專利名稱：重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其化學(xué)修飾物的一步純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)及其修飾物純化領(lǐng)域，具體而言就是簡單高效地制備高純度、高活性的藥用蛋白質(zhì)溶液的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及用相當(dāng)簡單的方法，通過一個步驟純化出高純度的rhG-CSF或其聚乙二醇(PEG)修飾物溶液的方法，特別適合于該蛋白及其聚乙二醇修飾物在醫(yī)藥工業(yè)中的的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程重組蛋白技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用越來越多，很多在人類疾病的預(yù)防和治療中有明顯作用的蛋白質(zhì)都通過基因工程重組的手段被制備出來，并有效地應(yīng)用于許多人類疾病的預(yù)防和治療上。例如干擾素(α-IFN，β-IFN，γ-IFN)、白細(xì)胞介素(IL-2，IL-11)、腫瘤壞死因子、造血生長因子(G-CSF，GM-CSF和EPO)、各類溶栓藥物(SK，tPA，hirudin)以及各種激素(insulin，PTH)等。
在基因工程重組蛋白技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)的近20年的發(fā)展過程中，既適合于規(guī)模化生產(chǎn)，其所得產(chǎn)品又符合藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重組蛋白生產(chǎn)工藝路線的研究逐漸被人們重視起來。例如早期用于重組蛋白質(zhì)純化的親和層析方法，已越來越不適合規(guī)?；a(chǎn)的需要；有的重組蛋白純化工藝方法復(fù)雜，步驟繁多，雖然純度達(dá)到了所需要求，但回收率及蛋白的生物活性都很受影響。G-CSF于1991年被美國FDA批準(zhǔn)投放市場，用于治療放療后中性粒細(xì)胞減少癥，國內(nèi)目前有廠家在生產(chǎn)銷售。其聚乙二醇修飾的長效制劑PEG-G-CSF(商品名為Neulasta)也已于2002年被美國FDA批準(zhǔn)投放市場。根據(jù)文獻(xiàn)及相關(guān)專利的報道，現(xiàn)行rhG-CSF的純化工藝路線大多采用包涵體復(fù)性-疏水層析-離子交換層析等；PEG-G-CSF的純化工藝路線大多采用凝膠過濾配合離子交換層析等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種簡單高效的生產(chǎn)rhG-CSF及其PEG修飾物的工藝方法，通過一次柱層析得到高純度的rhG-CSF或PEG修飾物。
本發(fā)明是在研究國內(nèi)外較為成熟的rhG-CSF及其PEG修飾物的一些純化方法的基礎(chǔ)上，通過試驗研究目的蛋白(rhG-CSF及其PEG修飾物)的一些特性及其與陽離子層析介質(zhì)的一些特殊作用關(guān)系，總結(jié)并發(fā)明該方法。
G-CSF是用于治療造血障礙引起的白細(xì)胞減少癥(如化療)的治療用蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述G-CSF可以是從哺乳動物有機體分離純化而來，也可是化學(xué)合成產(chǎn)品，或者是通過原核生物或真核生物宿主表達(dá)的外源性DNA序列而得到的產(chǎn)品。其中DNA可以從基因組或cDNA合成而得。合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌(如大腸桿菌)；合適的真核生物宿主包括酵母及哺乳動物細(xì)胞(如，CHO)。因宿主不同，所得G-CSF可能會被糖基化或非糖基化。G-CSF也可包括一個起始的甲硫氨酸殘基(第一位)。同時，G-CSF類似物可包括具有氨基酸添加、缺失、替代及融合方式等。上述G-CSF及其類似物適合本發(fā)明。
其中采用大腸桿菌表達(dá)的rhG-CSF多為包涵體形式，本發(fā)明對rhG-CSF包涵體的制備、洗滌、溶解和復(fù)性方法是加溶菌酶輔以高壓勻漿破菌，破菌緩沖帶5mM EDTA和1.0％ Triton X-100；離心得包涵體后直接用含4M尿素的緩沖液洗滌包涵體，同法洗滌兩次后包涵體蛋白純度可達(dá)80％；離心得包涵體沉淀，用含8M尿素的緩沖液直接溶解包涵體，溶解后采用逐步稀釋輔以超濾對包涵體進行復(fù)性和濃縮，所得樣品進行陽離子交換。層析上樣及平衡緩沖液pH為4.0，rhG-CSF能很好地結(jié)合在介質(zhì)上，用100mM，pH為7.0的磷酸鈉緩沖液(PB)洗脫，所得rhG-CSF純度大于95％，回收率大于80％。
本發(fā)明所述PEG修飾是制備PEG與蛋白質(zhì)連接物的方法，主要采用了烷化法和酰化法。在還原型烷基化反應(yīng)條件下，將含多余一個氨基的蛋白質(zhì)分子與PEG反應(yīng)，反應(yīng)液的pH值應(yīng)適合于選擇激活所說蛋白質(zhì)分子氨基酸末端的a-氨基酸，所以PEG附著于所述a-氨基酸殘基上。?；ㄊ荘EG與蛋白氨基酸殘基中的Lys發(fā)生?；s合反應(yīng)而結(jié)合。烷化法和?；ㄊ悄壳拜^為成熟的兩種PEG修飾方法。
對所得rhG-CSF進行PEG修飾，所得樣品中含有未修飾的rhG-CSF，修飾N末端的rhG-CSF和非N端(Lys位點)修飾的rhG-CSF。使用同樣的層析介質(zhì)和緩沖條件，反應(yīng)產(chǎn)物能很好地結(jié)合在介質(zhì)上，游離PEG直接透過。充分平衡后，改變緩沖液的pH至5.6，僅修飾N末端的rhG-CSF被洗脫下來；改變緩沖液的pH至6.2，非N端(Lys位點)修飾的rhG-CSF被洗脫下來；再改變緩沖液的pH至7.0，未修飾的rhG-CSF被洗脫下來。其中，所得PEG-G-CSF純度大于95％，回收率大于80％。
四

附圖1SP Sepharose F.F.純化rhG-CSF示意圖附圖2SP Sepharose F.F.純化N端PEG修飾的rhG-CSF示意圖附圖3SP Sepharose F.F.純化Lys PEG修飾的rhG-CSF示意圖附圖4純化的rhG-CSF和PEG-G-CSF的SDS-PAGE電泳分析五、具體實施實例實例一rhG-CSF構(gòu)建、表達(dá)及復(fù)性人G-CSF氨基酸序列如下NH2-Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu LysCys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu CysAla Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly IlePro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu SerGln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile SerPro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Vla Ala Asp Phe Ala Thr ThrIle Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly AlaMet Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser HisLeu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro-COOH全基因合成人G-CSF cDNA基因片段，應(yīng)用遞歸PCR方法獲得3’端含NdeI和5’端含BamHI的插入片段，該序列重組到質(zhì)粒pET-3a，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)pLysS進行表達(dá)，表達(dá)溫度37℃，IPTG終濃度0.2mmol/L，所得目的蛋白為包涵體形式。配制破菌緩沖液如下50mmol/L Tris.CL，pH10.05mmol/L EDTA0.1mg/ml溶菌酶1.0％ Triton
以100g濕菌1L緩沖液比例懸浮菌體，高壓勻漿破菌(30-40MP/2-3次)，10,000rpm/15min離心收集包涵體沉淀。配制包涵體洗滌液如下50mmol/L Tris.CL，pH9.05mmol/L EDTA4mmol/L Urea以10g包涵體100ml緩沖液比例懸浮包涵體，攪拌洗滌30min，10,000rpm/15min離心棄上清，配制溶解緩沖液50mmol/L Tris.CL，pH9.05mmol/L EDTA8mmol/L Urea0.05％(v/v)β-ME以10g包涵體100ml緩沖液比例懸浮包涵體，攪拌溶解1hr，10,000rpm/15min離心收集上清。配制復(fù)性緩沖液20mmol/L Tris.CL，pH9.020umol/L CuSO4取包涵體溶液，加入1倍體積復(fù)性緩沖液，尿素終濃度為4mmol/L，室溫攪拌30min；再加入1倍體積復(fù)性緩沖液，尿素終濃度為2.7mmol/L，室溫攪拌30min；再加入1倍體積復(fù)性緩沖液，尿素終濃度為2mmol/L，室溫攪拌30min；再加入1倍體積復(fù)性緩沖液，尿素終濃度為1.6mmol/L，室溫攪拌30min；再加入1倍體積復(fù)性緩沖液，尿素終濃度為0.8mmol/L，室溫攪拌過夜(約12hr)。用分子截流量為3KD的中空超濾柱超濾濃縮至1/10體積。配制稀釋液25mmol/L Tris.CL，pH9.01mmol/L EDTA10umol/L CuSO4用稀釋液稀釋濃縮液4倍，再超濾濃縮至1/4體積，得rhG-CSF蛋白復(fù)性液。
實例二rhG-CSF一步純化樣品處理，即用乙酸調(diào)節(jié)復(fù)性液至pH4.0，離心去沉淀。取陽離子層析介質(zhì)SP Sepharose F.F.，裝柱后平衡緩沖液(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH4.0)平衡至基線后上樣樣品，再用平衡緩沖液平衡至基線。取洗脫緩沖液(100mmol/L磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.0)洗脫下rhG-CSF目的蛋白峰。按介質(zhì)說明書方法再生層析介質(zhì)，去除其他雜質(zhì)蛋白。用SDS-PAGE電泳法和RP-HPLC法測定所得目的蛋白純度。
實例三rhG-CSF的PEG修飾1.烷化法N-末端修飾取純化所得rhG-CSF，稀釋至2.0mg/ml，對0.1M NaH2PO4，pH5.0于4℃透析過夜，調(diào)節(jié)pH至5.0。取分子量為20KD的mPEG-ButyrALD(NEKTARTM)，按mPEG-ButyrALD∶rhG-CSF摩爾比5∶1比例加入mPEG-ButyrALD，充分?jǐn)嚢枞芙狻Ｔ偃?M NaCNBH3加入反應(yīng)液，終濃度為20mM。充分?jǐn)嚢杌靹蚝笾?℃反應(yīng)過夜。
2.?；∟-末端修飾取純化所得rhG-CSF，稀釋至2.0mg/ml，對0.1M NaH2PO4，pH6.5于4℃透析過夜，調(diào)節(jié)pH至6.5。取分子量為20KD的mPEG-NH2(NEKTARTM)，按mPEG-NH2∶rhG-CSF摩爾比5∶1比例加入，充分?jǐn)嚢枞芙狻Ｔ僦?5℃攪拌1hr，加入羥胺至終濃度2M，充分?jǐn)嚢杌靹蚝蠓磻?yīng)1hr。
實例四烷化法PEG-G-CSF的一步純化樣品處理，取修飾后樣品，用蒸餾水稀釋兩倍體積后，再用乙酸調(diào)節(jié)至pH4.0，離心去沉淀。取陽離子層析介質(zhì)SP Sepharose F.F.，裝柱后取平衡緩沖液I(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH4.0)平衡至基線后上樣樣品，再用平衡緩沖液II(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH5.0)平衡至基線。取洗脫緩沖液I(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH5.6)洗脫下PEG-G-CSF目的蛋白峰。取洗脫緩沖液II(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH7.0)洗脫下未修飾的rhG-CSF蛋白峰。
實例五?；≒EG-G-CSF的一步純化樣品處理，取修飾后樣品，用蒸餾水稀釋兩倍體積后，再用乙酸調(diào)節(jié)至pH4.0，離心去沉淀。取陽離子層析介質(zhì)SP Sepharose F.F.，裝柱后取平衡緩沖液I(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH4.0)平衡至基線后上樣樣品，再用平衡緩沖液II(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH5.0)平衡至基線。取洗脫緩沖液I(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH6.2)洗脫下PEG-G-CSF目的蛋白峰。取洗脫緩沖液II(10mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH7.0)洗脫下未修飾的rhG-CSF蛋白峰。
實例六產(chǎn)物純度分析及體外生物活性測定取未修飾的rhG-CSF、烷化法修飾的PEG-G-CSF和?；ㄐ揎椀腜EG-G-CSF做為供試品。分別用非還原性SDS-PAGE法和RP-HPLC法對產(chǎn)物進行純度分析。同時參照《中國生物制品規(guī)程(2000年版)》附錄“rhG-CSF效價測定(NFS-60依賴株/MTT比色法)”所述方法，對產(chǎn)物進行體外生物活性測定。
1.非還原性SDS-PAGE法測定純度參照《中國生物制品規(guī)程》(2000版)“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳”所述方法，分離膠濃度為15％，然后取rhG-CSF、烷化法修飾的PEG-G-CSF和?；ㄐ揎椀腜EG-G-CSF測定。每孔上樣10ug。凝膠掃描后用蛋白凝膠分析系統(tǒng)分析目的蛋白純度。
2.RP-HPLC法測定純度色譜條件如下高效液相系統(tǒng)為waters(600E)色譜柱Hypersil C18(300A，5u，4.6×250mm)流速1.0ml/min上樣量20ul.
檢測波長280nm洗脫條件100％ A液洗脫5分鐘，0-100％B液梯度洗脫30分鐘A液5％乙腈、0.1％TFAB液90％乙腈、0.1％TFA3.體外生物活性測定先配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液1640培養(yǎng)液2.5％小牛血清(FBS，v/v)12.5％馬血清(v/v)10ml/L丙酮酸鈉
10ml/L谷氨酰氨取對G-CSF依賴的細(xì)胞株NFS-60，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌3次，重新懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配成2.0×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，置37℃?zhèn)溆?。取rhG-CSF參照品(美國Amgen公司)和供試品，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至1.0ng/ml。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，對參照品和供試品以2倍稀釋度做梯度稀釋，共做7個稀釋度，每個梯度2個復(fù)孔。然后每孔加入50ul細(xì)胞懸液，于37℃，5％CO2培養(yǎng)48小時，每孔加入20ulMTT溶液，37℃，5％CO2培養(yǎng)5小時，每孔加入200ul裂解液(1％濃鹽酸，10％TritonX-100的異丙醇)，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測定波長570nm，參比波長630nm，記錄測定結(jié)果，根據(jù)下列公式計算供試品比活性 4.測定結(jié)果總結(jié)如下表SDS-PAGE純度 RP-HPLC純度比活性供試品(％) (％)(IU/mg)rhG-CSF97.7 98.51.1×108PEG-G-CSG(烷化法)98.1 98.74.7×107PEG-G-CSG(?；?97.2 97.94.1×107
電子可讀序列-peggcsf專利重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其化學(xué)修飾物的一步純化工藝序列表Organization ApplicantStreet重慶市石橋鋪科園四街70號City重慶市State重慶市Country中華人民共和國PostalCode400041PhoneNumber023-68888852FaxNumber023-68699676EmailAddressfankai1963@yahoo.com.cn<110>OrganizationName重慶富進生物醫(yī)藥有限公司Application Project<120>Title重組入粒細(xì)胞集落刺激因子及其化學(xué)修飾物的一步純化工藝<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate<160>1<170>PatentIn version 3.2SequenceSeq1<213>OrganismName天然序列<400>PreSequenceStringMet Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu15Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala30Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro45Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala60Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys75Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly leu Leu90Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp105Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln120Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln135Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly150Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser165Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro175<212>TypePRT<211>Length10SequenceName人G-CSF氨基酸序列Feature<221>FeatureKeymat_peptide<222>LocationFrom1<222>LocationTo10Other Information人G-CSF氨基酸序列CDSJoinYes
權(quán)利要求
1.一種用陽離子交換層析純化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其聚乙二醇化學(xué)修飾產(chǎn)物的方法，其特征是一步純化，純度高，活性高及回收率高。
2.權(quán)利要求1所述一步陽離子交換層析方法適用于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化。
3.權(quán)利要求1所述一步陽離子交換層析方法同樣適用于經(jīng)聚乙二醇化學(xué)修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化。
4.權(quán)利要求1所述的陽離子交換層析指弱離子型交換介質(zhì)和強離子型交換介質(zhì)。
5.權(quán)利要求4所述的陽離子交換層析介質(zhì)聚合物包括Sephadex、Sepharose、Cellulose及Source等。
6.權(quán)利要求2所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子指應(yīng)用基因工程手段制備的天然型或經(jīng)缺失、突變以及嵌合的形式。
7.權(quán)利要求3所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聚乙二醇化學(xué)修飾產(chǎn)物指重組人粒細(xì)胞集落刺激因子N末端和非N末端的聚乙二醇修飾產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求1所述陽離子交換層析的條件為(1).平衡緩沖液離子強度為5-50mmol/L，酸堿度為2.0-5.0。(2).洗脫緩沖液離子強度為10-200mmol/L，酸堿度為5.0-9.0。(3).洗脫緩沖液鹽離子梯度為0-500mmol/L氯化鈉。
9.權(quán)利要求8所述緩沖液體系主要指乙酸鈉，磷酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鈉以及甘氨酸的緩沖。
10.權(quán)利要求8所述洗脫條件可以單獨用pH或氯化鈉梯度，也可兩者同時使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡單高效的純化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG－CSF)及其化學(xué)修飾產(chǎn)物的一步純化工藝。該工藝主要采用陽離子交換層析的方法，通過一步層析而有效地得到高活性、高純度和高回收率的rhG－CSF和聚乙二醇化學(xué)修飾的rhG－CSF，特別適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K17/00GK1663962SQ20041000717
公開日2005年9月7日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者范開, 王建, 張憲, 陳海蓉, 胡偉 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司