所得物進(jìn)行第一次復(fù)性處理，得到第一次復(fù)性所得物；e.對(duì)第一次復(fù)性所得物進(jìn)行超濾處理，得到超濾所得物對(duì)超濾所得物進(jìn)行進(jìn)行第二次復(fù)性處理，得到第二次復(fù)性所得物；g.對(duì)第二次復(fù)性所得物進(jìn)行層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其純度達(dá)到98%以上、比活性不低于4.0X 108IU/mg。本制備方法為解決人粒細(xì)胞集落刺激因子制備上存在的表達(dá)率偏低、菌體產(chǎn)量偏低、包涵體復(fù)性率偏低、活性偏低以及成本偏高等問(wèn)題提供了可能。然而，上述方法中 ，以工程菌DH5a — PBV220 — hGCSF菌株作為種子，即使在培養(yǎng)時(shí)采用了抗生素氨芐青霉素以提高表達(dá)量，其所得rG-CSF蛋白占菌體總蛋白比例在40%左右，而且由于抗生素對(duì)環(huán)境的不友好，采用了抗生素技術(shù)的生產(chǎn)廢液的處理成為新的問(wèn)題。并且，其生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)周期比較長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低，發(fā)酵罐規(guī)模只有20L不適合大規(guī)模生產(chǎn)。具體表現(xiàn)為:基本發(fā)酵時(shí)間為培養(yǎng)8小時(shí),米用超聲破菌時(shí)間長(zhǎng),分離洗漆5次,兩次復(fù)性要超過(guò)116小時(shí)。由于洗滌和復(fù)性溶液成份復(fù)雜，給后續(xù)層析純化增加了難度，使得第二次復(fù)性需要在2_8°C條件下復(fù)性96小時(shí)以上，且復(fù)性完后需經(jīng)離心處理才能上柱。同時(shí)，采用超聲破菌，控制超聲功率和時(shí)間難度大，超聲不足不能完全釋放重組蛋白，而超聲時(shí)間太長(zhǎng)或功率太大，會(huì)使蛋白炭化。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種適合工藝化，能夠提高生產(chǎn)量、縮短生產(chǎn)周期，是高密度快速生產(chǎn)重組人粒細(xì)胞刺激因子的方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，依次包括(I)對(duì)大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得包涵體，(2)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的提取和洗滌，得到精制包涵體；(3)對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，得到變性所得物；(4)對(duì)變性所得物進(jìn)行復(fù)性處理；(5)對(duì)復(fù)性所得物進(jìn)行不需離心分離直接進(jìn)行層析純化處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于:所述大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株為PKG931/HB101 ;所述工程菌株的培養(yǎng)包括擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，其中擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下子步驟:①.菌種復(fù)蘇:將工程菌種接種到液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng) 12-14 小時(shí)；②.一級(jí)種子液培養(yǎng):將復(fù)蘇后的種子液接種到含液體LB培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng)9_11小時(shí)；③.二級(jí)種子液培養(yǎng):將一級(jí)種子液按增加1%的體積比方式接種到含30L液體LB的貝朗50L發(fā)酵罐中，罐培養(yǎng)控制條件為:轉(zhuǎn)速100-300rpm/min，通氣30L/min，罐壓
0.1-0.2bar，溫度30°C，溶氧不低于50%，培養(yǎng)3-5小時(shí)，至OD6tltl值至為1.0-2.0時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，取樣鏡檢觀(guān)察無(wú)雜菌，菌種形態(tài)正常，即為發(fā)酵罐培養(yǎng)用種子；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)包括如下子步驟:①.發(fā)酵前的準(zhǔn)備:采用貝朗公司500L發(fā)酵罐，將發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮液接入發(fā)酵罐并定容至500L，設(shè)定滅菌溫度115°C，30min，發(fā)酵罐自動(dòng)在線(xiàn)滅菌；

②.發(fā)酵罐培養(yǎng):滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到30°C時(shí)，將種子罐中二級(jí)種子液通過(guò)管道接種到500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)控制條件為:培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量及罐壓等將溶氧控制在30%(w%)以上，各參數(shù)調(diào)節(jié)范圍為:轉(zhuǎn)速200— 450r/min、通氣量100_400L/min、罐壓0.1-0.3bar,培養(yǎng)4小時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)；③.誘導(dǎo)發(fā)酵:誘導(dǎo)溫度為37_42°C，誘導(dǎo)4小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)離心收集發(fā)酵產(chǎn)物，收集到的發(fā)酵濕菌體可以在_20°C的冰箱中保存。通過(guò)上述方法控制培養(yǎng)條件，通過(guò)對(duì)pKG931/HB101菌株發(fā)酵培養(yǎng)，G-CSF平均濕菌體收率可達(dá)100-120g/L，其rG-CSF蛋白占菌體總蛋白的50%以上，而且發(fā)酵周期短，采用500L發(fā)酵罐，生產(chǎn)量大，是一種高密度快速生產(chǎn)方法。上述發(fā)酵罐培養(yǎng)子步驟②和③中，通過(guò)補(bǔ)加氨水控制PH為6.0-7.0，誘導(dǎo)后即開(kāi)始補(bǔ)料，補(bǔ)料速度為每小時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基5L。所述液體LB培養(yǎng)基的組分及配比為:10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化鈉。所述發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮液的組分及配比為:3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500gKH2PO4.2H20+2000g Na2HP04+500g NH4Cl+250g NaCl+5000g 葡萄糖 +62.5g MgCl2+6.25gCaCl2。所述發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基的組分及配比為:100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。上述各種培養(yǎng)基，均未米用抗生素，是一種環(huán)境友好培養(yǎng)基。所述步驟(2)中對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的提取和洗滌，為克服超聲破菌的不足，本發(fā)明采用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破菌，其子步驟為:①包涵體提取:用25mmol/L Tris-HCl-EDTA溶液將菌體懸浮利用高壓均質(zhì)機(jī)加壓至500-600bar進(jìn)行菌體破碎，然后用管式離心機(jī)連續(xù)流離心的方法收集G-CSF包涵體；
②包涵體洗滌:先用25mmol/L Tris_HCl+2M鹽酸胍溶液+0.5%(w%)曲拉通X-100將沉淀離心洗滌2次，再用純化水將沉淀離心洗滌2次，洗滌過(guò)程使用J-26XP離心機(jī)離心收集沉淀，得精制G-CSF包涵體。本發(fā)明在包涵體提取時(shí)利用高壓均質(zhì)方法取代了傳統(tǒng)的超聲破碎方法，高壓均質(zhì)機(jī)的工作原理是將未均質(zhì)的樣品先以高壓低流速的狀態(tài)進(jìn)入均質(zhì)閥區(qū)，接著樣品經(jīng)過(guò)均質(zhì)閥與閥座之間的狹縫，這時(shí)候樣品的壓力也急速的降低，而樣品的流速迅速的增加，此時(shí)產(chǎn)生劇烈的能量，而此能量是由擾流現(xiàn)象及不同的壓力差所引起，此能量便會(huì)將固體顆粒撕碎。之后，均質(zhì)過(guò)的樣品會(huì)再撞擊沖擊環(huán)，減弱能量之后進(jìn)入樣品收集槽，高壓均質(zhì)方法不僅具有速度快、處理量大的特點(diǎn)，而且可以通過(guò)多次循環(huán)破碎將菌體碎片乳化成極微小的顆粒，再通過(guò)離心的方法很容易將其去除，可收集到純度較高的包涵體，再用高濃度的尿素溶液將包涵體溶解，其純度可達(dá)到90%以上,從而減小了后續(xù)純化的難度。本發(fā)明包涵體洗滌過(guò)程的難點(diǎn)在于包涵體中除目的蛋白外，還有少量脂類(lèi)、核酸、多糖和其它雜蛋白等，這些成分會(huì)影響目的蛋白的純化和復(fù)性，因此在包涵體蛋白去折疊前應(yīng)先洗滌包涵體。如果洗滌不充分，則有可能在包涵體的溶解和復(fù)性過(guò)程中降解重組蛋白質(zhì)，而且洗滌得到較純的包涵體則可簡(jiǎn)化后續(xù)色譜純化的步驟。采用本發(fā)明的重組人粒細(xì)胞刺激因子的包涵體溶解后蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描，純度達(dá)到90%以上。所述步驟(3)變性處理采用如下方法:用20mmol/L Tris-HCl — IOmmoI/L DTT —8mol/L尿素將G-CSF包涵體進(jìn)行溶解,然后離心收集上清液,收集的上清即為G-CSF包涵體蛋白溶液，純度達(dá)到90%以上。所述步驟(4)復(fù)性處理采用如下方法:將G-CSF包涵體蛋白溶液用20mmol/LTris-HCl - 10mmol/L半胱氨酸-尿素進(jìn)行稀釋復(fù)性，包涵體蛋白溶液與復(fù)性用溶液體積比1:11，加入氯化銅溶液作為催化劑，室溫下攪拌4-5小時(shí)，通過(guò)HPLC分析判斷復(fù)性是否完全。目前蛋白的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析、超濾、柱上復(fù)性等等，稀釋復(fù)性法同其他方法相比而言具有設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作方便、成本低、容易放大的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在分子間存在大量錯(cuò)誤的折疊和聚合，以至蛋白沉淀，使復(fù)性收率大大降低，平均只有20%左右。本發(fā)明通過(guò)改變復(fù)性液中的離子強(qiáng)度、還原劑濃度、增加添加劑等，在室溫環(huán)境下復(fù)性4-5個(gè)小時(shí)即可使重組人粒細(xì)胞刺激因子包涵體蛋白完全復(fù)性，不但時(shí)間短，而且目的蛋白質(zhì)量收率高于90%，并且通過(guò)C18分析型色譜柱進(jìn)行HPLC純度分析對(duì)復(fù)性過(guò)程進(jìn)行判斷，可清楚的觀(guān)察到復(fù)性液中蛋白純度達(dá)到95%以上。另外，復(fù)性液保持澄清，沒(méi)有沉淀現(xiàn)象發(fā)生，不需要離心即可以進(jìn)行下一步的CM離子交換層析，經(jīng)過(guò)一步層析純化后，RP-HPLC的純度即可達(dá)99%以上，具有純化周期短，成本低，步驟簡(jiǎn)單的顯著特點(diǎn)，原液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描，純度達(dá)到99%以上，HPLC顯示單峰，rhG-CSF比活性不低于3.0 X 108IU/mg。高于《中和人民共和國(guó)藥典2010版》第三部的要求。所述步驟(5)層析純化包括如下兩步:①利用CM Sepharose FF離子交換柱層析對(duì)G-CSF復(fù)性液進(jìn)行目的蛋白高度提純，流動(dòng)相A:為0.1% (w%)醋酸溶液-0.01% (w%)Tween-80，流動(dòng)相B:為50%醋酸-0.01%(w%) Tween-80， 先用流動(dòng)相A平衡層析柱，上完樣后用流動(dòng)相B分階段洗脫，在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集最高色譜峰；
②將最終的離子交換層析收集液過(guò)S印hdax G-25凝膠柱，流動(dòng)相為lOmmol/L醋酸-醋酸鈉-0.004% (w%)Tween-80,在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集第一色譜峰。用0.2微米的濾膜將G-25凝膠層析收集液過(guò)濾除菌，其質(zhì)量指標(biāo)要達(dá)到原液標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:(I)采用重組質(zhì)粒體pKG931作為表達(dá)載體，以大腸桿菌HBlOl作為受體菌，和合理的培養(yǎng)條件，在不用抗生素時(shí)，能夠獲得50%以上高表達(dá)量，并可縮短周期，降低生產(chǎn)成本，發(fā)酵規(guī)模達(dá)到了 500L，可進(jìn)行大批量生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。(2)培養(yǎng)基不添加抗生素，對(duì)環(huán)境友好。(3)采用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行菌體破碎提取包涵體，破菌率高，易于控制，不存在蛋白炭化的風(fēng)險(xiǎn)。(4)通過(guò)改變復(fù)性液中的離子強(qiáng)度、還原劑濃度、增加添加劑等，在室溫環(huán)境下復(fù)性4-5個(gè)小時(shí)即可使重組人粒細(xì)胞刺激因子包涵體蛋白完全復(fù)性，目的蛋白質(zhì)量收率高于90%,并且通過(guò)C18分析型色譜柱進(jìn)行HPLC純度分析對(duì)復(fù)性過(guò)程進(jìn)行判斷，可清楚的觀(guān)察到復(fù)性液中蛋白純度達(dá)到95%以上。(5)復(fù)性液保持澄清，沒(méi)有沉淀現(xiàn)象發(fā)生，不需要離心即可以進(jìn)行下一步的CM離子交換層析，經(jīng)過(guò)一步層析純化后，RP-HPLC的純度即可達(dá)99%以上，具有純化周期短，成本低，步驟簡(jiǎn)單的顯著特點(diǎn)，原液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描，純度達(dá)到99%以上，HPLC顯示單峰，rhG-CSF比活性不低于3.0X108IU/mg。高于《中和人民共和國(guó)藥典2010版》第三部的要求。
具體實(shí)施例

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，包括步驟:a.選用工程菌PKG931/HB101進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b.對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的提取和洗滌，得到精制包涵體；c.對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，得到變性所得物；d.對(duì)變性所得物進(jìn)行復(fù)性處理；e.對(duì)復(fù)性所得物進(jìn)行層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。具體方法為:a.選用北京康賽醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司提供的工程菌PKG931/HB101進(jìn)行發(fā)酵培
養(yǎng)其中，步驟a又包括種子擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，所述種子擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下子步驟:①.菌種復(fù)蘇:從菌種保存庫(kù)中取出一支rG-CSF表達(dá)的pKG931/HB101工作種子進(jìn)行菌種復(fù)蘇，將種子液按2%的體積比接種到含5ml液體LB培養(yǎng)基的IOml試管中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng)12-14小時(shí)；所述液體LB的配方為:10g/L酵母粉+IOg/L蛋白胨+5g/L氯化鈉；②.一級(jí)種子液培養(yǎng):將復(fù)蘇后的種子液按2%的體積比接種到含IOOml液體LB培養(yǎng)基的500ml搖瓶中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng)9_11小時(shí)；③.二級(jí)種子液培養(yǎng):將一級(jí)種子液按3%的體積比接種到含30L液體LB的貝朗50L發(fā)酵罐中，罐培養(yǎng)控制條件為:轉(zhuǎn)速100-300rpm/min，通氣30L/min，罐壓0.1-0.2bar,溫度30°C，溶氧不低于50% (通過(guò)控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、通氣、罐壓保持溶氧不低于30%)，培養(yǎng)
3-5小時(shí)，至0D600值至為1.0-2.0時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，取樣鏡檢觀(guān)察無(wú)雜菌，菌種形態(tài)正常，即為發(fā)酵罐培養(yǎng)用種子。所述發(fā)酵罐培養(yǎng)包括以下子步驟:①.發(fā)酵前的準(zhǔn)備:采用貝朗公司500L發(fā)酵罐，將PH電極、溶氧電極校正和安裝好；將發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮液接入發(fā)酵罐并定容至500L，設(shè)定滅菌溫度115°C，30min，發(fā)酵罐自動(dòng)在線(xiàn)滅菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g KH2P042H20+2000gNa2HP04+500g NH4Cl+250g NaCl+5000g 葡萄糖+62.5g MgC12+6.25g CaC12，加純化水定容至500L ；②.發(fā)酵罐培養(yǎng):滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到30°C時(shí)，將種子罐中二級(jí)種子液通過(guò)管道接種到500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)控制條件為:培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量及罐壓等將溶氧控制在30%以上，各參數(shù)調(diào)節(jié)范圍為:轉(zhuǎn)速200—450r/min、通氣量100-400L/min、罐壓0.1-0.3bar，培養(yǎng)4小時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)。③.誘導(dǎo)發(fā)酵:誘導(dǎo)溫度為37_42°C，誘導(dǎo)4小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)離心收集發(fā)酵產(chǎn)物，平均濕菌體收率可達(dá)100-120g/L，其rG-CSF蛋白占菌體總蛋白的52%，收集到的發(fā)酵濕菌體可以在_20°C的冰箱中保存。上述發(fā)酵罐培養(yǎng)子步驟②和③中，通過(guò)補(bǔ)加氨水控制PH為6.0-7.0，誘導(dǎo)后即開(kāi)始補(bǔ)料，補(bǔ)料速度為每小時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基5L。發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方為:100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。b.對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體包涵體提取和包涵體洗滌子步驟:①包涵體提取:用25mmol/L Tris-HCl-EDTA溶液(重組人粒細(xì)胞刺激因子發(fā)酵菌裂解液)將菌體懸浮利用高壓均質(zhì)機(jī)加壓至500-600bar進(jìn)行勻漿破碎，然后用管式離心機(jī)連續(xù)流離心的方法收集G-CSF包涵體；②包涵體洗滌:先用25mmol/L Tris_HCl+2M鹽酸胍溶液+0.5%曲拉通X-100 (重組人粒細(xì)胞刺激因子包涵體洗滌液)將沉淀離心洗滌2次，再用純化水將沉淀離心洗滌2次，洗滌過(guò)程使用J-26XP離心機(jī)離心收集沉淀，得精制G-CSF包涵體。c.對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，得到變性所得物用20mmol/L Tris-HCl — IOmmoI/L DTT — 8mol/L尿素將G-CSF包涵體進(jìn)行溶解，然后離心收集上清液，收集的上清即為G-CSF包涵體蛋白溶液，純度應(yīng)達(dá)到90%以上。d.對(duì)變性所得物進(jìn)行復(fù)性處理將G-CSF包涵體蛋白溶液用20mmol/L Tris-HCl 一 IOmmoI/L半胱氨酸-尿素進(jìn)行稀釋復(fù)性，包涵體蛋白溶液與復(fù)性用溶液體積比1:11，加入氯化銅溶液作為催化劑，室溫下攪拌4-5小時(shí)，通過(guò)HPLC分析判斷復(fù)性是否完全。e.對(duì)復(fù)性所得物進(jìn)行層析處理包括兩 步層析:①利用CM Sepharose FF離子交換柱層析對(duì)G-CSF復(fù)性液進(jìn)行目的蛋白高度提純，流動(dòng)相A:為0.1%醋酸溶液-0.01%Tween-80，流動(dòng)相B:為50%醋酸-0.01%Tween_80，先用流動(dòng)相A平衡層析柱，上完樣后用流動(dòng)相B分階段洗脫，在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集最高色譜峰。②將最終的離子交換層析收集液過(guò)Sephdax G_25凝膠柱,流動(dòng)相為10mmol/L醋酸-醋酸鈉-0.004%Tween-80,在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集第一色譜峰。用0.2微米的濾膜將G-25凝膠層析收集液過(guò)濾除菌，其質(zhì)量指標(biāo)要達(dá)到原液標(biāo)準(zhǔn)。原液經(jīng)SDS-PAGE電泳掃描，純度達(dá)到99%以上，HPLC顯示單峰，rhG_CSF比活性達(dá)到3.9X 108IU/mg。高于 《中和人民共和國(guó)藥典2010版》第三部的要求。
權(quán)利要求
1.一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，包括(I)對(duì)大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得包涵體，(2)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的提取和洗滌，得到精制包涵體；(3)對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，得到變性所得物；(4)對(duì)變性所得物進(jìn)行復(fù)性處理；(5)對(duì)復(fù)性所得物進(jìn)行層析純化處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其特征在于:所述大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株為PKG931/HB101，培養(yǎng)方法包括擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，其中擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下子步驟: ①.菌種復(fù)蘇:將工程菌株進(jìn)行菌種復(fù)蘇，將種子液接種到液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng)12-14小時(shí)； ②.一級(jí)種子液培養(yǎng):將復(fù)蘇后的種子液接種到含液體LB培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，設(shè)定搖床溫度為30°C，150r/min，培養(yǎng)9-11小時(shí)； ③.二級(jí)種子液培養(yǎng):將一級(jí)種子液按增加1%的體積比方式接種到含30L液體LB的貝朗50L發(fā)酵罐中，罐培養(yǎng)控制條件為:轉(zhuǎn)速100-300rpm/min，通氣30L/min，罐壓0.1-0.2bar，溫度30°C，溶氧不低于50%,培養(yǎng)3-5小時(shí)，至OD600值至為1.0-2.0時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，取樣鏡檢觀(guān)察無(wú)雜菌，菌種形態(tài)正常，即為發(fā)酵罐培養(yǎng)用種子； 所述發(fā)酵罐培養(yǎng)包括如下子步驟: ①.發(fā)酵前的準(zhǔn)備:采用貝朗公司500L發(fā)酵罐，將發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮液接入發(fā)酵罐并定容至500L，設(shè)定滅菌溫度115°C，30min,發(fā)酵罐自動(dòng)在線(xiàn)滅菌； ②.發(fā)酵罐培養(yǎng):滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到30°C時(shí)，將種子罐中二級(jí)種子液通過(guò)管道接種到500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)控制條件為:培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量及罐壓等將溶氧控制在30%以上，各參數(shù)調(diào)節(jié)范圍為:轉(zhuǎn)速200—450r/min、通氣量100-400L/min、罐壓0.1-0.3bar，培養(yǎng)4小時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)； ③.誘導(dǎo)發(fā)酵:誘導(dǎo)溫度為37-42°C，誘導(dǎo)4小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)離心收集發(fā)酵產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述LB培養(yǎng)基的組份及其配比為:10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化鈉。
3.如權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基濃縮液的組份及其配比為:3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500gKH2PO4.2H20+2000gNa2HP04+500g NH4Cl+250g NaCl+5000g 葡萄糖 +62.5g MgCl2+6.25gCaCl2。
4.如權(quán)利要求1至3中之一所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于:上述發(fā)酵罐培養(yǎng)子步驟②和③中，通過(guò)補(bǔ)加氨水控制PH為6.0-7.0，誘導(dǎo)后即開(kāi)始補(bǔ)料，補(bǔ)料速度為每小時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基5L。
5.如權(quán)利要求4所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基的組份及其配比為:100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。
6.如權(quán)利要求1至3中之一所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(2)中包涵體提取和包涵體洗滌子步驟為: ①包涵體提取:用25mmol/LTris-HCl-EDTA溶液構(gòu)成的重組人粒細(xì)胞刺激因子發(fā)酵菌裂解液將菌體懸浮，利用高壓均質(zhì)機(jī)加壓到500-600bar進(jìn)行勻漿破碎，然后用管式離心機(jī)連續(xù)流離心的方法收集G-CSF包涵體； ②包涵體洗滌:先用25mmol/LTris_HCl+2M鹽酸胍溶液+0.5%曲拉通X-100重組人粒細(xì)胞刺激因子包涵體洗滌液將沉淀離心洗滌2次，再用純化水將沉淀離心洗滌2次，洗滌過(guò)程離心收集沉淀，得精制G-CSF包涵體。
7.如權(quán)利要求1至3中之一所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(3)對(duì)精制包涵體進(jìn)行變性處理，是用20mmol/L Tris-HCl 一 IOmmoI/L DTT 一 8mol/L尿素將G-CSF包涵體進(jìn)行溶解,然后離心收集上清液。
8.如權(quán)利要求1至3中之一所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(4)復(fù)性處理，是將G-CSF包涵體蛋白溶液用20mmol/L Tris-HCl 一 10mmol/L半胱氨酸-尿素進(jìn)行稀釋復(fù)性，包涵體蛋白溶液與復(fù)性用溶液體積比1:11，加入氯化銅溶液作為催化劑，室溫下攪拌4-5小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1至3中之一所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(5)對(duì)復(fù)性所得物進(jìn)行層析純化處理，包括利用CM Sepharose FF離子交換柱層析對(duì)G-CSF復(fù)性液進(jìn)行目的蛋白高度提純，流動(dòng)相A為0.1%醋酸溶液-0.01% Tween-80，流動(dòng)相B為50%醋酸-0.01% Tween-80，先用流動(dòng)相A平衡層析柱，上完樣后用流動(dòng)相B分階段洗脫，在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集最高色譜峰。
10.如權(quán)利要求9所述的重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于在用CMSepharoseFF離子交換柱層析后還用Sephdax G_25凝膠柱層析，流動(dòng)相為10mmol/L醋酸-醋酸鈉-0.004%Tween-80，在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)器下收集第一色譜峰，最后再用用0.2微米的濾膜將G-25凝膠層析收集液`過(guò)濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，包括對(duì)大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得包涵體，所述大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株為pKG931/HB101，培養(yǎng)方法包括擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，均采用含酵母和蛋白胨的無(wú)抗生素培養(yǎng)基，采用高壓均質(zhì)機(jī)破菌，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和層析，得到高純度G-CSF原液。本發(fā)明的生產(chǎn)方法生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)規(guī)模大，特別適于工業(yè)化生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103233053SQ20131011611
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者程度勝, 桑建彬, 韓明娣, 龍應(yīng)國(guó), 王曉建 申請(qǐng)人:北京四環(huán)生物制藥有限公司