專利名稱：干細(xì)胞增殖抑制劑和刺激劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑在治療具有自身免疫疾病、衰老、癌癥、脊髓發(fā)育不良、前白血病、白血病、牛皮癬、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、骨髓發(fā)育不良綜合癥、再生障礙性貧血或其它涉及增生過(guò)度或增生不足紊亂的疾病的人或動(dòng)物中調(diào)節(jié)干細(xì)胞周期的用途以及這種化合物在止痛法的用途。本發(fā)明亦涉及治療預(yù)期或已經(jīng)暴露于化療藥物、其它破壞循環(huán)干細(xì)胞的藥物或放射性照射的人或動(dòng)物和在活體外治療中保護(hù)對(duì)抗這種藥物的方法。最后，本發(fā)明涉及自體和同種異體移植方法或基因轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)這種程序的體內(nèi)治療的干細(xì)胞保持或擴(kuò)增培養(yǎng)的改進(jìn)。
背景技術(shù)：
更新系統(tǒng)中的絕大多數(shù)終末期細(xì)胞是短命的，必須在生命期間連續(xù)更換。例如，血細(xì)胞源于多能造血干細(xì)胞(HSC)的自我更新群體。造血干細(xì)胞是一個(gè)亞群的造血細(xì)胞?？梢詮睦绻撬琛⒛殠а蛲庵苎?或者未動(dòng)員或者用諸如G-CSF的藥物動(dòng)員)得到造血細(xì)胞；造血細(xì)胞包括干細(xì)胞群體、遠(yuǎn)祖細(xì)胞、分化細(xì)胞、輔助細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和其它對(duì)產(chǎn)生成熟血細(xì)胞必須的環(huán)境起作用的細(xì)胞。造血遠(yuǎn)祖細(xì)胞是一個(gè)亞群的干細(xì)胞，其發(fā)育能力更具限制性。遠(yuǎn)祖細(xì)胞僅可以分化為一或二種譜系(例如僅產(chǎn)生紅細(xì)胞的BFU-E和CFU-E或產(chǎn)生粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的CFU-GM)，而干細(xì)胞(例如CFU-MIX或CFU-GEMM)可以產(chǎn)生多個(gè)譜系和/或其它干細(xì)胞。因?yàn)樵煅杉?xì)胞對(duì)造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的所有成熟細(xì)胞的發(fā)育是必需的，它們的存活對(duì)在用化療或其它藥物治療的受治療者中重建完全功能性宿主防御系統(tǒng)是必須的。
造血細(xì)胞的產(chǎn)生受一系列刺激造血細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的因子調(diào)節(jié)，一些這種因子例如紅細(xì)胞生成素、GM-CSF和G-CSF正應(yīng)用于臨床實(shí)踐。然而，尚未廣泛地特征鑒定的該控制網(wǎng)絡(luò)的一部分是控制干細(xì)胞循環(huán)狀態(tài)的生理機(jī)制(Eaves等，Blood 78110-117，1991；Lord，載于Stem Cells(C.S.Potten編輯)第401-22頁(yè)，1997(Academic Press，NY))。
Lord及其同事的早期研究表明，在正常和再生骨髓浸出物中存在可溶性蛋白因子，它們可以或者抑制或者刺激干細(xì)胞增殖(綜述于Lord和Wright，Blood Cells 6581-593，1980；Wright和Lorimore，CellTissue Kinet.20191-203，1987；Marshall和Lord，Int Rev.Cyt.167185-261，1996)。這些活性分別命名為干細(xì)胞抑制劑(SCI)和干細(xì)胞刺激劑(SCS)。
至今，尚未從按照Lord等所述(以上引用的綜述)制備的骨髓浸出物中純化候選SCS分子。由于需要大量輻照小鼠的體內(nèi)檢測(cè)的內(nèi)在困難，沒(méi)有完成從主要來(lái)源(primary source)純化或者SCS或者SCI。在克服這些困難的嘗試中，Pragnell和同事開(kāi)發(fā)了原始造血細(xì)胞(CFU-A)和做為抑制活性源的篩選細(xì)胞系的體外檢測(cè)(參見(jiàn)Graham等Nature344442-444，1990)。由于早先的研究已鑒別出巨噬細(xì)胞是可能的SCI源(Lord等Blood Cells 6581-593，1980)，選擇了小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774.2(Graham等Nature 344442-444，1990)。Graham等使用了來(lái)自該細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基進(jìn)行純化；分離了一抑制肽，證實(shí)它與先前描述的細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1-α(MIP-1α)相同。已克隆MIP-1α受體；與其它化學(xué)激動(dòng)劑受體相似，這些MIP-1α受體是七個(gè)跨膜域(或“G連接”)的受體，它偶聯(lián)于G抑制亞類(“Gi”)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(GTP)結(jié)合蛋白(綜述于Murphy，Cytokine & Growth Factor Rev.747-64，1996)。該Gi亞類的“抑制”定義指它對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制活性。
從細(xì)胞系而不是原始材料分離MIP-1α。雖然Graham等觀察到MIP-1α的抗體消除了骨髓粗提物的活性，但其它工作者已顯示其它抑制活性是重要的。例如，Graham等(J.Exp.Med.178925-32，1993)建議TGFβ而不是MIP-1α是造血干細(xì)胞的主要抑制劑。另外，Eaves等(PNAS 9012015-19，1993)建議，在正常骨髓中MIP-1α和TGFβ均以次最佳水平存在并且抑制需要這二種因子之間的協(xié)同作用。
最近，已產(chǎn)生其中該MIP-1α基因已通過(guò)同源重組缺失的小鼠(Cook等，Science 2691583-5，1995)。這種小鼠的造血系統(tǒng)沒(méi)有明顯的紊亂，使對(duì)MIP-1α在正常體內(nèi)平衡條件下做為干細(xì)胞循環(huán)的生理調(diào)節(jié)劑的作用產(chǎn)生疑問(wèn)。類似地，盡管轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)亦有干細(xì)胞抑制活性，但干細(xì)胞對(duì)該細(xì)胞因子應(yīng)答需時(shí)很久，提示它不是存在于骨髓提取物中的內(nèi)源因子；另外，TGFβ的中和抗體未消除骨髓上清液中的SCI活性(Hampson等，Exp.Hemat.19245-249，1991)。
其它工作者已描述其它干細(xì)胞抑制因子。Frindel和其同事已從胎牛骨髓和從肝提取物中分離具有干細(xì)胞抑制活性的四肽(Lenfant等，PNAS 86779-782，1989)。Paukovits等(Cancer Res.50328-332，1990)已特征鑒定一個(gè)五肽，它在單體形式時(shí)是抑制劑，而在二聚體形式時(shí)是干細(xì)胞循環(huán)的刺激劑。亦有人認(rèn)為其它因子在各種體外系統(tǒng)中具抑制性(參見(jiàn)Wright和Pragnell載于Bailliere’s Clinical Haematology第5卷，第723-39頁(yè)，1992(Bailliere Tindadall，Paris)；Marshall和Lord，IntRev.Cyt.167185-261，1996)。
Tsyrlova等，SU 1561261 A1公開(kāi)了干細(xì)胞增殖抑制劑的純化方法。
共同擁有的申請(qǐng)WO 94/22915和WO96/10634公開(kāi)了干細(xì)胞增殖的抑制劑，其全文通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
迄今，這些因子均未被批準(zhǔn)用于臨床。然而，需要有效的干細(xì)胞抑制劑。與化療或放射治療相關(guān)的主要毒性是正常增殖細(xì)胞的破壞，這可以導(dǎo)致骨髓抑制或胃腸毒性。有效的干細(xì)胞抑制劑將保護(hù)這些細(xì)胞并使這些治療制度最佳化。正如根據(jù)臨床情況確實(shí)需要各種各樣的刺激性細(xì)胞因子(即諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子、flk2/flt3配體等刺激造血細(xì)胞循環(huán)的細(xì)胞因子)，亦可能需要各種抑制因子以處理相異的臨床需要。
另外，需要快速逆轉(zhuǎn)這種抑制劑的活性。Lord等的初始研究(上述引用的綜述)證實(shí)，可以通過(guò)加入該刺激活性逆轉(zhuǎn)該抑制活性。雖然已鑒別各種干細(xì)胞刺激性細(xì)胞因子(參見(jiàn)上述)，但均未證實(shí)它們表現(xiàn)出Lord和其同事描述的在骨髓提取物存在的活性和具有逆轉(zhuǎn)該抑制劑活性的能力。
造血遠(yuǎn)祖細(xì)胞和干細(xì)胞主要存在于正常成人的骨髓中。在某些條件下，例如化療或用諸如G-CSF的細(xì)胞因子治療時(shí)，大量的遠(yuǎn)祖細(xì)胞和干細(xì)胞移出進(jìn)入外周血，該過(guò)程被稱為“動(dòng)員”(綜述于Simmons等，Stem Cels 12(增刊1)187-202，1994；Scheding等，Stem Cells 12(增刊1)203-11，1994；Mangan，Sem.Oncology 22202-9，1995；Moolten，Sem.Oncology 22271-90，1995)。最近發(fā)表的數(shù)據(jù)提示大多數(shù)活動(dòng)的遠(yuǎn)祖細(xì)胞在細(xì)胞周期中不活躍(Roberts和Metcalf，Blood 861600-，1995；Donahue等，Blood 871644-，1996；Siegert和Serke，Bone Marrow Trans.17467-1996；Uchida等，Blood 89465-72，1997)。
血紅蛋白是分子量約為64,000道爾頓的高度保守四聚體蛋白。它由二個(gè)α鏈和二個(gè)β鏈組成。每個(gè)鏈結(jié)合一個(gè)血紅素(亞鐵原卟啉IX)分子-一種含鐵的輔基。脊椎動(dòng)物的α和β鏈可能來(lái)源于單個(gè)祖先基因，該基因復(fù)制然后分歧；這二種鏈在其之間和在各種脊椎動(dòng)物之間保持高度序列相同性(參見(jiàn)

圖16A)。在人類中，在16號(hào)染色體上的α鏈簇含有二個(gè)編碼相同多肽的α基因(α1和α2)以及編碼其它類α鏈的基因(ζ和θ)和幾個(gè)非轉(zhuǎn)錄假基因(參見(jiàn)圖16B人類α鏈的cDNA和氨基酸序列)。在11號(hào)染色體上的β鏈簇含有一個(gè)β鏈基因(α1和α2)以及幾個(gè)類β基因(δ、ε、Gγ和Aγ)和至少二個(gè)不表達(dá)假基因(參見(jiàn)圖16C的人類β鏈的cDNA和氨基酸序列)。
這些基因的表達(dá)在發(fā)育中有變化。在已深入特征鑒定的人類血細(xì)胞生成中，胚胎成紅細(xì)胞相繼合成二個(gè)ζ鏈和二個(gè)ε鏈的四聚體(GowerI)、二個(gè)α鏈和二個(gè)ε鏈的四聚體(Gower II)或二個(gè)ζ鏈和二個(gè)γ鏈的四聚體(Hb Portland)。隨著胚胎發(fā)生的進(jìn)行，主要形式由包含二個(gè)α鏈和二個(gè)γ鏈的胎血紅蛋白(Hb F)組成。在胎兒期開(kāi)始合成成人血紅蛋白(二個(gè)α鏈和二個(gè)β鏈)；在出生時(shí)約50％的血紅蛋白是成人形式并在年齡為約6個(gè)月時(shí)完成轉(zhuǎn)換。成人中的大多數(shù)血紅蛋白(約97％)是二個(gè)α鏈和二個(gè)β鏈的變種(Hb A)并有少量可檢測(cè)到的Hb F或δ鏈(Hb A2)。
已使用幾種方法在大腸桿菌和在酵母中表達(dá)重組血紅蛋白鏈(例如Jessen等，Methods Enz.231347-364，1994；Looker等，Methods Enz.231364-374，1994；Ogden等，Methods Enz.231374-390，1994；Martin deLlano等，Methods Enz.231364-374，1994)。因此尚遠(yuǎn)未可能通過(guò)重組方法高產(chǎn)率表達(dá)分離的人類α鏈(例如Hoffman等，PNAS 878521-25，1990；Heman等，Biochem.318619-28，1992)。顯然，假定該分離α鏈的構(gòu)象不穩(wěn)定并在大腸桿菌中快速降解。共表達(dá)β鏈和α鏈導(dǎo)致二者的表達(dá)增加(Hoffman等和Hernan等，在所引的書(shū)中)。雖然該α鏈已做為與β鏈的一部分和因子X(jué)a識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白表達(dá)(Nagai和Thorgersen，Methods Enz.231347-364，1994)，但在這些條件下它做為不溶性包含體表達(dá)。
該β鏈和該α鏈均含有觸珠蛋白結(jié)合位點(diǎn)。觸珠蛋白是對(duì)血紅蛋白有極高親和性的血清蛋白(例如Putnam載于The Plasma Proteins-Structure，F(xiàn)unction and Genetic Control(F.W.Putnam編輯)第二卷，第1-49頁(yè)(Academic Press，NY)；Hwang和Greer，JBC 2553038-3041，1980)。觸球蛋白運(yùn)輸至肝臟是循環(huán)血紅蛋白的主要分解代謝途徑。在該α鏈上有一個(gè)觸球蛋白結(jié)合位點(diǎn)(氨基酸121-127)，在該β鏈上有二個(gè)觸球蛋白結(jié)合位點(diǎn)(氨基酸區(qū)11-25和131-146)(Kazim和Atassi，Biochem J.197507-510，181；McCormick和Atassi，J.Prot.Chem.9735-742，1990)。
通過(guò)血紅蛋白的蛋白水解降解得到了具有阿片制劑活性的生物學(xué)活性肽(綜述于Karelin等，Peptides 16693-697，1995)。血紅蛋白α鏈在氨基酸94-95之間有一個(gè)酸不穩(wěn)定切割位點(diǎn)(Shaeffer，J.Biol.Chem.26929530-29536，1994)。
Kregler等(Exp.Hemat.911-21，1981)已公開(kāi)了血紅蛋白對(duì)小鼠骨髓CFU-C祖代集落具有增強(qiáng)活性。這種檢測(cè)證實(shí)對(duì)與諸如CFU-MIX的干細(xì)胞相反的CFU-GM和CFU-M祖代群體的作用。作者在血紅蛋白的分離α鏈和β鏈都觀察到活性。該活性被N-乙基馬來(lái)酰亞胺處理消除，提示Kregler等巰基是必需的。該觀察與該刺激活性對(duì)胰蛋白酶消化有抗性的事實(shí)耦合，提示Kregler等C末端疏水域或“核心”區(qū)負(fù)責(zé)該活性。Moqattash等(Acta.Haematol.92182-186，1994)已公開(kāi)了重組血紅蛋白對(duì)CFU-E、BFU-E和CFU-GM遠(yuǎn)祖細(xì)胞數(shù)量有刺激作用，與用氯高鐵血紅素觀察到的類似。Mueller等(Blood 861974，1995)已公開(kāi)了純化的成人血紅蛋白以與氯高鐵血紅素類似的方式刺激紅細(xì)胞類祖代。
Petrov等(Bioscience Reports 151-14，1995)公開(kāi)了“未鑒別的骨髓肽(myelopeptide)混合物”治療Wv/Wv小鼠先天性貧血的用途。該混合物增加了脾集落尤其是紅細(xì)胞類類型的數(shù)量。
已就其對(duì)血細(xì)胞形成的影響廣泛地檢測(cè)了血紅素和氯高鐵血紅素(有關(guān)綜述參見(jiàn)S.Sassa，Seminars Hemat.25312-20，1998和N.Abraham等，Int.J.Cell Cloing 9185-210，1991)。成紅細(xì)胞的成熟需要血紅素；氯高鐵血紅素(氯亞鐵原卟啉IX，即具有另外一個(gè)氯離子的血紅素)在體外增強(qiáng)CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E的增殖。類似地，氯高鐵血紅素在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物中增加細(xì)胞構(gòu)成。
“阿片制劑”是具有與嗎啡(鴉片中的主要活性物質(zhì))類似的鎮(zhèn)痛性質(zhì)的物質(zhì)。阿片制劑可以是小有機(jī)分子(例如嗎啡和其它生物堿或合成化合物)、或諸如腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽和其化學(xué)衍生物。內(nèi)源阿片制劑肽在體內(nèi)從較大的前體產(chǎn)生-Met-和Leu-腦啡肽的前體是前腦啡肽原，α、β和γ內(nèi)啡肽的前體是前阿黑皮素原，強(qiáng)啡肽A和B、α-新內(nèi)啡肽和β-新內(nèi)啡肽的前體是前強(qiáng)啡肽原。另外，可以從非傳統(tǒng)來(lái)源例如諸如α或β酪蛋白、面筋、乳清蛋白、細(xì)胞色素或血紅蛋白之類的蛋白的蛋白水解或水解或從諸如蛙皮膚(皮啡肽)或牛腎上腺髓質(zhì)的其它物質(zhì)得到具有阿片制劑活性的肽。這種肽已被命名為“外啡肽(exorphins)”以與經(jīng)典的內(nèi)啡肽相對(duì)照；它們亦被稱為非典型阿片制劑肽(Zioudrou等，JBC 2542446-9，1979；Quirion和Weiss，Peptides4445，1983；Loukas等，Biochem.224567，1983；Brantl，Eur.J.Pharm.106213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.111293-4，1985；Brantl等，Eur.J.Pharm.125309-10，1986；Brantl和Neubert，TIPS 76-7，1986；Glamsta等，BBRC 1841060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104499-28，1993；Petrov等，Bioscience Reports 151-14，1995；Karelin等，Peptides 16693-7，1995)。其它內(nèi)源肽，例如Tyr-MIF-1家族，亦顯示出具有阿片制劑活性(Reed等，Neurosci.and Biobehav.Rev.18519-25，1994)。
阿片制劑通過(guò)與三個(gè)主要藥理學(xué)類的內(nèi)源阿片制劑受體-μ、δ和κ結(jié)合而發(fā)揮其作用。已克隆了代表每個(gè)藥理學(xué)類的受體并顯示出它們是偶聯(lián)至Gi的G連接受體(綜述于Reisine和Bell，TINS 16506-510，1993；Uhl等，TINS 1789-93，1994；Knapp等，F(xiàn)ASEB J.9516-525，1995；Satoh和Minami，Pharm.Ther.68343-64，1995；Kieffer，Cell.Mol.Neurobiol.15615-635，1995；Reisine，Neuropharm.34463-472，1995；Zaki等，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.，36379-401，1996)。
可以得到每種受體類型的特異性激動(dòng)劑和拮抗劑，這些受體例如為μ受體(它們選擇性地被DAMGO和DALDA激活，并選擇性地被CTOP和naloxonazine拮抗)、κ受體(它們選擇性地被GR 89696延胡索酸鹽或U-69593激活，并選擇性地被鹽酸nor-binaltorphimine拮抗)和δ受體(它們選擇性地被DADLE和DPDPE激活，并選擇性地被natrindole拮抗)。另外，有對(duì)所有這三種受體亞型起作用的廣譜拮抗劑(例如納洛酮)和激動(dòng)劑(例如羥戊甲嗎啡)。
典型和非典型阿片制劑肽均可以化學(xué)改變或衍生，以改變其特異性阿片制劑受體結(jié)合特性(綜述于Hruby和Gehrig，Med.Res.Rev.9343-401，1989；Schiller，Prog.Med.Chem.28301-40，1991；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104499-28，1993；Handbood ofExperimental Pharmacology，A.Hertz(編輯)第104/I和104/II卷，1993，Springer Verlag，Berlin；Karelin等，Peptides 16693-7，1995)。實(shí)例包括皮啡肽(例如DALDA)和腦啡肽(例如DADLE、DAMGO或DAMME)的衍生物。通常不與阿片制劑受體結(jié)合的肽例如生長(zhǎng)抑素亦可以被衍生，以表現(xiàn)特異性阿片制劑受體結(jié)合(例如CTOP(Hawkins等，J.Pharm.Exp.Ther.24873，1989)。亦可以從諸如改變了受體結(jié)合特性的嗎啡的生物堿衍生類似物(例如海洛因、可待因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol和納布啡)；另外，結(jié)構(gòu)與嗎啡不相關(guān)的小分子亦可以作用于阿片制劑受體(例如哌替啶及其同性質(zhì)物阿法羅定、地芬諾酯和芬太尼)(參見(jiàn)Handbook of ExperimentalPharmacology，在所引的書(shū)中；Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics，第七版，A.G.Gilman，L.S.Goodman，T.W.Rall和F.Murad(編輯)1985 Macmillan Publishing Co.NY)。
內(nèi)源阿片制劑肽(腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽)具有一個(gè)保守N末端四肽Tyr-Gly-Gly-Phe，其后是Leu或Met和任何其余的C末端序列。去除N末端Tyr的羥基(產(chǎn)生一個(gè)N末端Phe)導(dǎo)致Met-腦啡肽活性的顯著喪失。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)導(dǎo)致“信息-地址”假說(shuō)，根據(jù)該假說(shuō)，N末端“信息”賦予生物學(xué)活性，而C末端“地址”賦予特異性和增強(qiáng)的效力(Chavkin和Goldstein，PNAS 786543-7，1981)。外啡肽一般具有取代典型阿片制劑肽的N末端Tyr-Gly的Tyr-Pro；據(jù)認(rèn)為該脯氨酸殘基賦予對(duì)抗氨肽酶降解的較高穩(wěn)定性(Shipp等，PNAS 86287-，1989；Glamsta等，BBRC 1841060-6，1992)。
最近通過(guò)與μ、δ和κ阿片制劑受體的序列相關(guān)性克隆了一個(gè)孤兒受體(orphan receptor)(“ORL1”)(Mollereau等，F(xiàn)EBS 34133-38，1994；Fukuda等，F(xiàn)EBS 34342-46，1994；Bunzow等，F(xiàn)EBS 347284-8，1994；Chen等，F(xiàn)EBS 347279-83，1994；Wang等，F(xiàn)EBS 34875-79，1994；Keith等，Reg.Peptides 54 143-4，1994；Wick等，Mol.Brain Res.2737-44，1994.Halford等，J.Neuroimmun.5991-101，1995)。已克隆該受體的配體，各稱為傷害感受肽(nociceptin)或孤兒肽(orphanin)FQ(以下稱為“傷害感受肽”)并顯示為衍生自一較大的前體的十七肽(Meunier等，Nature377532-535，1995；Reinscheid等，Science 270792-794，1995)。已證實(shí)它具有體內(nèi)原傷害性、痛覺(jué)過(guò)敏功能，與具有止痛性質(zhì)的典型片制劑相反。傷害感受肽具有Phe-Gly-Gly-Phe…N末端基序，與上述討論的經(jīng)典阿片制劑肽的Tyr-Gly-Gly-Phe…N末端基序形成對(duì)照。與經(jīng)典阿片制劑肽的阿片制劑活性需要N末端Tyr相一致，傷害感受肽對(duì)該μ、δ或κ阿片制劑受體幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出親和性或沒(méi)有親和性。類似地，廣譜阿片制劑拮抗劑納洛酮對(duì)ORL1沒(méi)有可察覺(jué)的親和性。
已觀察到腦啡肽對(duì)固定壓力條件下的體內(nèi)鼠血細(xì)胞形成有影響(Goldberg等，F(xiàn)olia Biol.(Praha)36319-331，1990)。Leu-腦啡肽抑制骨髓血細(xì)胞形成，而met-腦啡肽刺激骨髓血細(xì)胞形成。Goldberg等相信，由于對(duì)糖皮質(zhì)激素水平和T淋巴細(xì)胞遷移的影響，這些作用是間接的。Krizanac-Bengez等(Biomed. & Pharmacother.46367-43，1992；Biomed. & Pharmacother.4927-31，1995；Biomed. & Pharmacother.5085-91，1996)觀察了這些化合物在體外的作用。用Met-或Leu-腦啡肽或納洛酮預(yù)處理鼠骨髓影響了在集落檢測(cè)中觀察到的GM遠(yuǎn)祖細(xì)胞的數(shù)量。這個(gè)作用是高度可變的并導(dǎo)致抑制、刺激或無(wú)作用；另外，沒(méi)有清晰的劑量反應(yīng)。Krizanac-Bengez等將該可變性歸于晝夜節(jié)律和輔助細(xì)胞。
近來(lái)，已證實(shí)其中該μ阿片制劑受體已通過(guò)同源重組缺失的小鼠的每個(gè)股骨中有增加數(shù)量的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM。與正常小鼠相比，在這些μ受體剔除的小鼠中髓和脾祖代更快速地循環(huán)。未確定這些作用是否由這些動(dòng)物中該μ受體缺失導(dǎo)致的對(duì)骨髓干細(xì)胞直接或間接的影響引起(Broxmeyer等，Blood 88338a，1997)。
I.癌癥的化療和放療對(duì)刺激性生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)性研究導(dǎo)致多種這些因子(紅細(xì)胞生成素，G-CSF、GM-CSF等)的臨床應(yīng)用。這些因子已降低與化療和放射治療相關(guān)的死亡率和發(fā)病率。對(duì)正在進(jìn)行化療或放射的病人的其它臨床益處可以通過(guò)阻斷干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的通路由此保護(hù)它們免受毒性副作用的替代策略而實(shí)現(xiàn)。這種保護(hù)的逆轉(zhuǎn)使得化療或放療之后骨髓功能快速恢復(fù)。
II.骨髓和干細(xì)胞移植、活體外干細(xì)胞擴(kuò)增和腫瘤凈化骨髓移植(BMT)是對(duì)各種血液學(xué)的、自身免疫和惡性疾病的有用治療。目前的療法包括從臍帶血、胎肝或從外周血(或者未動(dòng)員或者已用諸如G-CSF或環(huán)磷酰胺動(dòng)員)以及從骨髓得到的造血細(xì)胞；所述干細(xì)胞可以未純化、部分純化(例如CD34+群體的親和純化)或高度純化(例如使用諸如CD34、CD38或若丹明的標(biāo)記物通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選)。目前正使用活體外造血細(xì)胞操作以將初始干細(xì)胞擴(kuò)增為適于移植的群體。該方法的優(yōu)化需要(1)能保持血細(xì)胞形成的長(zhǎng)期重建的足夠數(shù)量的干細(xì)胞；(2)排除誘導(dǎo)移植物抗宿主的T淋巴細(xì)胞和(3)不存在殘留惡性細(xì)胞。該方法可以通過(guò)包括干細(xì)胞抑制劑和/或干細(xì)胞刺激劑而優(yōu)化。
用細(xì)胞毒性藥物凈化造血細(xì)胞以清除殘留惡性細(xì)胞的效力由于這些化合物對(duì)正常造血細(xì)胞和特別是干細(xì)胞的毒性而受限制。需要在凈化期間有效保護(hù)正常細(xì)胞；通過(guò)用有效抑制劑將干細(xì)胞退出循環(huán)可以提供保護(hù)。
III.外周干細(xì)胞的收獲對(duì)自體移植而言，外周血干細(xì)胞(PBSC)比骨髓提供一些潛在的優(yōu)點(diǎn)。由于腫瘤牽扯或先前的化療而無(wú)適當(dāng)骨髓收獲位點(diǎn)的病人仍可進(jìn)行PBSC收集。使用血液干細(xì)胞消除了不能很好耐受的病人中全身麻醉的需要和外科手術(shù)步驟。對(duì)收集血細(xì)胞必需的分離性輸血技術(shù)是有效的，并在大多數(shù)主要的醫(yī)療中心可廣泛利用。該方法的主要限制是外周血中干細(xì)胞的低正常穩(wěn)定狀態(tài)頻率和它們?cè)谟盟幬锘蛏L(zhǎng)因子(例如環(huán)磷酰胺、G-CSF、干細(xì)胞因子)動(dòng)員程序后的高循環(huán)狀態(tài)。有效的干細(xì)胞抑制劑可用于將這種細(xì)胞回復(fù)至靜止?fàn)顟B(tài)，由此防止它們通過(guò)分化損失。
IV.治療高增殖性紊亂一些疾病的特征在于高增殖狀態(tài)，其中異常調(diào)節(jié)的干細(xì)胞引起末期細(xì)胞的過(guò)量產(chǎn)生。這種疾病狀態(tài)包括但不限于牛皮癬(其中表皮細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生)、特征在于腸息肉出現(xiàn)的胃腸道內(nèi)的前惡性疾病和早期干細(xì)胞未被HIV感染但卻快速循環(huán)導(dǎo)致干細(xì)胞耗盡的獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。干細(xì)胞抑制劑將可用于這類疾病的治療。
V.治療低增殖性紊亂一些疾病的特征在于低增殖狀態(tài)，其中異常調(diào)節(jié)的干細(xì)胞引起末期細(xì)胞的不足量產(chǎn)生。這種病態(tài)包括脊髓發(fā)育不良綜合癥或再生障礙性貧血(其中血細(xì)胞產(chǎn)生不足)和細(xì)胞再生和更換缺陷的與衰老相關(guān)的病況。干細(xì)胞刺激劑將可用于這種病況的治療。
VI.基因轉(zhuǎn)移目前正在臨床背景下應(yīng)用將遺傳信息轉(zhuǎn)移入造血細(xì)胞的能力。造血細(xì)胞是基因治療的有用的靶，因?yàn)樵诨铙w外操作和處理這種組織時(shí)易于接近和廣泛的經(jīng)驗(yàn)以及因?yàn)檠杭?xì)胞透過(guò)組織的能力。另外，通過(guò)將功能基因插入人造血系統(tǒng)的原始干細(xì)胞中，可以修正某些人類遺傳缺陷。
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者基因轉(zhuǎn)移的物理技術(shù)將基因?qū)肴祟愒煅?xì)胞有幾個(gè)限制(1)造血組織中干細(xì)胞的低頻率需要發(fā)展高效基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；和(2)更快循環(huán)的干細(xì)胞證實(shí)對(duì)載體感染更敏感，但是通過(guò)用生長(zhǎng)因子刺激干細(xì)胞增殖增加感染頻率對(duì)長(zhǎng)期基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)作用，因?yàn)楹修D(zhuǎn)基因的細(xì)胞被迫不可逆地分化并喪失其自我更新。可以通過(guò)使用干細(xì)胞抑制劑以防止分化和自我更新的喪失和用干細(xì)胞刺激劑調(diào)節(jié)干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，并因此有助于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移而改進(jìn)這些問(wèn)題。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及包括為干細(xì)胞增殖的抑制劑和/或刺激劑的肽和多肽的化合物(INPROL和阿片制劑化合物)及其用途。
本發(fā)明包括以以下性質(zhì)為特征的干細(xì)胞增殖抑制劑(a)鼠集落形成脾(CFU-S)檢測(cè)中比活(IC50)小于等于20ng/ml(參見(jiàn)實(shí)施例4)，(b)分子量大于10,000道爾頓并小于100,000道爾頓(通過(guò)超濾)，(c)活性對(duì)胰蛋白酶降解敏感，(d)比MIP-1α或TGFβ疏水性更強(qiáng)，并可通過(guò)反相層析與這二者分離(參見(jiàn)實(shí)施例12)，(e)在水溶液中于37℃、55℃或75℃加熱1小時(shí)后保持生物學(xué)活性并且
(f)用丙酮中的1％鹽酸沉淀后保持生物學(xué)活性。
本發(fā)明的另一特征及其與其它候選干細(xì)胞抑制劑(例如MIP-1α、TGFβ和各種寡肽)的區(qū)別在于，在短期預(yù)溫育后的體外檢測(cè)中達(dá)到抑制的能力(參見(jiàn)實(shí)施例5)。
本發(fā)明亦包括含有INPROL以治療各種疾病的藥用組合物。
本發(fā)明提供通過(guò)給予受治療者有效量的干細(xì)胞抑制組合物治療預(yù)期暴露下能夠殺死或損傷干細(xì)胞的藥物的該受治療者的方法。通過(guò)該方法保護(hù)的干細(xì)胞可以是通常在骨髓、臍帶血、胎肝中存在并在其中分裂的或動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)的造血干細(xì)胞。盡管根據(jù)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析大多數(shù)動(dòng)員的干細(xì)胞是靜止的，但證實(shí)多能干細(xì)胞是循環(huán)的并可以被干細(xì)胞抑制量的INPROL抑制。另一方面，干細(xì)胞可以是上皮的，例如位于腸或頭皮或身體的其它區(qū)域，或者是位于生殖器官內(nèi)的生殖細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以合乎需要地用于人類，雖然該方法亦包括動(dòng)物治療。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“受治療者”或“患者”指諸如包括人類的哺乳動(dòng)物的動(dòng)物。
本發(fā)明提供通過(guò)給予受治療者有效量的干細(xì)胞刺激組合物治療具有低增殖干細(xì)胞的該受治療者的方法。通過(guò)該方法刺激的干細(xì)胞可以是通常存在于骨髓、臍帶血、胎肝或動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)的造血干細(xì)胞；這種干細(xì)胞可以預(yù)先已用干細(xì)胞抑制有效量的INPROL置于靜止?fàn)顟B(tài)。干細(xì)胞刺激有效量的INPROL將在需要時(shí)(例如在為用于活體外擴(kuò)增、或體內(nèi)用于干細(xì)胞移植和移入后而收獲干細(xì)胞之后)刺激干細(xì)胞循環(huán)。或者，干細(xì)胞可以是上皮的，例如位于腸或頭皮或身體的其它區(qū)域，或者是位于生殖器官內(nèi)的生殖細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明提供保護(hù)和恢復(fù)正在進(jìn)行化療的患者的造血、免疫或其它干細(xì)胞系統(tǒng)的方法，它包括給予該患者干細(xì)胞抑制有效量的INPROL和/或通過(guò)給予干細(xì)胞刺激有效量的INPROL在化療或放療之后刺激恢復(fù)。
在再一方面，本發(fā)明涉及一個(gè)方法，即通過(guò)給予患有癌癥的患者干細(xì)胞抑制有效量的INPROL以保護(hù)骨髓、胃腸道或其它器官的干細(xì)胞免受化療或放療的毒性作用和/或通過(guò)給予干細(xì)胞刺激量的INPROL在化療或放療之后刺激恢復(fù)而輔助治療任何癌癥，包括那些以實(shí)體瘤為特征的癌癥(例如乳腺、結(jié)腸、肺、睪丸、卵巢、肝臟、腎臟、胰臟、大腦、肉瘤)。
本發(fā)明的又一方面涉及治療白血病(例如慢性髓細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、骨髓瘤、霍奇森病)，包括用有效量的INPROL處理其中含有增殖性白血病細(xì)胞的造血細(xì)胞以抑制正常干細(xì)胞增殖，并用細(xì)胞毒性藥物處理該骨髓以消滅白血病細(xì)胞。該方法可以通過(guò)接著用其它刺激其增殖的藥物處理該骨髓而加強(qiáng)；例如，干細(xì)胞刺激量的集落刺激因子和/或INPROL。在一個(gè)實(shí)施方案中于體內(nèi)進(jìn)行該方法。或者，該方法亦可用于活體外用于移植的造血細(xì)胞的凈化和擴(kuò)增。
在再一方面，該方法涉及治療具有由增殖干細(xì)胞引起的任何紊亂的受治療者。通過(guò)給予該受治療者有效量的INPROL以抑制或刺激上述干細(xì)胞的增殖，治療這類紊亂，例如牛皮癬、骨髓發(fā)育不良、一些自身免疫病、衰老中的免疫抑制、脊髓發(fā)育不良綜合癥、再生障礙性貧血或AIDS中的干細(xì)胞耗盡。
本發(fā)明提供可逆地保護(hù)干細(xì)胞免受能夠殺傷或損害干細(xì)胞的細(xì)胞毒性藥物損傷的方法。該方法涉及給予預(yù)期暴露給這種藥物的受治療者有效干細(xì)胞抑制量的INPROL。
本發(fā)明亦提供在放療或放療后的恢復(fù)期可逆地刺激干細(xì)胞增殖的方法。該方法涉及給予預(yù)期暴露給這種藥物的受治療者有效干細(xì)胞刺激量的INPROL。
本發(fā)明亦提供通過(guò)以下程序從豬或其它骨髓分離的干細(xì)胞增殖抑制劑(參見(jiàn)實(shí)施例12)
(a)提取骨髓并通過(guò)過(guò)濾除去顆粒物質(zhì)，(b)于56℃熱處理40分鐘，接著在冰浴中冷卻，(c)通過(guò)于4℃、10,000g離心30分鐘除去沉淀，(d)通過(guò)向含有1％(體積)濃鹽酸的10倍(體積)攪拌冰凍丙酮中加入上清液，并于4℃溫育16小時(shí)進(jìn)行酸沉淀，(e)通過(guò)于4℃、20,000g離心30分鐘分離沉淀物并用冷丙酮清洗，接著干燥，(f)通過(guò)反相層析分離，并通過(guò)抑制用5-氟尿嘧啶預(yù)處理并在鼠IL-3的存在下溫育的骨髓細(xì)胞的集落形成、以及通過(guò)280nm吸收和通過(guò)SDS-PAGE監(jiān)測(cè)活性。
本發(fā)明亦提供包括前述步驟的基本不含其它蛋白材料的干細(xì)胞增殖抑制劑的純化方法，以下有更詳細(xì)的描述。
本發(fā)明亦提供治療人類或動(dòng)物的方法，其中干細(xì)胞增殖抑制劑用來(lái)改進(jìn)由干細(xì)胞高增殖引起的免疫抑制。
本發(fā)明亦提供治療人類或動(dòng)物的方法，其中干細(xì)胞刺激量的INPROL改進(jìn)由干細(xì)胞低增殖引起的骨髓抑制。
本發(fā)明亦提供治療人類或動(dòng)物的方法，其中在所述干細(xì)胞通過(guò)暴露給細(xì)胞毒性藥物或輻射程序誘導(dǎo)增殖后給予所述干細(xì)胞增殖抑制劑。干細(xì)胞通常為靜止的，但在化療后被刺激進(jìn)入細(xì)胞周期。這使得它們對(duì)第二次化療給藥更加敏感；本方法保護(hù)它們抵抗這種處理。
本發(fā)明亦提供治療人類或動(dòng)物的方法，其中在給予干細(xì)胞抑制量的INPROL之前或之后，給予干細(xì)胞增殖刺激劑(例如干細(xì)胞刺激量的INPROL)以促進(jìn)骨髓再生。干細(xì)胞抑制量的INPROL減慢干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期的速率并保護(hù)對(duì)抗化療或放射；干細(xì)胞刺激量的INPROL逆轉(zhuǎn)該抑制并促進(jìn)骨髓恢復(fù)。相反地，可以用干細(xì)胞刺激量的INPROL促進(jìn)骨髓恢復(fù)，而一旦達(dá)到骨髓恢復(fù)就接著用干細(xì)胞抑制量的INPROL將干細(xì)胞回復(fù)至靜止。
本發(fā)明亦提供治療人類或動(dòng)物的方法，其中將所述干細(xì)胞增殖抑制劑做為佐劑在為提高免疫應(yīng)答的疫苗接種之前或同時(shí)給予。
本發(fā)明亦提供治療哺乳動(dòng)物中免疫缺陷的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物免疫刺激量的INPROL。
本發(fā)明亦提供治療哺乳動(dòng)物中疼痛的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)痛覺(jué)缺失量的INPROL。
本發(fā)明亦提供治療接受細(xì)胞毒性藥物或放射治療的人類或動(dòng)物的方法，它包括給予有效量的干細(xì)胞增殖抑制劑以保護(hù)干細(xì)胞免受損傷。
本發(fā)明亦提供治療接受細(xì)胞毒性藥物或放射治療的人類或動(dòng)物的方法，它包括給予有效干細(xì)胞刺激量的INPROL以增強(qiáng)治療后的恢復(fù)。
本發(fā)明亦包括包含血紅蛋白和藥學(xué)上可接受載體的藥用組合物。
本發(fā)明亦包括藥用組合物，它包含(a)一多肽鏈，選自由血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈和血紅蛋白ζ鏈、包含人α血紅蛋白鏈的第1-97氨基酸的多肽鏈(“肽1-97”)和包含人α血紅蛋白鏈的第1-94氨基酸的多肽鏈(“肽1-94”)組成的組和(b)一藥學(xué)上可接受載體。這種藥用組合物可以包含選自所述組的單個(gè)多肽、選自所述組的多肽混合物或以二聚體或多體形式存在的選自所述組的多肽以及含或不含血紅素。
本發(fā)明亦包括具有以下序列的肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val(“肽43-45”)，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys其中這二個(gè)Cys殘基形成二硫鍵(“環(huán)肽43-45”)，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys其中這二個(gè)Cys殘基通過(guò)碳橋連接，Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala(“肽64-82”)，和包含如圖16A中的人α血紅蛋白的前97個(gè)N末端氨基酸的肽。
本發(fā)明亦包括由保持干細(xì)胞抑制和/或刺激性能的人α鏈的修飾形式組成的蛋白和肽序列。這種修飾包括但不限于C末端疏水域的去除或修飾(導(dǎo)致溶解特性改進(jìn))和/或觸珠蛋白結(jié)合域的去除或修飾(導(dǎo)致藥物動(dòng)力學(xué)特性改進(jìn))。人α血紅蛋白中的C末端疏水域包含從氨基酸98(苯丙氨酸)至141(精氨酸)的區(qū)域，并含有總共44個(gè)氨基酸中的23個(gè)疏水氨基酸。該整個(gè)域或一個(gè)或多個(gè)這些疏水氨基酸(6個(gè)丙氨酸、4個(gè)纈氨酸、8個(gè)亮氨酸、2個(gè)脯氨酸和3個(gè)苯丙氨酸)可以通過(guò)缺失除去(“缺失的”C末端疏水域)?；蛘撸粋€(gè)或多個(gè)這些氨基酸可以被非極性氨基酸(例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)置換(“置換的”C末端疏水域)。
在另一實(shí)施方案中，使用諸如羧甲基化的化學(xué)修飾，這降低該區(qū)的疏水性特征和增加溶解度。
在另一實(shí)施方案中，用人β血紅蛋白序列的對(duì)應(yīng)親水區(qū)置換疏水殘基。例如，在人β血紅蛋白序列中，氨基酸107(甘氨酸)至117(組氨酸)之間的區(qū)或氨基酸130(酪氨酸)至139(天冬酰胺)之間的區(qū)都是相對(duì)親水性的，每個(gè)或二者都可以置換人α血紅蛋白中相當(dāng)?shù)氖杷詤^(qū)。
結(jié)合蛋白結(jié)合域包含于C末端疏水性區(qū)之內(nèi)，并由氨基酸121-127組成。該區(qū)可以通過(guò)缺失全部除去，或該區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以缺失(“缺失的”C末端結(jié)合蛋白結(jié)合域)。該區(qū)或該區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用諸如多聚丙氨酸或多聚甘氨酸或具有該多肽與結(jié)合蛋白結(jié)合但保持干細(xì)胞抑制活性的作用的其它氨基酸置換(“置換的”C末端結(jié)合蛋白結(jié)合域)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括對(duì)應(yīng)于β血紅蛋白鏈(或者在C末端疏水區(qū)內(nèi)和/或在一或二個(gè)結(jié)合蛋白結(jié)合域(氨基酸11-25和氨基酸136-146)內(nèi))的修飾，和對(duì)應(yīng)于所述δ、γ、ε和/或ζ血紅蛋白鏈的修飾。
本發(fā)明亦包括編碼上述鑒別的肽的DNA序列、含有所述DNA序列的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。這些肽可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)(例如固相合成)或通過(guò)使用重組技術(shù)(包括諸如那些使用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(D.B.Smith和K.S.Johnson，Gene 6731-40，1988)、硫氧還蛋白(LaVallie等，Biotechnology 11187-193，1993)或遍在蛋白(Butt等，PNAS862540-4，1989；Chemey等，Biochem.3010420-7，1991；Baker等，JBC26925381-6，1994；美國(guó)專利5,132,213；5,196,321和5,391,490和PCTWO 91/17245)的融合系統(tǒng))合成。每個(gè)這些文章、申請(qǐng)和專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明另外包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以結(jié)合阿片制劑受體(最好為μ亞類阿片制劑受體)的化合物接觸造血細(xì)胞。本發(fā)明另外包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以結(jié)合傷害感受肽受體(例如ORL1)的化合物接觸造血細(xì)胞。另外，本發(fā)明包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以接觸“阿片制劑樣”受體的化合物接觸造血細(xì)胞。
已從血紅蛋白分離出表現(xiàn)阿片制劑活性的肽(稱為“hemorphins”)(例如Brantl等，Eur.J.Pharm，125309-10，1986；Davis等，Peptides 10747-51，1989；Hoffman等，PNAS 878521-25，1990；Hernan等，Biochem.3 18619-28，1992；Karelin等，Bioch.Biophys.Res.Comm，202410-5，1994；Zhao等，Ann.N.Y.Acad.Science 750452-8，1995；Petrov等，Bioscience Reports，151-14，1995；Karelin等，Peptides 16693-697，1995)。每個(gè)這些文章通過(guò)引用結(jié)合到本文中。亦存在其它非典型阿片制劑肽和小分子(Zioudrou等，JBC 2542446-9，1979；Quirion和Weiss，Peptides 4445，1983；Loukas等，Biochem.224567，1983；Brantl，Eur.J.Pharm.106213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.111293-4，1985；Brantl和Neubert，TIPS 76-7，1986；Hmby和Gehrig，Med.Res.Rev.9343-401，1989；Schiller，Prog.Med.Chem.28301-40，1991；Glamsta等，BBRC 1841060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104499-28，1993；Handbook of Experimental Pharmacology，A.Hertz(編輯)第104/I和104/II卷，1993，Spinger Verlag，Berlin；Reed等，Neurosci.andBiobehav.Rev.18519-25，1994；Karelin等，Peptides 16693-7，1995)。每個(gè)這些文章通過(guò)引用結(jié)合到本文中。通過(guò)其結(jié)合阿片制劑、INPROL、hemorphin、外啡肽、傷害感受肽、Tyr-MIF-1家族成員、生物堿和/或其它以通過(guò)包含適量納洛酮方式拮抗的或者抑制或者刺激于細(xì)胞增殖的化合物的能力，定義本文使用的“阿片制劑樣受體”(參見(jiàn)實(shí)施例29和38)。
另外，本發(fā)明包括鑒別受體和配體的方法，包括在受體結(jié)合檢測(cè)中使用INPROL(最好為諸如肽1-94、1-97、43-55或64-82的肽形式)。另外，本發(fā)明包括鑒別受體和配體的方法，包括在腺苷酸環(huán)化酶檢測(cè)中使用INPROL。
本發(fā)明另外包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以激活最好是G抑制亞型的那些GTP結(jié)合蛋白的化合物(例如肥大細(xì)胞脫粒肽)接觸造血細(xì)胞。
本發(fā)明亦包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用選自具有以下序列的hemorphin肽組的肽接觸造血細(xì)胞Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，
Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr.
上述肽具有與其它非典型阿片制劑肽的序列類似性和/或與其類似的生物學(xué)活性，這些非典型阿片制劑肽諸如Tyr-MIF-1家族(綜述參見(jiàn)Reed等，Neurosci.Biobehav.Rev.18519-25，1994)、酪蛋白源性casomorphins(Brantl等，Hoppe-Seyler的Z.Physiol.Chem.3601211-16，1979；Loukas等，Biochem.224567-4573，1983；Fiat和Jolles，Mol.Cell.Biochem.875-30，1989)、得自稱為cytochrophins的細(xì)胞色素b的肽(Brantl等，Eur.J.Pharm.111293-4，1985)、各種來(lái)自人類或非人類物種的外啡肽和阿片制劑肽(Zioudrou等，JBC 2542446-9，1979；Brantl，Eur.J.Pharm.106213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.125309-10，1986；Brantl和Neubert，TIPS 76-7，1986；Glamsta等，BBRC 1841060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104499-28，1993；Karelin等，Peptides 16693-7，1995)以及源自篩選結(jié)合阿片制劑受體的組合文庫(kù)的肽(綜述參見(jiàn)Dooley等，Peptide Research 8124-137，1995)的那些非典型阿片制劑肽。每個(gè)這些文章通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明亦包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用選自Tyr-MIF-1相關(guān)肽、casomorphins、cytochrophins和外啡肽的一種肽接觸造血細(xì)胞。特別包括的是具有以下序列的Tyr-MIF-1肽Tyr-Pro-Try-Gly-NH2，Tyr-Pro-Lys-Gly-NH2，Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2，和Pro-Leu-Gly-NH2
本發(fā)明亦包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用選自以下阿片制劑肽接觸造血細(xì)胞(D-Ala2，N-Me-Phe4，谷氨?；?)-腦啡肽 (DAMGO)(D-Arg2，Lys4)-皮啡肽-(1-4)-酰胺 (DALDA)(Phe4)-皮啡肽(Dermorphine)(1-4)酰胺Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Arg-NH2，Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Lys-NH2，和H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Val-NH2。
本發(fā)明亦提供抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用選自嗎啡、可待因、美沙酮、海洛因、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、羥甲左嗎喃、氫可酮、雙氫可待因、羥考酮、氫嗎啡酮、丙氧芬、丁丙諾啡、埃托啡、羥氫嗎啡酮右旋丙氧吩(dextopropoxyphene)和甲氮_酚的阿片制劑激動(dòng)劑化合物接觸造血細(xì)胞。特別包括地是抑制量小于10-7摩爾的嗎啡。
本發(fā)明亦包括抑制或刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用選自納洛酮、納曲酮、烯丙嗎啡、噴他佐辛、納布啡和環(huán)丁羥嗎喃的阿片制劑拮抗劑或混合激動(dòng)劑/拮抗劑接觸造血細(xì)胞。特別包括的是抑制量小于10-8摩爾的納洛酮。
本發(fā)明亦包括刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用干細(xì)胞刺激量的選自INPROL、肌紅蛋白、DAMGO和DALDA的蛋白或肽接觸造血細(xì)胞。
本發(fā)明亦包括在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行基因治療的方法，包括a)從所述哺乳動(dòng)物取出造血細(xì)胞，b)在活體外用干細(xì)胞刺激量的INPROL和/或阿片制劑化合物處理所述造血細(xì)胞，c)用預(yù)先確定的基因轉(zhuǎn)染或感染所述造血細(xì)胞，d)在活體外用干細(xì)胞抑制量的INPROL和/或阿片制劑化合物接觸所述轉(zhuǎn)染的造血細(xì)胞，
e)將步驟d的造血細(xì)胞移植入所述哺乳動(dòng)物f)可選地在體內(nèi)用干細(xì)胞抑制或刺激量的INPROL和/或阿片制劑化合物處理所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明亦包括進(jìn)行活體外干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，包括用干細(xì)胞抑制量的INPROL和至少一種刺激性細(xì)胞因子處理所述造血細(xì)胞。在用該刺激性細(xì)胞因子接觸之前、之中和/或之后，將INPROL與該造血細(xì)胞接觸?；铙w外干細(xì)胞擴(kuò)增使得可以從諸如臍帶血、胎肝、化療后等或純化后(例如通過(guò)使用諸如CD34、CD38或若丹明的熒光激活細(xì)胞分選)的自體骨髓的有限來(lái)源產(chǎn)生足夠量的干細(xì)胞。選擇性生長(zhǎng)特定造血譜系的能力也使得臨床醫(yī)生根據(jù)個(gè)別患者的需要特異性地設(shè)計(jì)干細(xì)胞移植物。
本發(fā)明亦包括進(jìn)行活體外干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，包括用干細(xì)胞刺激量的INPROL在有或無(wú)至少一種其它刺激性細(xì)胞因子的情況下處理造血細(xì)胞。在用所述刺激性細(xì)胞因子接觸之前、之中和/或之后，將INPROL與所述造血細(xì)胞接觸。在活體外，干細(xì)胞刺激劑使得干細(xì)胞和/或祖代擴(kuò)增而干細(xì)胞抑制劑使得干細(xì)胞保持在其未分化狀態(tài)。亦可通過(guò)在體內(nèi)使用干細(xì)胞抑制量的INPROL以保持干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)直至將其移入而優(yōu)化該程序，之后可以使用干細(xì)胞刺激量的INPROL刺激骨髓再生?？蛇x地，可以將造血細(xì)胞分成二種制備物，一種用干細(xì)胞刺激量的INPROL處理以促進(jìn)干細(xì)胞和/或祖代擴(kuò)增，而另一種用干細(xì)胞抑制量的INPRO處理以保持干細(xì)胞處于其未分化狀態(tài)。然后可以將這二種制制備物合并并輸入患者。
本發(fā)明亦包括藥用組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽焦Glu-Glu-Asp-Cys-Lys、四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)的抑制化合物。
本發(fā)明亦包括藥用組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子、δ樣蛋白和flk2/flt3配體的刺激性細(xì)胞因子。
本發(fā)明描述了一種干細(xì)胞抑制劑(INPROL)，它不同于本領(lǐng)域已知的其它抑制劑，例如MIP-1α、TGFβ、Frindel和同事的四肽或Paukovits和同事的五肽(參看Wright和Pragnell，1992(在所引的書(shū)中))。自然發(fā)生的天然INPROL的分子量通過(guò)超濾測(cè)定超過(guò)10,000道爾頓，該分子量使其區(qū)別于所述四肽以及所述五肽。它在反相層析系統(tǒng)中比MIP-1α或TGFβ的更具疏水性，使其與這些細(xì)胞因子區(qū)別。另外，它的作用方式不同于任何以前描述的抑制劑，在于當(dāng)它僅用于預(yù)溫育期時(shí)在一個(gè)體外檢測(cè)中有活性。例如MIP-1α僅用于預(yù)溫育期時(shí)不是有效的(實(shí)施例5)。另外，自然發(fā)生INPROL在測(cè)定“高增殖潛力細(xì)胞”(HPP-PFC)的檢測(cè)中有活性，而MIP-1α則無(wú)(實(shí)施例6)。INPROL與本領(lǐng)域已知的那些刺激劑不同，所述刺激劑例如為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子和flk2/flt3配體。自然發(fā)生的INPROL與這些細(xì)胞因子幾乎沒(méi)有或沒(méi)有序列相似性。
附圖簡(jiǎn)述圖1-4顯示純化各階段后產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖1-泳道1是糜蛋白酶原，泳道2是卵清蛋白，泳道3是BSA，泳道4是小于30kD的部分，泳道5是30-50kD部分，泳道6是50-100kD部分。
圖2-泳道1是硫酸銨沉淀(40-80％)后，泳道2-5是DEAE部分(泳道#2代表所述活性部分)。
圖3-泳道1是硫酸銨沉淀后的上清液，泳道2是所述活性DEAE部分，泳道3-5代表凝膠過(guò)濾部分(泳道#5代表所述活性部分)
圖4-泳道2代表終產(chǎn)物。
圖5顯示最終純化的反相HPLC層析圖譜。
圖6顯示在無(wú)(對(duì)照＝0％抑制)和有各種量的從豬骨髓純化的INPROL(pINPROL)的情況下氚標(biāo)記的胸苷摻入(cpm)FDCP-mix系的細(xì)胞。根據(jù)對(duì)照值將數(shù)據(jù)歸一化。
圖7顯示在用丙酸睪酮(TSP)、TSP加pINPROL、或載體(對(duì)照)處理小鼠后在細(xì)胞周期的S期的細(xì)胞百分比。每組含有25只動(dòng)物(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3-4只)。
圖8顯示在用或不用pINPROL處理的情況下，用二個(gè)劑量5-FU處理的小鼠的存活情況。每個(gè)組含有30只動(dòng)物。
圖9顯示在用或不用pINPROL處理的情況下輻射小鼠的存活。每個(gè)組含有50只動(dòng)物。
圖10A和10B顯示用Ara-C或Ara-C加pINPROL處理后1周(10A)和3周(10B)時(shí)正常骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的再生。
圖11顯示在致死輻射和用與培養(yǎng)基(對(duì)照)或pINPROL(25ng/ml)預(yù)溫育4小時(shí)后的3×104骨髓細(xì)胞移植后小鼠(每組75只)的存活。監(jiān)測(cè)存活30天。
圖12顯示培養(yǎng)14天后由致死輻射和用pINPROL或培養(yǎng)基預(yù)溫育4小時(shí)的供體骨髓細(xì)胞恢復(fù)的小鼠骨髓細(xì)胞形成的CFU-GM數(shù)量。
圖13顯示來(lái)自淋巴長(zhǎng)期培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞，將其每周取出、清洗并在與培養(yǎng)基或pINPROL預(yù)溫育4小時(shí)后與IL-7(10ng/ml)鋪平板。
圖14顯示用pINPROL處理的白血病外周血細(xì)胞的改進(jìn)的種群恢復(fù)能力。通過(guò)有和無(wú)pINPROL的情況下鋪平板粘連和非粘連LTC細(xì)胞并在第7天計(jì)數(shù)CFU-GM，測(cè)定長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)。根據(jù)對(duì)照值將數(shù)據(jù)歸一化。
圖15A顯示于53％乙腈洗脫的純化pINPROL的C4反相層析圖譜。泳道1是粗材料，泳道2是分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物而泳道3是純化材料。圖15B顯示于43.9％乙腈洗脫的MIP-1α的C4反相層析圖譜。圖15C顯示粗pINPROL制備物和反相層析后的純化制備物的SDS-PAGE層析圖譜。
圖16顯示血紅蛋白序列圖16A顯示人α血紅蛋白的cDNA序列和氨基酸序列，圖16B顯示人β血紅蛋白的cDNA序列和氨基酸序列。編號(hào)系按照所述氨基酸。圖16C顯示人、鼠和豬血紅蛋白的α和β鏈的氨基酸序列比較。
圖17顯示pINPROL(圖17A)和結(jié)晶豬血紅蛋白(圖17B)的C4反相HPLC描圖比較。
圖18顯示結(jié)晶豬血紅蛋白C4反相HPLC分離部分的SDS-PAGE凝膠。泳道1顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道2顯示源自第一峰(于47.11分鐘)的部分48-49，泳道3顯示源自第二峰(于49.153分鐘)的部分50-51，泳道4顯示源自第三峰(于52.25分鐘)的部分54-55，泳道5顯示源自第四峰(于53.613分鐘)的部分56-57。
圖19顯示pINPROL(圖19A)和純化豬β血紅蛋白(圖19B)的雙向凝膠電泳比較。
圖20顯示純化豬α血紅蛋白、β血紅蛋白或pINPROL在FDCP-MIX檢測(cè)中的效果比較。
圖21顯示用小洗脫梯度反相分離豬血紅蛋白。
圖22A顯示Hochuli等(1988)的質(zhì)粒；圖22B顯示Loetscher等(1991)的質(zhì)粒；圖22C顯示pDSUb質(zhì)粒。
圖23顯示在圓石檢測(cè)(cobblestone assay)中用INPROL處理的結(jié)果。
為更完全地理解本文描述的本發(fā)明，提出來(lái)以下詳細(xì)描述。該描述做為本發(fā)明的實(shí)例，不應(yīng)理解為具體限制本發(fā)明，并且認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員視野內(nèi)的那些變化在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
推薦實(shí)施方案詳述INPROL可逆地抑制或刺激干細(xì)胞分裂。雖然不愿受制于特定的理論，但認(rèn)為干細(xì)胞抑制劑和刺激劑通過(guò)影響干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期的速率施加其作用。具體地說(shuō)，根據(jù)使用的量，INPROL在暫時(shí)性地抑制或刺激造血干細(xì)胞細(xì)胞分裂中有效。臨床上使用可以抑制或刺激干細(xì)胞增殖的化合物的能力使得可以在例如化療、干細(xì)胞移植或基因治療方案中精巧地控制造血干細(xì)胞的循環(huán)。因此，可以使用本發(fā)明的方法通過(guò)保護(hù)干細(xì)胞免受由用于消滅癌癥或病毒感染細(xì)胞的化療藥物或放射引起的損傷或通過(guò)刺激這種損傷后的恢復(fù)，而減輕化療對(duì)患者的造血、骨髓和免疫系統(tǒng)的不良副作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將INPROL以足以抑制干細(xì)胞分裂的劑量給予患者，同時(shí)化療藥物作用于病態(tài)細(xì)胞。在化療藥物執(zhí)行其功能后，被INPROL抑制的干細(xì)胞不需另外處理而回復(fù)為分裂中的細(xì)胞。如欲增強(qiáng)血細(xì)胞發(fā)生的再生，可以附加使用刺激性生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或干細(xì)胞刺激量的INPROL。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“INPROL”包括如在實(shí)施例中純化的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白α鏈(有或無(wú)血紅素基團(tuán))、血紅蛋白β鏈(有或無(wú)血紅素基團(tuán))、α鏈和β鏈(有或無(wú)血紅素基團(tuán))的混合物、具有抑制和/或刺激干細(xì)胞增殖的能力的包括胚胎、胎兒或成人形式(例如α、β、γ、δ、ε或ζ鏈，或者單獨(dú)或者做為混合物，二聚體或多聚體，有或無(wú)血紅素基團(tuán))的這些蛋白的片段或類似物。術(shù)語(yǔ)“INPROL”包括這些蛋白的自然發(fā)生以及非自然發(fā)生(例如重組和/或合成產(chǎn)生)形式。術(shù)語(yǔ)“INPROL多肽”指由40個(gè)或更多氨基酸組成的INPROL。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“阿片制劑化合物”是包括阿片制劑但不包括INPROL的化合物，它與阿片制劑受體(或與阿片制劑受體有序列相關(guān)性的受體，例如ORL1)結(jié)合并施加或者激動(dòng)劑、拮抗劑或混合激動(dòng)劑/拮抗劑活性。例如，存在μ受體(由DAMGO和DALDA選擇性地激活，并被CTOP和naloxonazine選擇性地拮抗)、κ受體(由GR 89696延胡索酸或U-69593選擇性地激活，并被鹽酸nor-bianltrophimine選擇性地拮抗)和δ受體(由DADLE和DPDPE選擇性地激活，并被natrindole選擇性地拮抗)的特異性激動(dòng)劑和拮抗劑。另外，有作用于所有這三種受體亞型的廣譜拮抗劑(例如納洛酮)和激動(dòng)劑(例如埃托啡)。傷害感受肽特異性地激動(dòng)ORL1受體。具有干細(xì)胞刺激和或抑制活性的阿片制劑化合物可以用于本文描述的INPROL的每個(gè)應(yīng)用。
本文使用的“干細(xì)胞刺激量”是誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖的量。本文使用的“干細(xì)胞抑制量”是抑制干細(xì)胞增殖的量。在體內(nèi)和活體外的所有情況下，所選擇的量取決于所選擇的特定INPROL或阿片制劑化合物和特定條件或應(yīng)用；特別是，等摩爾劑量的INPROL多肽或片段的活性與等摩爾阿片制劑肽或小分子的活性相同。
在欲抑制干細(xì)胞的典型臨床情況下，以每日制度在標(biāo)準(zhǔn)化療或放射治療前4-60小時(shí)，當(dāng)需要抑制干細(xì)胞循環(huán)時(shí)，使用例如0.01-100mg/kg、最好為0.1-1.0mg/kg給予的INPROL，以劑量單位形式通過(guò)靜脈注射或輸注將INPROL給予患者。
在需要刺激干細(xì)胞循環(huán)的情況下，例如化療或放射后促進(jìn)恢復(fù)的情況下，使用干細(xì)胞刺激量的INPROL。這種劑量通常為1-500mg/kg，最好為10mg至100mg/kg。
在需要使用阿片制劑化合物抑制或刺激干細(xì)胞循環(huán)的情況下，使用與INPROL所描述的等摩爾濃度的阿片制劑化合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用干細(xì)胞抑制量的INPROL預(yù)處理允許化療藥物或放射的劑量增加超過(guò)患者正常耐受的劑量。類似地，用干細(xì)胞刺激量的INPROL在化療或放射后處理亦允許增加化療或放射的正常耐受劑量。
造血干細(xì)胞的大部分通常為靜止的(緩慢或不循環(huán))。然而，做為對(duì)化療誘導(dǎo)的造血損傷的補(bǔ)償性應(yīng)答，化療后大部分干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，這使得它們特別易受后續(xù)劑量的細(xì)胞毒性化療或治療輻射的攻擊。通過(guò)抑制這種干細(xì)胞的循環(huán)，INPROL處理允許或者在常規(guī)或者提高劑量下提早或更頻密地給予后續(xù)劑量的細(xì)胞毒性化療。
一些正常個(gè)體具有自動(dòng)快速循環(huán)的干細(xì)胞；干細(xì)胞抑制量的INPROL可以用于這種個(gè)體，甚至在第一次劑量的放射或化療之前給予。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在化療的初始劑量后約24小時(shí)至10天時(shí)給予INPROL(0.1mg至6gm/kg體重-最好為1.0-60mg/kg)。再4-60小時(shí)后，最好為24-48小時(shí)后，給予另一化療劑量。按照治療利益繼續(xù)所述交替的化療和INPROL的循環(huán)。按照標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐中特定腫瘤類型的適合性，選擇化療藥物和給藥方案?？蛇x地，在化療或放射治療后使用諸如G-CSF、干細(xì)胞因子或干細(xì)胞刺激量的INPROL的刺激性生長(zhǎng)因子以進(jìn)一步改善造血重建。
對(duì)于活體外應(yīng)用，當(dāng)需要抑制干細(xì)胞增殖時(shí)，使用0.1ng至100ng/106細(xì)胞/ml、最好為2-50ng/106細(xì)胞/ml的INPROL。對(duì)于需要刺激干細(xì)胞的情況，使用10 ng-100μg/106細(xì)胞/ml、最好為1-100μg/106細(xì)胞/ml的INPROL。
在需要使用阿片制劑化合物抑制或刺激干細(xì)胞循環(huán)的情況下，使用與INPROL所描述的等摩爾濃度的阿片制劑化合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將INPROL用于制備供移植的自體造血細(xì)胞的方法中。用有效量的INPROL在活體外處理造血細(xì)胞以抑制干細(xì)胞分裂，然后通過(guò)給予該骨髓培養(yǎng)物有效量的化療藥物或放射清除癌細(xì)胞。最好是對(duì)循環(huán)細(xì)胞具特異性的化療藥物。將如此處理的骨髓再注射入所述自體供體。可選地，用干細(xì)胞刺激量的INPROL和/或已知刺激血細(xì)胞生成的另一藥物治療該患者，以改善該患者的造血重建。這種技術(shù)使得在自體骨髓移植期間有效地清除腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保護(hù)造血干細(xì)胞?？梢砸曰铙w外或體內(nèi)凈化方案提供這種保護(hù)。一旦移植成功，則需要干細(xì)胞快速增殖以再生正常骨髓功能?？梢酝ㄟ^(guò)使用刺激干細(xì)胞循環(huán)并增強(qiáng)骨髓功能恢復(fù)的干細(xì)胞刺激量的INPROL提供這種快速增殖。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將INPROL用于制備供基因治療的造血細(xì)胞的方法中。用干細(xì)胞刺激量的INPROL和/或其它刺激性細(xì)胞因子在活體外處理造血細(xì)胞以刺激細(xì)胞分裂，然后用目的基因轉(zhuǎn)染(最好用例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染)。完成轉(zhuǎn)染后，清洗細(xì)胞并用干細(xì)胞抑制量的INPROL處理，以使干細(xì)胞回復(fù)靜止。將如此處理的骨髓再注射入該供體。可選地，用干細(xì)胞抑制量的INPROL在體內(nèi)處理患者，以保持干細(xì)胞處于其靜止形式并增強(qiáng)其骨髓種群恢復(fù)能力。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將INPROL做為白血病治療中的輔助治療使用。例如，在白血病細(xì)胞不應(yīng)答INPROL的疾病狀態(tài)中，用干細(xì)胞抑制量的INPROL活體外處理所述造血細(xì)胞。通過(guò)給予INPROL防止正常干細(xì)胞的增殖。因此，在增殖中的白血病細(xì)胞用細(xì)胞周期特異性細(xì)胞毒性藥物處理期間，正常干細(xì)胞群體受保護(hù)免受損傷。另外，可選地給予諸如IL-3、GM-CSF的刺激性細(xì)胞因子，以在藥物或放射治療期間誘導(dǎo)白血病細(xì)胞循環(huán)，而正常干細(xì)胞則用INPROL保護(hù)。該患者用化療藥物或放射治療以消滅白血病細(xì)胞，然后將凈化的骨髓移植回該患者以建立造血重建。
類似地，在治療涉及血液細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重病毒感染(例如HIV感染)的病人的本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用INPROL并接著用病毒物、消滅感染細(xì)胞的抗藥物或除去感染細(xì)胞的基于抗體的系統(tǒng)，在活體外或體內(nèi)處理造血細(xì)胞。在重度骨髓抑制(myeloablative)抗病毒或重度骨髓抑制化療從該患者消滅病毒宿主細(xì)胞后，將INPROL處理的骨髓細(xì)胞輸回該患者。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用INPROL治療涉及高增殖性干細(xì)胞的疾病。例如，牛皮癬是由皮膚高增殖性上皮細(xì)胞引起的疾病，有時(shí)用細(xì)胞毒性藥物治療。其它其中涉及干細(xì)胞增殖的前瘤形成損害亦屈服于有效量的用于抑制干細(xì)胞增殖的INPROL?；加蝎@得性免疫缺陷綜合癥的患者具有導(dǎo)致干細(xì)胞耗盡的異常高的干細(xì)胞循環(huán)速率；這些患者亦可從用抑制干細(xì)胞循環(huán)的有效量的INPROL治療獲益。對(duì)于這些用途，適合時(shí)使用表面或透皮傳遞組合物(例如軟膏、洗劑、凝膠或膏藥)做為非腸道給藥的替代。
在大多數(shù)白血病情況下，白血病祖代是分化的細(xì)胞群，它們不受INPROL影響，因此可以通過(guò)諸如上述使用INPROL的方法治療。在白血病祖代非常原始并對(duì)INPROL抑制直接敏感的情況下，通過(guò)給予有效量的INPROL減弱白血病細(xì)胞的增殖。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，使用INPROL治療與低增殖性干細(xì)胞相關(guān)的疾病。例如，骨髓發(fā)育不良綜合癥和再生障礙性貧血是由骨髓低增殖性干細(xì)胞引起的疾病。其它涉及干細(xì)胞低增殖的綜合癥可以使用干細(xì)胞刺激量的INPROL治療。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)開(kāi)發(fā)針對(duì)INPROL肽或多肽的單克隆或多克隆抗體。用許多本領(lǐng)域已知類型的可檢測(cè)標(biāo)記標(biāo)記這些抗體或INPROL肽或多肽。然后將該標(biāo)記INPROL或抗INPROL抗體用做干細(xì)胞標(biāo)記，通過(guò)直接將其給予患者做診斷目的以鑒別和分離干細(xì)胞?；蛘撸诨铙w外使用這些標(biāo)記肽、多肽或抗體鑒別造血細(xì)胞制備物中的干細(xì)胞，以在骨髓中清除瘤形成細(xì)胞之前將其取出。以類似的方式，使用這種標(biāo)記肽、多肽或抗體分離和鑒別上皮或其它干細(xì)胞。另外，通過(guò)中和INPROL活性治療性地使用或通過(guò)檢測(cè)循環(huán)INPROL水平診斷性地使用標(biāo)記或未標(biāo)記的這種抗體。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以從人類基因或cDNA文庫(kù)克隆INPROL，以表達(dá)重組人INPROL。例如，使用從所述純化蛋白得到的序列信息，構(gòu)建可以例如用32-P標(biāo)記的寡核苷酸探針，該探針并用其篩選適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)(例如來(lái)自骨髓的)。或者，使用抗體或使用適當(dāng)?shù)墓δ軝z測(cè)(例如實(shí)施例2中描述的檢測(cè))篩選來(lái)自適當(dāng)來(lái)源(例如骨髓)的表達(dá)文庫(kù)中編碼INPROL的cDNA。已經(jīng)使用本領(lǐng)域已知方法克隆和表達(dá)了血紅蛋白自身以及單獨(dú)的α和β鏈(參見(jiàn)Pagnier等，Rev.Fr.Transfus.Hemobiol.35407-15，1992；Looker等，Nature 356258-60，1992；Methodsin Enzymology vol.231，1994)。
本發(fā)明包括DNA序列，它包括選定非哺乳動(dòng)物宿主表達(dá)“優(yōu)選”的密碼子的加入；提供限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；提供有利于易于表達(dá)的載體的構(gòu)建或血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的產(chǎn)生或純化的另外的起始、終止或中間DNA序列。
本發(fā)明亦提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物或衍生物的DNA序列，這些多肽類似物或衍生物在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的同一性或位置方面不同于自然發(fā)生形式(即含有比所有指定殘基少的缺失類似物；替代類似物，其中一個(gè)或多個(gè)指定的殘基被其它殘基置換；和添加類似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被加入該多肽的末端或中間部分)，并具有一些或所有自然發(fā)生形式的性質(zhì)。
在一有利實(shí)施方案中，INPROL是通過(guò)基因組或cDNA克隆或通過(guò)基因合成得到的外源DNA序列的原核或真核宿主表達(dá)(例如由培養(yǎng)中的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá))的產(chǎn)物。即在一有利實(shí)施方案中，INPROL是“重組INPROL”。在典型的酵母(例如釀酒酵母)或原核生物(例如大腸桿菌)宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物不與任何哺乳動(dòng)物蛋白相聯(lián)系。在脊椎動(dòng)物(例如非人類哺乳動(dòng)物(例如COS或CHO)和鳥(niǎo)類)細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物不與任何人類蛋白相聯(lián)系。根據(jù)使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以糖基化或可以非糖基化。本發(fā)明的多肽可選地亦包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基(位于位置-1)。
本發(fā)明亦包含諸如血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物的其它產(chǎn)物。這種類似物包括血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的片段。按照已知程序，可以容易地設(shè)計(jì)和生產(chǎn)編碼微生物表達(dá)的具有在一個(gè)或多個(gè)殘基的同一性或位置方面不同與本文指定的一級(jí)序列(例如置換、末端和中間添加和缺失)的多肽的基因。或者，通過(guò)眾所周知的定點(diǎn)誘變技術(shù)可以容易地完成cDNA和基因組基因的修飾，并用該修飾產(chǎn)生血紅蛋白α、β、γ、δ、ε或ζ鏈的類似物和衍生物。這種產(chǎn)物具有至少一種INPROL的生物學(xué)性質(zhì)，但可以在其它性質(zhì)不同。做為實(shí)例，本發(fā)明的產(chǎn)物包括通過(guò)例如缺失縮短的α、β、γ、δ、ε或ζ鏈；或那些對(duì)水解更穩(wěn)定的產(chǎn)物(并因此比自然發(fā)生的具有更顯著或更持久作用)；或它們已被改變以缺失或添加一個(gè)或多個(gè)潛在O-糖基化和/或N-糖基化位點(diǎn)、或其一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基缺失或被例如丙氨酸或絲氨酸殘基置換，并更易以活性形式從微生物系統(tǒng)分離；或其一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基被苯丙氨酸置換并更易或更不易與靶蛋白或靶細(xì)胞上的受體結(jié)合。亦包括僅重復(fù)所述α、β、γ、δ、ε或ζ鏈內(nèi)連續(xù)氨基酸序列或二級(jí)構(gòu)象的一部分的肽或多肽片段，所述片段可以具有INPROL的一種性質(zhì)(例如受體結(jié)合)而不具有INPROL的其它性質(zhì)(例如干細(xì)胞抑制活性)。值得注意的是活性對(duì)本發(fā)明的任何一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)物具有治療實(shí)用性或其它方面的實(shí)用性不是必須的，所述其它方面例如在抑制因子拮抗作用檢測(cè)中。競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑可以用于干細(xì)胞抑制劑或其受體過(guò)量產(chǎn)生的情況中。
另外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成源自該蛋白序列的保持生物學(xué)活性的肽。本發(fā)明亦提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的肽類似物或衍生物的序列，它們?cè)谝粋€(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的同一性或位置方面不同于自然發(fā)生形式(即，含有比所有指定殘基少的缺失類似物；替代類似物，其中一個(gè)或多個(gè)指定的殘基被其它或者自然發(fā)生或者諸如D氨基酸的本領(lǐng)域已知的其它類似物殘基置換；和添加類似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被化學(xué)修飾，以增強(qiáng)穩(wěn)定性、溶解度和/或?qū)Φ鞍姿獾目剐?，并具有一些或所有自然發(fā)生形式的性質(zhì)。
可以通過(guò)各種方法鑒別諸如上述的肽序列。比較在檢測(cè)中有活性的天然血紅蛋白鏈(例如α鏈)和無(wú)活性的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(例如肌紅蛋白)的三維結(jié)構(gòu)，可以鑒別在三維空間具有不同構(gòu)象并因此是活性肽的候選區(qū)的區(qū)域。另一方法使用選擇性蛋白水解，其中將蛋白水解酶用于血紅蛋白鏈的有限度消化，產(chǎn)生可以通過(guò)例如反相HPLC分離并檢測(cè)干細(xì)胞抑制的肽。亦可通過(guò)化學(xué)合成制備肽(例如固相合成)；可以容易地制備一系列包含目的血紅蛋白鏈(例如α鏈)序列的重疊肽(例如15-mers)并在干細(xì)胞檢測(cè)中測(cè)試?？梢灾苽浣M合文庫(kù)，其中進(jìn)行多個(gè)化學(xué)合成并使選擇的氨基酸位置可變，產(chǎn)生供篩選的大量的肽類似物(例如Dooley等，Peptide Research 8124-137，1995)?；蛘撸梢允褂弥亟M方法?？梢允褂枚c(diǎn)誘變鑒別對(duì)特定血紅蛋白鏈活性必需的關(guān)鍵殘基?？梢詫⒁阎獮榫哂谢钚缘母杉?xì)胞抑制劑的鏈的區(qū)域(例如α鏈)用來(lái)自相關(guān)但無(wú)活性蛋白(例如肌紅蛋白)的區(qū)置換并在干細(xì)胞檢測(cè)中測(cè)試，使得可以鑒別對(duì)活性必需的區(qū)。這種被鑒別的區(qū)可以做為肽表達(dá)并在干細(xì)胞循環(huán)檢測(cè)中測(cè)試活性。
來(lái)自其它物種的同源或類似INPROL形式可以用于各種獸醫(yī)用途，與上述本發(fā)明的治療實(shí)施方案類似。
干細(xì)胞抑制量的INPROL通過(guò)可逆地將循環(huán)干細(xì)胞置于不分裂或緩慢分裂“休息”狀態(tài)作用于循環(huán)干細(xì)胞。當(dāng)欲刺激靜止干細(xì)胞進(jìn)入分裂時(shí)，例如在用化療藥物或放射治療患癌癥的患者之后，可以使用干細(xì)胞刺激量的INPROL?；蛘?，或另外，可以將集落刺激因子和其它造血刺激劑給予該受治療者。這種因子的實(shí)例包括但不限于M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF、巨核細(xì)胞-CSF、血小板生成素、干細(xì)胞因子或其它細(xì)胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或紅細(xì)胞生成素。
如下述方案例證的，通過(guò)結(jié)合了干細(xì)胞抑制活性的適當(dāng)生物檢測(cè)的常規(guī)化學(xué)方法，純化或合成具有干細(xì)胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將治療有效量的該INPROL蛋白或其治療有效片段與藥學(xué)上可接受載體混合使用。一般通過(guò)非腸道注射或輸注給予該INPROL組合物。按照達(dá)到的治療效果選擇皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射途徑。
當(dāng)系統(tǒng)性給予時(shí)，用于本發(fā)明的治療組合物是無(wú)熱原、非腸道可接受的水溶液形式。具有pH、等滲性、穩(wěn)定性、載體蛋白等等的藥學(xué)上可接受的無(wú)菌蛋白溶液在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明亦包括包含與用于INPROL療法的合適的稀釋劑、防腐劑、加溶劑、乳化劑、輔助劑和/或載體一起的治療有效量的本發(fā)明肽或多肽產(chǎn)物的藥用組合物。本文使用的“治療有效量”指對(duì)給定疾病和給藥制制度提供治療效果的量。這種組合物是液體、凝膠、軟膏或凍干或其它方式干燥的制劑并包括稀釋劑，所述稀釋劑有各種緩沖內(nèi)容物(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度、諸如白蛋白或明膠以防止表面吸附的添加劑、去污劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽汁酸鹽)、加溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類)、填充物質(zhì)或張力調(diào)節(jié)劑(例如乳糖、甘露糖)、諸如聚乙二醇的聚合物與該蛋白的共價(jià)連接、與金屬離子絡(luò)合、或?qū)⒃摬牧霞尤氲街T如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等的聚合化合物的顆粒狀制劑中或上面、或加入脂質(zhì)體、niosomes、微乳劑、微團(tuán)、單層或多層小泡、生物可降解可注射微膠囊或微球體、或蛋白基質(zhì)、紅細(xì)胞影、原生質(zhì)球、皮膚膏藥或其它已知的釋放或包裝藥物的方法。這種組合物將影響INPROL的物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。控制或緩釋組合物包括在親脂貯存物(depot)(例如脂肪酸、蠟、油)中的制劑。本發(fā)明亦包括用聚合物(例如聚羥亞烴(poloxamer)或聚乙二酰胺(poloxamine))包被的顆粒狀組合物和偶聯(lián)至抗組織特異性受體、配體或抗原的抗體或偶聯(lián)至組織特異性受體配體的INPROL。本發(fā)明的組合物的其它實(shí)施方案對(duì)各種給藥途徑(包括非腸道、肺、鼻、表面(皮膚或粘膜)和口服)加入顆粒形式的保護(hù)包衣、蛋白酶抑制因子或透過(guò)增強(qiáng)劑。在另一實(shí)施方案中，將含有INPROL的組合物表面或通過(guò)透皮貼給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以劑量單位形式包裝于無(wú)菌小瓶或安瓿瓶中。
本發(fā)明亦包含包括一個(gè)或多個(gè)其它因子的組合物，這種因子例如化療藥物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、順鉑、卡鉑、阿霉素(doxyrubicin)、依托泊甙、紫杉酚、烷化劑)、抗病毒劑(例如AZT、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷)、TNF、細(xì)胞因子(例如白介素)、抗增殖藥物、抗代謝藥物和干擾DNA代謝的藥物。
涉及治療預(yù)期暴露給這種細(xì)胞毒性藥物的受治療者或治療高增殖干細(xì)胞的方法的劑量制度由主治醫(yī)師考慮各種調(diào)節(jié)藥物作用的因素而確定；例如，考慮患者的病情、體重、性別和飲食、任何感染的嚴(yán)重性、給藥時(shí)間和其它臨床因素。
在受治療者暴露給細(xì)胞毒性藥物或放射之后，本發(fā)明的治療方法可選地采用給予該受治療者干細(xì)胞刺激量的INPROL并可選地包括一種或多種淋巴因子、集落刺激因子或其它細(xì)胞因子、紅細(xì)胞生成素、白介素或生長(zhǎng)因子，以一般地刺激受先前INPROL處理抑制的干細(xì)胞(和其后代)的生長(zhǎng)和分裂。這種促進(jìn)血細(xì)胞生成的治療藥物包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、巨核細(xì)胞-CSF、M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF或紅細(xì)胞生成素。按照從這些藥物在臨床試驗(yàn)其使用在化療或造血干細(xì)胞移植后促進(jìn)造血重建的效力中得到的知識(shí)選擇這些藥物的劑量。可以調(diào)節(jié)這些劑量以補(bǔ)償該患者的身體狀況、暴露給該受治療者的化療藥物或放射的量和類型中的變化。通過(guò)常規(guī)方法監(jiān)視受治療患者中由給予INPROL引起的干細(xì)胞抑制的逆轉(zhuǎn)進(jìn)程。
在治療白血病中，同時(shí)與細(xì)胞毒性藥物治療或在輻射中同時(shí)給予抑制正常干細(xì)胞循環(huán)的INPROL和諸如IL-3或GM-CSF的白血病細(xì)胞生長(zhǎng)刺激劑是有益的。通過(guò)這個(gè)方案，有可能在正常細(xì)胞和白血病細(xì)胞的循環(huán)狀態(tài)和藥物敏感性之間達(dá)到最大的差異。
實(shí)施例1體內(nèi)干細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)為檢測(cè)干細(xì)胞增殖，通過(guò)3H-胸苷“自殺”方法(Becker等，Blood 26296-308，1965)測(cè)定細(xì)胞周期的S期中CFU-S的數(shù)量。
通過(guò)在靜脈注射造血細(xì)胞8-12天后致死輻射小鼠的脾臟中形成目視可見(jiàn)的集落，可以檢測(cè)未成熟造血祖代—脾臟中的集落形成單位(CFU-S)(Till和McCulloch，1961)。
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)CFU-S增殖檢測(cè)，通常使用3H-胸苷“自殺”方法(Becker等，1965)。該方法基于DNA前體放射性標(biāo)記的胸苷(3H-胸苷)在DNA合成中摻入細(xì)胞。在檢測(cè)時(shí)處于周期的S期的CFU-S被高放射性殺傷，并因此不能在脾臟中形成集落。因此，通過(guò)注射未與3H-胸苷溫育的細(xì)胞樣品和與3H-胸苷溫育的同樣細(xì)胞形成的CFU-S數(shù)量之間的差異，顯示出在原始樣品中增殖CFU-S的百分比。
只要該抑制劑僅影響循環(huán)CFU-S(它們低至只占正常小鼠骨髓中的總CFU-S群體的7-10％)，則無(wú)法用來(lái)自未刺激動(dòng)物的骨髓干細(xì)胞群體做抑制劑測(cè)試。
為刺激CFU-S增殖，使用了苯肼(PHZ)或亞致死輻射(Lord，1976)。
我們已開(kāi)發(fā)了基于丙酸睪酮對(duì)CFU-S循環(huán)的刺激作用(Byron等，Nature 2281204，1970)使用丙酸睪酮(TSP)的方法，該方法簡(jiǎn)化了檢測(cè)且不引起任何副作用。TSP在注射后20-24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)刺激CFU-S增殖，并且該作用至少可以觀察七天。
在該抑制劑純化中用于篩選各部分的程序如下小鼠在所有測(cè)試中都使用BDF1或CBF1小鼠品系。
通過(guò)腹膜內(nèi)注射0.2ml/小鼠，用10mg/100g劑量TSP處理供體小鼠，以誘導(dǎo)30-35％的CFU-S進(jìn)入S期。
24小時(shí)后，從股骨取骨髓以制備細(xì)胞懸液。然后將5-10×106細(xì)胞/ml與不同的對(duì)照和測(cè)試部分于37℃在水浴中溫育3.5小時(shí)，每組二管(一管為熱的(放射性)、一管為冷的(無(wú)放射性))。
3.5小時(shí)后，以200μl/ml細(xì)胞懸液將3H-胸苷(1mCi/ml，比活18-25Ci/毫摩爾)加入每個(gè)熱管中；冷管中未加。繼續(xù)于37℃溫育30分鐘。
在30分鐘溫育后，通過(guò)加入10ml含有400μg/ml非放射性胸苷的冷(4℃)培養(yǎng)基終止該殺傷反應(yīng)。徹底地清洗細(xì)胞(3次)。
將細(xì)胞再懸浮并稀釋至適于注射的濃度，通常為0.3-0.5ml中的2-4×104細(xì)胞/小鼠。
在注射前不遲于6小時(shí)輻射8-10只/組的受體小鼠。
在第9-12天收集受體脾臟，并在Tellesnitsky氏溶液中固定；通過(guò)目視計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)集落。用以下公式計(jì)算在S期的細(xì)胞百分比。
%S=a-ba×100%]]>其中a-無(wú)3H-胸苷的CFU-S數(shù)量其中b-有3H-胸苷的CFU-S數(shù)量在表1中給出的INPROL測(cè)試數(shù)據(jù)證實(shí)循環(huán)干細(xì)胞用INPROL處理后變得對(duì)3H-胸苷的作用有抗性。對(duì)本實(shí)施例和以下所有實(shí)施例，術(shù)語(yǔ)“pINPROL”都指從豬骨髓純化的蛋白。對(duì)于S期特異性細(xì)胞毒性藥物阿糖胞苷和羥基脲觀察到同樣的保護(hù)(未顯示數(shù)據(jù))。如果然后用含有非放射性胸苷的冷培養(yǎng)基清洗所述處理的干細(xì)胞，則小鼠脾臟中存活的干細(xì)胞增殖正常地形成集落。
表1在與骨髓細(xì)胞4小時(shí)溫育中pINPROL對(duì)CFU-S增殖的抑制活性
*CFU-S/2×104細(xì)胞實(shí)施例2體外干細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)使用以下測(cè)試系統(tǒng)(Lord等，The Inhibitors of Hematopoiesis第227-239頁(yè)，1987)顯示了INPROL的直接作用。將多譜系因子(IL-3)依賴性干細(xì)胞系FDCP mix A4(A4)保持于添加了20％馬血清和做為集落刺激IL-3源的10％ WEHI-3-條件培養(yǎng)基的MDM培養(yǎng)基中。
使用氚標(biāo)記胸苷摻入檢測(cè)測(cè)定增殖將A4細(xì)胞(含有20％馬血清和50％ WEHI-3 CM的100μl中有5×104)于37℃在5％ CO2中培養(yǎng)16小時(shí)。
在開(kāi)始時(shí)加入pINPROL或粗BME(部分IV)。然后將氚標(biāo)記胸苷(50μl中的(3H-Tdr)3.7KBq，740GBq/毫摩爾)加入每個(gè)組中再溫育3小時(shí)。通過(guò)收獲細(xì)胞測(cè)定增殖水平并用以下公式計(jì)算抑制百分比
在梯度劑量的正常骨髓提取物或pINPROL的存在下生長(zhǎng)的FDCP mix-A4 (FDCPmix-A4)細(xì)胞的氚標(biāo)記胸苷(3H-Tdr)的摻入描繪于圖6?？梢?jiàn)純化的pINPROL組合物的活性至少比原材料高1,000倍。暴露時(shí)間(16小時(shí))是有效抑制的重要因子，并顯示了pINPROL對(duì)該A4細(xì)胞系干細(xì)胞的直接作用。
實(shí)施例3通過(guò)INPROL體內(nèi)注射劑量抑制CFU-S增殖和該作用的持續(xù)時(shí)間體內(nèi)注射INPROL的效應(yīng)研究揭示，INPROL可以有效地阻斷募集CFU-S進(jìn)入循環(huán)，由此保護(hù)那些細(xì)胞免受進(jìn)一步治療的細(xì)胞毒性作用，顯示出其臨床應(yīng)用潛力。
該實(shí)驗(yàn)方案有二個(gè)目標(biāo)檢查體內(nèi)注射時(shí)INPROL對(duì)CFU-S的作用并確定與循環(huán)干細(xì)胞有關(guān)的INPROL活性的有效期。
為刺激干細(xì)胞增殖，基于上述實(shí)施例1中提及的作用，使用丙酸睪酮注射。
在第0天用TSP(10mg/100g)注射小鼠BDF1；24小時(shí)后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠(4只小鼠/組)接受劑量為0μg、5μg、10μg和15μg/小鼠的單次腹膜內(nèi)注射pINPROL。
pINPROL注射后24小時(shí)，處死小鼠并通過(guò)實(shí)施例1中描述的檢測(cè)測(cè)定循環(huán)CFU-S的百分比。與未處理小鼠的7％相比，TSP注射誘導(dǎo)了約50％CFU-S進(jìn)入循環(huán)。低達(dá)2μg/小鼠的pINPROL劑量可以抑制TSP誘導(dǎo)的增殖降至正常水平。
關(guān)于該作用評(píng)價(jià)的持續(xù)時(shí)間，將一組小鼠(21只小鼠/組)僅用TSP注射，而另一組用TSP和pINPROL(TSP后24小時(shí))注射。通過(guò)從每組中取三個(gè)供體并按照所述方法(參見(jiàn)實(shí)施例1)測(cè)定其骨髓中CFU-S循環(huán)狀態(tài)，在一周內(nèi)每24小時(shí)測(cè)定CFU-S循環(huán)。圖7中給出的數(shù)據(jù)顯示，雖然TSP的持續(xù)時(shí)間至少為7天，但I(xiàn)NPROL的單次注射可以在不超過(guò)48-72小時(shí)內(nèi)將CFU-S置于靜止并保持它們置于循環(huán)之外。因?yàn)橛糜诎┌Y和白血病化療的大多數(shù)化療藥物具有相對(duì)短的體內(nèi)半衰期，一般短于24小時(shí)，因此根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，該INPROL作用的保持時(shí)間長(zhǎng)于象阿糖胞苷或羥基脲的化療藥物在體內(nèi)有活性的有效期。更重要地是，對(duì)于在第一次(對(duì)干細(xì)胞無(wú)損傷)和第二次(損傷CFU-S)治療之間具有較長(zhǎng)間隔(大于24小時(shí)小于96小時(shí))的化療和放射治療，在化療藥物或放射的二次使用之間的間隔相間單次注射INPROL應(yīng)是足夠的。對(duì)于幾次重復(fù)周期的細(xì)胞毒性療法或放射，可以基于該INPROL作用的時(shí)間使用同樣的策略。
實(shí)施例4用5-FU處理后被刺激快速循環(huán)的大多數(shù)原始造血干細(xì)胞被INPROL保護(hù)免受第二次5-FU暴露影響藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)顯著地降低骨髓和淋巴腔隙中的細(xì)胞數(shù)量。一般認(rèn)為它是細(xì)胞周期特異性、導(dǎo)向快速增殖細(xì)胞，因?yàn)樵诩?xì)胞周期的S期之中或之前將該核苷酸類似物摻入DNA導(dǎo)致細(xì)胞死亡。小鼠骨髓的長(zhǎng)期存活和免疫造血重建不受單劑量5-FU影響；然而，已證實(shí)(Harrison等，Blood 781237-1240，1991)多能造血干細(xì)胞(PHSC)在首次劑量后約3-5天的短時(shí)間內(nèi)變得易受第二劑5-FU攻擊。可以解釋為PHSC的正常循環(huán)太慢，以至于使單劑量5-FU無(wú)效，并且被首次5-FU處理產(chǎn)生的刺激物刺激進(jìn)入快速循環(huán)。我們已建議PHSC可以被INPROL回復(fù)至慢循環(huán)狀態(tài)，并由此被保護(hù)免受第二次5-FU處理影響。
這些實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠是BDF1雄性小鼠。以10μg/ml的濃度制備在生理鹽水中的5-FU(Sigma)貯液。每只受處理的小鼠在實(shí)驗(yàn)的第0天通過(guò)尾靜脈接受2mg 5FU/10g體重；24小時(shí)后用pINPROL(10μg/100g體重)腹膜內(nèi)注射小鼠，并在第3天時(shí)注射第二劑的5-FU。通過(guò)觀察各有30只小鼠的實(shí)驗(yàn)組(用pINPROL處理)和對(duì)照組的小鼠死亡進(jìn)行存活研究。存活曲線示于圖8。
實(shí)施例5在骨髓細(xì)胞中用INPROL對(duì)比MEP-1α預(yù)溫育的效果本實(shí)驗(yàn)的目的是比較體外用pINPROL和MIP-1α預(yù)溫育對(duì)小鼠骨髓的抑制效果。
使用以下程序體內(nèi)在從股骨收集骨髓48小時(shí)之前，用200mg/kg 5FU腹膜內(nèi)注射6-15周齡的BDF1小鼠。
體外計(jì)數(shù)單細(xì)胞混合懸浮液并將總體積2ml的5×106細(xì)胞與有或無(wú)pINPROL或MEP-1α、與5％馬血清、添加了L-谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)基于37℃和5％CO2溫育4小時(shí)。然后將該細(xì)胞清洗二次并再計(jì)數(shù)。將其于以下終條件中的甲基纖維素中鋪平板0.8％甲基纖維素25％馬血清20ng/ml重組鼠IL3添加的L-谷氨酰胺5×105細(xì)胞/mlIMDM培養(yǎng)基將平板于37℃和5％CO2和100％濕度中培養(yǎng)11天。計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的集落。
表2組別集落數(shù)對(duì)照百分比對(duì)照 31.0 100％pINPROL 21.25 68.5％MIP-1α 35.25 114％
實(shí)施例6pINPROL抑制HPP-CFC增殖一種評(píng)價(jià)鼠重建干細(xì)胞和早前體的體外檢測(cè)是高增殖潛能集落(HPP-PFC)檢測(cè)；例如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的其它相關(guān)檢測(cè)檢測(cè)進(jìn)行性受限制的祖代群體(M.Moore，Blood1772122-2128，1991)。本實(shí)施例顯示用pINPROL預(yù)處理細(xì)胞抑制其增殖，而MIP-1α在這些實(shí)驗(yàn)條件下未能抑制其增殖。
在檢測(cè)其骨髓HPP-CFC數(shù)前用5-氟尿嘧啶(200mg/kg腹膜內(nèi))處理BDF1小鼠。通過(guò)離心清洗細(xì)胞，以106-5×106/ml的密度在或者未加藥物(對(duì)照)、加pINPROL(25ng/ml)或MIP-1α(200ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，清洗細(xì)胞并鋪平板于含有30％ FCS和來(lái)自5637和WEHI-3B細(xì)胞系的混合條件培養(yǎng)基(如Sharp等，1991推薦，每種條件培養(yǎng)基各7.5％)的瓊脂(0.3％)。鋪平板濃度為60mm平皿中5×104細(xì)胞/ml。在第14天時(shí)計(jì)數(shù)集落，結(jié)果示于以下。
表3組別HPP-CFU對(duì)照百分比對(duì)照 15.5±1.2 100％pINPROL 8.3±0.7 53.5％MIP-1α 15.8+0.9 101％根據(jù)這些結(jié)果，當(dāng)僅在預(yù)溫育期存在時(shí)，MIP-1α不抑制最不成熟前體的增殖。pINPROL在這些條件下有效地抑制增殖，表明pINPROL和MIP-1α之間在生物學(xué)活性方面的基本差異。
實(shí)施例7INPROL療法對(duì)從放射誘導(dǎo)骨髓發(fā)育不全恢復(fù)的影響骨髓發(fā)育不全是放射癌癥療法的主要限制性毒性。已證實(shí)某些生長(zhǎng)因子(例如G-CSF、GM-CSF、紅細(xì)胞生成素)可以加速?gòu)姆派湔T導(dǎo)骨髓發(fā)育不全的恢復(fù)。通過(guò)使用干細(xì)胞增殖抑制劑保護(hù)的概念是應(yīng)付造血損傷的不同和補(bǔ)充的方法。為遵循先前發(fā)展的治療方法(實(shí)施例3、4)，建立了小鼠致死輻射模型。本領(lǐng)域已知接受9Gy鈷60的小鼠在10-14天后開(kāi)始死亡；至第30天，死亡率約為50％。通過(guò)將其分為二個(gè)相繼的4.5Gy應(yīng)用并且二次劑量間隔3天，將該致死劑量用于我們的模型。初步的數(shù)據(jù)顯示，該模型中的存活曲線與用單次9Gy輻射的存活曲線非常接近；另外對(duì)CFU-S增殖的測(cè)試顯示，在第一次輻射后24小時(shí)時(shí)，35-50％的CFU-S被誘導(dǎo)增殖。通過(guò)在第二次劑量之前提供的干細(xì)胞抑制劑保護(hù)這種細(xì)胞。
為檢查這種可能性，使小鼠(50只小鼠/組)在第0天接受4.5Gy。24小時(shí)后，一組接受pINPROL(2μg/小鼠，腹膜內(nèi))，另一對(duì)照組用鹽水注射。在第3天時(shí)給予第二次放射劑量(4.5Gy)。
圖9顯示在單劑量pINPROL后存活增加。該模型的條件與治療包括那些特征為實(shí)體瘤的任何癌癥臨床上相關(guān)；通過(guò)在二次連續(xù)放射劑量之間提供有效劑量的INPROL，可以將這種治療給予患有癌癥的患者，由此允許使用更大劑量的放射以治療該癌癥。亦可能將該用藥程式延伸至化療藥物。
實(shí)施例8INPROL用于自體骨髓移植的用途骨髓移植對(duì)幾種白血病(CML、AML和其它)是唯一已知的治療性療法?；铙w外調(diào)節(jié)自體BMT用于輸注將提供潛在的不含白血病污染的正常干細(xì)胞自體源，并可以種群恢復(fù)該受體的造血系統(tǒng)以允許攻擊性的和有效的療法。
1.研究INPROL在用AraC凈化期間保持正常血細(xì)胞發(fā)生的作用的長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物L(fēng)1210白血病模型按照Toksoz等(Blood 55931-936，1980)建立長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物(LTBMC)，并通過(guò)在二周內(nèi)共培養(yǎng)將白血病細(xì)胞系L1210用于所述LTBMC。在這些聯(lián)合LTBMC/L1210培養(yǎng)物中發(fā)生正常和白血病祖代的同時(shí)生長(zhǎng)，與白血病患者骨髓中的情況類似。通過(guò)將其做為瓊脂集落在有或無(wú)來(lái)自WEHI-3(產(chǎn)生鼠IL-3的細(xì)胞系)的條件化培養(yǎng)基的情況下生長(zhǎng)可以區(qū)別正常集落形成單位CFU和白血病CFU。在不存在IL-3時(shí)，正常細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，而白血病細(xì)胞可以在不存在IL-3時(shí)形成集落。來(lái)自LTBMC-L1210組合物的懸浮細(xì)胞的約每50,000個(gè)鋪平板細(xì)胞在存在IL-3的情況下產(chǎn)生約150個(gè)集落(正常造血克隆)，而在不存在IL-3生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生約70個(gè)集落(白血病克隆)。
凈化的程序如下第0天時(shí)，將所有的懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基(10ml/燒瓶)從含有LTBMC-L1210的燒瓶中取出，并用2ml含有200μg阿糖胞苷(AraC)的培養(yǎng)基(Tsyrlova等，載于LeukemiaAdvances inBiology andTherapy第35卷，1988)置換；培養(yǎng)24小時(shí)后，清洗燒瓶并用2ml新鮮的單獨(dú)培養(yǎng)基(對(duì)照組)或含有25 ng/ml的pINPROL置換4小時(shí)。在這次預(yù)培養(yǎng)后，將細(xì)胞再次與100μg/燒瓶的AraC于37℃溫育3小時(shí)。各組有4只燒瓶。將LTBMC-L1210清洗三次，并用新鮮LTBC培養(yǎng)基置換；將其如前保持3-4周以進(jìn)行再生研究。
數(shù)據(jù)示于圖10。在僅用AraC處理的對(duì)照培養(yǎng)物中未見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而在INPROL保護(hù)的燒瓶中血細(xì)胞發(fā)生的再生由于來(lái)自粘附層的祖代的增殖而更快速地發(fā)生。另外，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞當(dāng)鋪平板于瓊脂中時(shí)僅在IL-3存在的情況下生長(zhǎng)，產(chǎn)生約100CFU/50,000細(xì)胞；在至少四周內(nèi)未觀察到白血病細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，用有效劑量的AraC與INPROL聯(lián)合活體外處理骨髓，可以清除癌癥細(xì)胞，而干細(xì)胞受到保護(hù)。應(yīng)可以將此用藥程式延伸至其它形式的化療或放射治療。
2.通過(guò)體外INPROL處理增強(qiáng)骨髓種群恢復(fù)能力(MRA)和30天的放射保護(hù)MRA(細(xì)胞種群恢復(fù)致死輻射小鼠骨髓的能力)以及賦予放射保護(hù)30天的能力是拯救骨髓抑制動(dòng)物的潛力的體內(nèi)直接測(cè)量(Visser等，Blood Cells 14369-384，1988)。
為進(jìn)行放射保護(hù)研究，將BDF1小鼠用9.5Gy輻射，并通過(guò)移植睪酮刺激供體骨髓恢復(fù)。一組受體用與培養(yǎng)基(對(duì)照-A組)、另一組(B組)與25ng/ml pINPROL預(yù)溫育4小時(shí)的骨髓細(xì)胞恢復(fù)。清洗這二組中的細(xì)胞，并將30,000細(xì)胞/小鼠移植入輻射動(dòng)物中。顯示了存活數(shù)據(jù)(圖11)。用對(duì)照歸一化至100％，描繪了三個(gè)實(shí)驗(yàn)的總和。在第30天時(shí)，pINPROL培養(yǎng)使小鼠的存活率從對(duì)照組的36.5％增加至61.8％。
通過(guò)用INPROL預(yù)培養(yǎng)誘導(dǎo)的MRA增加可能是改善放射保護(hù)的機(jī)理之一。為檢查該假設(shè)，按照Visser等所述(在所引的書(shū)中)測(cè)定MRA。簡(jiǎn)言之，將供體BDF1小鼠用睪酮預(yù)處理，將其骨髓用培養(yǎng)基或pINPROL預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)，并注射入輻射動(dòng)物中。在第13天，將來(lái)自受體股骨的骨髓細(xì)胞以三個(gè)不同濃度(相等于0.01，0.05，0.1個(gè)股骨)在有20％馬血清和10％ WEHI-CM的存在下鋪平板于瓊脂中。第7天的集落數(shù)代表MRA，只要在此時(shí)受體骨髓的集落形成細(xì)胞是供體未成熟干細(xì)胞的祖代。
如圖12所見(jiàn)，用INPROL預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞群體的MRA高于對(duì)照組(B)。
實(shí)施例9INPROL對(duì)干細(xì)胞的抗高增殖作用可以改變其分化異常不僅在從細(xì)胞毒性藥物或輻射恢復(fù)期間，而且做為正常衰老的結(jié)果都觀察到CFU-S高增殖，據(jù)認(rèn)為它是骨髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)的主要特征。它伴隨著分化異常，例如紅細(xì)胞類分化占主導(dǎo)，而沿粒細(xì)胞路徑的分化減少。
將骨髓細(xì)胞與25ng/ml pINPROL或培養(yǎng)基(對(duì)照)于37℃培養(yǎng)4小時(shí)，然后清洗細(xì)胞并鋪平板于含有20％馬血清、2U/ml紅細(xì)胞生成素和10％WEHI-CM的瓊脂中。在第7天計(jì)數(shù)BFU-E和GM-CFU的數(shù)量。表4中提供的數(shù)據(jù)系從三個(gè)實(shí)驗(yàn)的概括-每組每個(gè)點(diǎn)取4只動(dòng)物；鋪了四個(gè)平板。
如表4明顯所示，用INPROL培養(yǎng)完整幼齡動(dòng)物(8-12周齡的BDF1)的正常骨髓(NBM)，不改變不同類型集落的數(shù)量或比例。用丙酸睪酮(TSP)預(yù)處理的BDF1供體顯示出與以前(實(shí)施例1、3、4)觀察的相同的CFU-S增殖的增加、紅細(xì)胞類祖代數(shù)量(BFU-E集落)略有增加、GM-CFU減少，這通過(guò)用INPROL培養(yǎng)完全取消。另外，CFU-S增殖的異常高水平被回復(fù)至細(xì)胞周期S期的10％ CFU-S。已知CFU-S高增殖是一些易感病毒性白血病誘導(dǎo)的小鼠品系的特征，例如Balb/c小鼠(表4)，也可以在較老動(dòng)物中觀察到(表4)。在均具有異常高水平CFU-S增殖的Balb/c和較老(23-25月齡)的BDF1中觀察到在TSP處理的BDF1中觀察到的相同的定型祖代的再分布。通過(guò)用INPROL培養(yǎng)誘導(dǎo)了CFU-S增殖和分化的更正。對(duì)臨床更相關(guān)的是，該研究表明體內(nèi)注射INPROL(2μg/小鼠)影響CFU-S的增殖和紅細(xì)胞類(BFU-E)和GM集落的比例(表4)。
表4INPROL對(duì)CFU-S分化為定型祖代BFU-E和CFU-GM的影響
實(shí)施例10INPROL的免疫刺激活性已觀察到用INPROL培養(yǎng)含有高比例增殖CFU-S的骨髓細(xì)胞不僅改變CFU-S的循環(huán)，而且改變其分化，將占優(yōu)勢(shì)的紅細(xì)胞類分化轉(zhuǎn)為利于粒細(xì)胞和淋巴類祖代。由于細(xì)胞毒性化療或放療的免疫抑制副作用、以及伴隨高增殖干細(xì)胞紊亂和衰老的免疫抑制，INPROL的這種性質(zhì)是重要的。
本實(shí)施例顯示INPROL對(duì)來(lái)自按照Wittlock和Witte(Ann.Rev.Immun.3213-35，1985)建立的淋巴長(zhǎng)期培養(yǎng)物(LLTC)的未成熟前體分化成為前B祖代的直接作用，通過(guò)在含有IL-7的甲基纖維素中形成集落來(lái)測(cè)定。
如所述建立LLTC，每周二次用新鮮LLTC培養(yǎng)基(Terry Fox Labs.，Vancouver，Canada)飼養(yǎng)。每周收獲未粘附細(xì)胞一次，洗去各種因子并用25ng/ml pINPROL或僅用培養(yǎng)基做為對(duì)照培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，清洗細(xì)胞并以105細(xì)胞/ml的濃度鋪平板于含有30％FCS和10 ng/ml IL-7的甲基纖維素中。三周的數(shù)據(jù)示于圖13。對(duì)照中大前B集落的數(shù)量有變化，并隨時(shí)間增加，但是用INPROL預(yù)培養(yǎng)總是刺激集落生長(zhǎng)超過(guò)對(duì)照水平的4-8倍。這證實(shí)了INPROL的免疫刺激性質(zhì)，該性質(zhì)可以用于更正免疫缺陷狀態(tài)和增強(qiáng)例如對(duì)接種疫苗所需的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例11INPROL提高干細(xì)胞—來(lái)自患有CML患者的長(zhǎng)期培養(yǎng)物起始細(xì)胞的種群恢復(fù)能力慢性髓細(xì)胞性白血病(myeloid leukemia)(CML)是造血干細(xì)胞的致死惡性疾病。用單藥物化療、聯(lián)合化療、脾切除術(shù)或脾輻射治療慢性期的CML可以控制臨床病癥和癥狀，但不能顯著地延長(zhǎng)存活。當(dāng)CML從慢性期發(fā)展進(jìn)入加速期時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)療法無(wú)效。目前，骨髓移植(BMT)是CML的唯一有療效的療法。由于組織不相容性問(wèn)題，用不相關(guān)供體BMT的療法是困難的。少于40％其它方面合格的CML患者有合適匹配相關(guān)供體；因此最好用自體移植。用于輸注的自體BMT在活體外調(diào)節(jié)與選擇在長(zhǎng)期培養(yǎng)物(LTC)中生長(zhǎng)的來(lái)自Ph陽(yáng)性患者非白血病(Ph陰性)骨髓祖代的能力，提示正常干細(xì)胞自體源允許攻擊性和有效的CML療法的潛力。
在BMT方面，可以將造血干細(xì)胞定義為具有長(zhǎng)期產(chǎn)生成熟血細(xì)胞能力的干細(xì)胞。我們已使用由C.Eaves和A.Eaves開(kāi)發(fā)的人類LTC系統(tǒng)，以定量測(cè)定干細(xì)胞數(shù)量和做為操作它們供治療用途的工具。這涉及將細(xì)胞接種入預(yù)建立的輻射人類骨髓粘附層；然后將這些培養(yǎng)物保持5周。結(jié)束點(diǎn)是在該時(shí)間終點(diǎn)收獲的該培養(yǎng)物的總克隆生成細(xì)胞含量(粘附+不粘附)。在這些條件下克隆生成細(xì)胞產(chǎn)量與初始加入的祖代(長(zhǎng)期培養(yǎng)物起始細(xì)胞(LTC-IC))數(shù)量線性相關(guān)；單個(gè)人LTC-IC的平均產(chǎn)量是4個(gè)克隆生成祖代/LTC-IC。先前已表明，當(dāng)將患有CML患者的骨髓置于類似條件時(shí)，白血病(Ph陽(yáng)性)克隆生成細(xì)胞快速減少。通過(guò)使用殘留正常LTC-IC的定量，有可能在患有CML的患者中選擇那些可能從由移植培養(yǎng)的自體移植物支持的加強(qiáng)療法受益的患者(Phillips等，Bone Marrow Transplantation 8477-487，1991)。
使用了以下程序以檢查INPROL對(duì)從患有CML患者的外周血建立的骨髓移植細(xì)胞中克隆生成細(xì)胞(LTC-IC)數(shù)量的作用。
做為長(zhǎng)期培養(yǎng)物在預(yù)輻射基質(zhì)上起始培養(yǎng)。使用健康供體的外周血做為對(duì)照。用或不用pINPROL(25ng/ml)預(yù)培養(yǎng)來(lái)自CML患者的外周血細(xì)胞4小時(shí)，清洗細(xì)胞并置于該LTC-IC系統(tǒng)中5周，以測(cè)定LTC-IC的對(duì)照數(shù)量。對(duì)于實(shí)驗(yàn)，建立其它的平行培養(yǎng)物10天。將生長(zhǎng)10天的培養(yǎng)物的粘附和不粘附細(xì)胞的混合物用或不用pINPROL預(yù)培養(yǎng)，再置于預(yù)建立的飼養(yǎng)層(feeder)上8周。通過(guò)將粘附和不粘附細(xì)胞鋪平板于含有適當(dāng)生長(zhǎng)因子的甲基纖維素(Terry Fox Laboratories，Vancouver，Canada)上，并計(jì)數(shù)產(chǎn)生的集落形成細(xì)胞總數(shù)，估計(jì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物的LTC-IC數(shù)量。使用以下公式從總克隆生成細(xì)胞(CFC)含量的評(píng)價(jià)推導(dǎo)使用這個(gè)程序得到的LTC-IC值#LTC-IC＝#CFC/4圖14提供的數(shù)據(jù)顯示，在從健康供體骨髓起始的培養(yǎng)的前10天期間沒(méi)有LTC-IC損失，培養(yǎng)5周后仍有約30％的投入LTC-IC數(shù)量存在。在所述10天內(nèi)，CML患者的LTC-IC數(shù)量劇烈下降至約8％，并在進(jìn)一步的培養(yǎng)期間未恢復(fù)，而用INPROL預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞將LTC-IC水平增加至起始數(shù)量的30％并在8周內(nèi)保持。
通過(guò)這些初始數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的INPROL臨床相關(guān)應(yīng)用包括將其用于選擇性增加新鮮或培養(yǎng)的骨髓移植物的正常干細(xì)胞含量的策略、增強(qiáng)體內(nèi)調(diào)集殘留正常干細(xì)胞的策略和將新遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入人類骨髓干細(xì)胞以進(jìn)一步移植入患者的方案。
實(shí)施例12A從骨髓制備物分離干細(xì)胞增殖的免疫活性抑制劑的方法從豬肋骨分離骨髓。分離豬尸體的肋骨并去除肌肉纖維和脂肪，將肋骨切成塊，用Biophyzpribor制造的水壓機(jī)提取骨髓。通過(guò)在K-70離心機(jī)中以2,000rpm離心20分鐘分離骨髓細(xì)胞。然后通過(guò)AmiconUSA膜XM-100、PM30、PM-50對(duì)提取上清液連續(xù)進(jìn)行超濾。根據(jù)電泳分析結(jié)果，該產(chǎn)物的主要組分是白蛋白(參見(jiàn)圖1)。
生化純化在純化的每個(gè)步驟，通過(guò)在含有0.1％十二烷基磺酸鈉的10％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析骨髓提取物和各部分的蛋白組分。將最多7％的十二烷基磺酸鈉和最多0.5-1％的巰基乙醇加入樣品中，該樣品在上膠前在70℃溫育5分鐘。
以20Y cm該凝膠進(jìn)行電泳5小時(shí)。然后將該凝膠在乙醇∶水∶乙酸為5∶5∶1的混合物中的0.25％考馬斯CBBC250中于20℃染色1小時(shí)并用幾遍7％乙酸清洗。通過(guò)抑制造血干細(xì)胞(CFU-S)增殖的方法評(píng)價(jià)該產(chǎn)物的活性。以下詳細(xì)介紹該方法。
階段1.用硫酸銨沉淀純化通過(guò)用25％的硫酸銨以40-80％的飽和度沉淀純化所述活性，根據(jù)表5中的結(jié)果選擇該飽和度。
表5飽和度(％) 0-40 40-60 60-8080-100活性(％) 37.2-35.437.2-1.837.2-12.837.2-26.1＝1.8％ ＝35.4％＝24.4％ ＝11.1％
按照純化的水平和等于起始產(chǎn)物的2×10-2mg的劑量，確定各步純化后檢測(cè)使用的該制備物的量。通過(guò)以下公式確定活性％變化＝％Sa-％Sb其中％Sa是對(duì)照的％S％Sb是用檢測(cè)部分培養(yǎng)后的％S。
將該部分脫鹽以在每次活性檢測(cè)之前和每個(gè)后續(xù)純化步驟之前將硫酸銨的濃度降低20倍。
階段2.將階段1的不純抑制劑在脫鹽后使用離子交換層析(此處為DEAE 23纖維素)上樣和分部分離，然后用乙酸鈉緩沖液(pH6.0)梯度洗脫。
抑制劑的活性部分在3-5mM之間洗脫出。
該柱的體積為1ml，洗脫速度是4ml/小時(shí)。通過(guò)層析Millicrome在230和280nm進(jìn)行檢測(cè)。在5mM乙酸鈉緩沖液中分離并洗脫出表現(xiàn)出最高活性的部分1(參見(jiàn)圖2)(參見(jiàn)表6)。
表6部分1 2 3 4 5活性46.3-046.3-14.1 46.3-42.1 46.3-19.6 46.3-45.1＝46.3％ ＝32.2％ ＝4.2％＝26.7％ ＝1.2％電泳數(shù)據(jù)表明主要的蛋白污染物-白蛋白(參見(jiàn)圖3)被從該部分中除去，導(dǎo)致再純化四倍。
階段3.將階段2的部分純化的抑制劑直接上G-75 Sephadex柱。
該柱的體積是20ml(20×1)，洗脫速率是2ml/小時(shí)。洗脫緩沖液是50mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH7.5。在層析Millichrome上以230和280nm進(jìn)行檢測(cè)。分離具有最高活性的部分5。
表7部分1 2 3 45活性42.2-19.1 42.2-35.2 42.2-21.5 42.2-38.842.2-0＝23.1％＝7.0％ ＝20.7％＝3.4％ ＝42.2％階段4.在Ultrasfera基質(zhì)上使用Pro-REC柱進(jìn)行反相層析(Pharmacia FPLC系統(tǒng))。使用乙腈梯度中的0.1％三氟乙酸洗脫蛋白。
分子量為16-17kD的產(chǎn)物的均一性等于90％，如分析丙烯酰胺/十二烷基磺酸鈉凝膠所示(參見(jiàn)圖6)。結(jié)果呈于圖4。在部分5測(cè)定到活性。該產(chǎn)物的最終收率為5％。結(jié)果，純化后分子量為16kD的蛋白的總量是650ng/ml起始產(chǎn)物。在純化過(guò)程中將該產(chǎn)物于70℃溫育幾分鐘，但未檢測(cè)到生物學(xué)活性損失。
實(shí)施例12B分離大量INPROL的替代方法起始分離將新鮮豬尸體的肋骨除去肌肉纖維和脂肪，然后切成塊，并以1∶1的比例(重量/體積)浸泡于磷酸緩沖鹽水中。用水壓機(jī)壓榨得到的混合物，以從固體骨材料分離骨髓。
收集骨髓細(xì)胞懸浮液并通過(guò)四層干酪包布濾去固體顆粒。將濾液于56℃溫育40分鐘，然后在冰浴中冷卻至4℃。通過(guò)于10,000g于4℃離心30分鐘除去得到的沉淀并將其廢棄。
在30分鐘內(nèi)將該澄清的上清液滴加到10倍體積的含有1％(體積)濃鹽酸的攪拌的冰凍丙酮中。將得到混合物保持于4℃ 16小時(shí)，以使沉淀形成完全。然后通過(guò)于4℃以20,000g離心30分鐘沉淀該沉淀物。用冷丙酮洗滌該沉淀并干燥。
HPLC純化將該沉淀溶解于含有5％乙腈(MeCN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的HPLC洗脫緩沖液A中，使最終蛋白濃度為8-10mg/ml。將該溶液(0.5-0.6ml)上樣至用Polisil ODS-300(10mcm)裝柱并用同樣的緩沖液A平衡的250×4.6mm HPLC柱。
按照以下程序，以1ml/分鐘的流速用緩沖液A中的緩沖液B(90％MeCN、0.1％ TFA)梯度完成洗脫時(shí)間，分鐘 B％004052525 90在再平衡之前，使用另一100％ B的5分鐘的步驟清洗該柱。然后再次平衡該柱，使其回復(fù)至起始狀態(tài)，可以將下一部分蛋白溶液上樣。典型的層析圖譜示于圖5。
在分離期間，于280nm監(jiān)視該柱流出液以檢測(cè)蛋白峰。收集含有該蛋白材料的部分，將分離的峰合并并于30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。將得到的殘留物溶解于蒸餾水并通過(guò)生物活性測(cè)試和通過(guò)SDS-PAGE(14％凝膠，還原條件)檢測(cè)。含有該活性材料的峰在70-80％緩沖液B之間洗脫，并如SDS-PAGE所檢測(cè)含有16kD的蛋白主帶和微量快速移動(dòng)蛋白。
通過(guò)僅收集第二個(gè)HPLC主峰得到的材料的分析示于圖15(A和C)。本文將含有這二個(gè)峰(例如圖5)的材料稱為pINPROL制備物1，那些僅由第二個(gè)峰組成的材料稱為pINPROL制備物2。將500μg的該活性、純化的pINPROL制備物2上樣至C4反相柱(Vydac)，并使用0.1％三氟乙酸中的595％乙腈線性梯度洗脫。該材料于53％乙腈時(shí)做為單峰洗脫(圖15A)。然而，當(dāng)將250μg MIP-1α(R&D Systems)在相同條件下層析時(shí)，它于43.9％乙腈洗脫(圖15B-注意在14％乙腈之前的早峰是假象，系由檢測(cè)器中的氣泡引起)。因此，自然發(fā)生的INPROL在這些條件下比MIP-1α更具疏水性。已知在這些條件下，TGFβ于比pINPROL觀察到的低的濃度下洗脫(Miyazono等，J.Biol.Chem.2636407-15，1988)。
該洗脫pINPROL材料的凝膠示于圖15C。泳道1是粗材料，泳道2是分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，泳道3是該純化材料。有二個(gè)主帶，一個(gè)位于約14kD，一個(gè)位于約35kD。據(jù)信該35kD帶是該14kD帶的多體形式。
實(shí)施例13A活性INPROL制備物含有血紅蛋白β鏈如圖5中所示制備pINPROL(即，pINPROL制備物1(參見(jiàn)實(shí)施例12B))。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將該材料在SDS-PAGE上電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用ABI 477A蛋白測(cè)序儀與120A聯(lián)機(jī)PTH-AA分析儀對(duì)該材料進(jìn)行N末端序列分析。得到以下N末端序列VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....
蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)檢索發(fā)現(xiàn)，該序列與豬血紅蛋白β鏈的N末端序列具有相同性(參看圖16C)。
實(shí)施例13B活性INPROL制備物含有血紅蛋白α鏈如圖15C中所示，通過(guò)收集示于圖5中的第二個(gè)主峰純化的蛋白(即，pINPROL制備物2)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于分子量約15K和30K的二個(gè)主帶以及幾個(gè)小帶。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，并切下各個(gè)條帶并如實(shí)施例13A中所述進(jìn)行N末端序列分析。對(duì)所述15kD條帶得到以下N末端序列
VLSAADKANVKAAWGKVGGQ.....
對(duì)所述30kD條帶進(jìn)行有限的蛋白水解消化并得到以下內(nèi)部序列**FPHFNLSHGSDQVK....
第一個(gè)序列顯示與豬血紅蛋白α鏈的N末端序列有相同性，而第二個(gè)序列顯示與豬血紅蛋白α鏈的第43-56殘基有相同性(參見(jiàn)圖16C有關(guān)人、鼠和豬α和β血紅蛋白鏈的序列比較)。這些條帶以及一些小條帶的重復(fù)測(cè)序一致地產(chǎn)生所述α珠蛋白序列的部分。因此在圖15C中觀察到的各個(gè)條帶代表豬血紅蛋白α鏈的或者片段或者團(tuán)聚體。
實(shí)施例13C豬INPROL的進(jìn)一步表征為進(jìn)一步比較pINPROL與豬血紅蛋白，從Sigma ChemicalCompany得到二度結(jié)晶的豬血紅蛋白，并如實(shí)施例12B中為圖15所述進(jìn)行反相HPLC。如圖17中可見(jiàn)，完整血紅蛋白的HPLC層析譜與pINPROL制備物1的類似。另外，在直接比較中，可見(jiàn)圖17A中顯示的pINPROL制備物2(即，源自圖5的第二個(gè)峰)與豬血紅蛋白(圖17B)的第二個(gè)雙峰重疊，其主峰的保留時(shí)間分別為52.51和52.25分鐘。應(yīng)注意血紅素與血紅蛋白中的第一個(gè)主峰共遷移，在此處的保留時(shí)間為49.153分鐘；因此血紅素是pINPROL制備物1的組分，但不是制備物2的組分。通過(guò)該pINPROL制備物缺少于575nm(診斷血紅素存在的波長(zhǎng))的吸收而證實(shí)這點(diǎn)。
豬血紅蛋白α和β鏈的推測(cè)分子量分別為15038道爾頓和16034道爾頓。正如在圖18中的SDS-PAGE層析譜所見(jiàn)，第一個(gè)雙峰由高分子量鏈組成，第二個(gè)雙峰由低分子量鏈組成。因此第一個(gè)雙峰看起來(lái)代表血紅蛋白β鏈，第二個(gè)雙峰代表血紅蛋白α鏈。
使用小洗脫梯度進(jìn)行了豬血紅蛋白的另一分離(圖21)。這些峰的N末端分析證明第一個(gè)峰是豬α鏈，第二個(gè)峰是豬β鏈。生物檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)這二個(gè)分離的血紅蛋白鏈均具有生物學(xué)活性(例如實(shí)施例14和15)。
為進(jìn)一步比較pINPROL制備物2和血紅蛋白β鏈，進(jìn)行了雙向電泳(圖19)。做為第一向，使用2％ pH4-8安佛林在玻璃管中進(jìn)行等電聚焦9600伏特小時(shí)。使用原肌球蛋白(MW 33kD，pI5.2)做為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)；其位置用箭頭在最終2D凝膠上標(biāo)記。將該管凝膠在緩沖液中平衡，并密封于12.5％丙烯酰胺平板膠頂部的積層凝膠頂部。以12.5mA/凝膠進(jìn)行SDS平板凝膠電泳4小時(shí)。對(duì)該凝膠進(jìn)行銀染和干燥。
所述雙向電泳圖案的比較顯示，在HPLC純化的血紅蛋白β鏈與pINPROL制備物2之間只有一或二個(gè)小點(diǎn)不同。使用抗豬血紅蛋白抗體和或者單向或者雙向電泳的Western分析確認(rèn)在該制備物中存在β血紅蛋白。因此按照實(shí)施例12B制備的活性pINPROL制備物2基本上是豬血紅蛋白β鏈。
實(shí)施例14血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β或完整血紅蛋白表現(xiàn)出干細(xì)胞抑制活性為確認(rèn)血紅蛋白β鏈具有INPROL活性，使用實(shí)施例1中描述的方法、使用如實(shí)施例12B中純化的材料、使用睪酮處理的小鼠骨髓進(jìn)行了自殺檢測(cè)。如表8中所示，15％的正常小鼠骨髓細(xì)胞被殺傷，與之相比，睪酮處理的動(dòng)物中36％被殺傷。同預(yù)期一樣，這表明睪酮處理增加了在循環(huán)中的細(xì)胞百分比(因此使得它們對(duì)殺傷更加敏感-例如，實(shí)施例1)。與之鮮明對(duì)照的是，用濃度為40ng/ml或者pINPROL或者純化的血紅蛋白β鏈溫育的睪酮處理動(dòng)物的細(xì)胞，顯示出分別將循環(huán)中的細(xì)胞的百分比從36％顯著降低至0％和7％。對(duì)這二種蛋白而言更高的200ng劑量的效果較差。做為陽(yáng)性對(duì)照，先前表征化的干細(xì)胞抑制劑MIP-1α將循環(huán)降至13％。
使用循環(huán)狀態(tài)的CFU-MIX而不是CFU-S可以在體外進(jìn)行類似的檢測(cè)。如上述CFU-S檢測(cè)進(jìn)行該檢測(cè)，除了用阿糖胞苷(Ara C，30微克/ml)取代高劑量氚標(biāo)記胸苷做為周期特異性毒性藥物(參見(jiàn)B.I.Lord載于Haemopoiesis-A Practical Approach，N.G.Testa和G.Molineux(編輯)，IRL Press 1993；Pragnell等，載于Culture of Hematopoietic Cells，R.I.Freshney，I.B.Pragnell和M.G.Freshney(編輯)，Wiley Liss 1994)和使用具有高內(nèi)源循環(huán)速率的小鼠品系(Balb/c)取代睪酮處理的BDF1小鼠。如表9中所示，高度純化的豬β鏈或高度純化的豬α鏈在該檢測(cè)中均有活性。注意在該檢測(cè)中，用pINPROL處理的細(xì)胞的循環(huán)水平有時(shí)有負(fù)數(shù)，表明在Ara C處理的庫(kù)中比在未處理的庫(kù)中有更多的集落。
如實(shí)施例2中所述，pINPROL在氚標(biāo)記胸苷攝入檢測(cè)中抑制鼠干細(xì)胞系FDCP-MIX的增殖。圖20證實(shí)，純化的血紅蛋白α或β鏈在該檢測(cè)中均有活性，在小于2ng/ml下觀察到抑制。
前述提供了證據(jù)表明豬血紅蛋白β鏈表現(xiàn)出INPROL活性。其它數(shù)據(jù)(例如表9、圖20)證實(shí)，分離的α鏈以及完整的血紅蛋白作為干細(xì)胞抑制劑亦有活性?；钚灾苽湮镆喟é梁挺骆湹幕旌衔?例如圖5)。
有關(guān)分離的α珠蛋白和/或分離的β珠蛋白具有活性的觀察表明，本文描述的活性不需要完整的三維血紅蛋白結(jié)構(gòu)。α和β鏈的片段作為干細(xì)胞抑制劑和刺激劑亦有活性。
表8處理殺傷％NBM115TPBM236pINPROL 200ng/ml 2340ng/ml 0Hbg3200ng/ml2540ng/ml 7MIP-1α 200ng/ml 131NBM＝正常骨髓2TPBM＝睪酮處理小鼠的骨髓3Hbg＝C4反相純化的血紅蛋白β鏈(源自2次結(jié)晶的豬血紅蛋白)
表9處理％殺死對(duì)照143豬α鏈2-4豬β鏈2-141對(duì)照-Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml(如圖21中純化)實(shí)施例15純化的INPROL、純化的豬α血紅蛋白或純化的豬β血紅蛋白在體內(nèi)有活性為測(cè)試純化的豬血紅蛋白鏈在體內(nèi)作用的能力，如實(shí)施例1所述用丙酸睪酮注射BDF1小鼠。24小時(shí)后，小鼠靜脈內(nèi)接受500ng或者pINPROL、豬血紅蛋白α鏈(如圖21中純化自外周血細(xì)胞)、豬β鏈(如圖21中純化自外周血細(xì)胞)或者等體積的載體。48小時(shí)后，從每只小鼠收集骨髓，并如實(shí)施例14所述進(jìn)行CFU-MIX檢測(cè)。如表10中顯示，pINPROL、豬α鏈和豬β鏈在體內(nèi)均有活性，將循環(huán)中的CFU-MIX百分比降至基礎(chǔ)水平。
表10處理殺傷％對(duì)照145pINPROL25豬α鏈25豬β鏈2-5基礎(chǔ)341對(duì)照-睪酮處理BDF1小鼠骨髓2100ng/ml3基礎(chǔ)-未處理BDF1小鼠骨髓實(shí)施例16純化的人血紅蛋白α鏈、生物素酰基化人血紅蛋白α鏈、生物素?；搜t蛋白β鏈、人血紅蛋白γ鏈和人血紅蛋白δ鏈均在體外表現(xiàn)出干細(xì)胞抑制活性或者從Sigma Chemical Corporation或者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從成人外周血或臍帶血分離得到人血紅蛋白。以與上述分離豬α和β鏈的類似方式，通過(guò)反相HPLC分離各個(gè)鏈(參見(jiàn)B.Masala和L.Manca，酶學(xué)方法第231卷第21-44頁(yè)，1994)。得到純化的α、β、γ和δ鏈。對(duì)于生物素?；梁挺骆湥?7μg NHS LC生物素(Pierce)處理1mg成人血紅蛋白，并如上述通過(guò)反相層析分離這些鏈。
如表11、12和13中所示，純化的人α、生物素酰基化人α、生物素酰基化人β、人γ和人δ血紅蛋白鏈在該CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中均有活性。
表11處理殺傷％對(duì)照149人α鏈2-1人β鏈241人γ鏈2-631對(duì)照-Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml表12處理殺傷％對(duì)照147人γ鏈212人δ鏈2-41對(duì)照-Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml
表13處理殺傷％對(duì)照168人α鏈219生物素酰基化α鏈27人β鏈255生物素?；骆?251對(duì)照-Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml實(shí)施例17純化的人α鏈、α-β二聚體或血紅蛋白在體內(nèi)有活性在如實(shí)施例15中描述的體內(nèi)檢測(cè)中測(cè)試純化的人α鏈、α-β二聚體或血紅蛋白。如表14中所示，它們?cè)跐舛葹?00ng/小鼠時(shí)均有活性。
表14處理殺傷％對(duì)照149人α鏈 -22人α-β二聚體14人血紅蛋白 -311對(duì)照-睪酮處理的BDF1小鼠骨髓實(shí)施例18豬INPROL在體外對(duì)人單核細(xì)胞或CD34+臍帶血細(xì)胞有活性為調(diào)查從豬骨髓純化的INPROL對(duì)人祖代細(xì)胞循環(huán)的影響，得到了臍帶血細(xì)胞。使用或者在Ficoll上分離后得到的總單核細(xì)胞部分、或者在抗CD34親和柱(CellPro Inc.)分級(jí)分離得到的CD34+部分。在存在白介素3(IL-3)和干細(xì)胞因子(SCF)(各100ng/ml)的情況下，將細(xì)胞在體外溫育48小時(shí)以確保早干細(xì)胞處于循環(huán)。在該預(yù)溫育后，如實(shí)施例14中關(guān)于小鼠的描述進(jìn)行循環(huán)檢測(cè)，除了在鋪平板后18天時(shí)計(jì)數(shù)CFU-GEMM(而不是CFU-MIX)。如表15中所示，豬INPROL抑制或者在總單核細(xì)胞中的或者在該CD34+部分中的CFU-GEMM循環(huán)。
表15處理殺傷％單核細(xì)胞對(duì)照 93pINPROL116CD34+細(xì)胞對(duì)照 41pENPROL1211100ng/ml實(shí)施例19純化的人α血紅蛋白對(duì)人CFU-GEMM有活性如實(shí)施例18中所述得到人臍帶血單核細(xì)胞并在IL-3和SCF中溫育，并用于循環(huán)檢測(cè)。如表16中所示，純化自骨髓的豬INPROL和純化自外周血的人α血紅蛋白均在該檢測(cè)中有活性。
表16處理殺傷％對(duì)照 100pINPROL1-6人α鏈1-231100ng/ml
實(shí)施例20從人α血紅蛋白和從人β血紅蛋白序列得到的肽有活性為鑒別活性肽序列，使用計(jì)算機(jī)模型程序，將肌紅蛋白(它在本檢測(cè)中無(wú)活性)的三維結(jié)構(gòu)重疊(superimpose)于存在于成人血紅蛋白中的α鏈的天然三維結(jié)構(gòu)之上。鑒別了在該CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中有活性的二個(gè)肽(代表氨基酸43-55和64-82，它們是在三維空間與肌紅蛋白結(jié)構(gòu)不同的區(qū))。為更接近在天然α鏈中發(fā)現(xiàn)的環(huán)，亦合成了該43-55肽的環(huán)衍生物(c43-55)(利用一個(gè)二硫鍵)并發(fā)現(xiàn)它有活性。
這些肽的序列如下43-55Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val(“肽43-55”)c(43-55)Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys(其中二個(gè)Cys殘基由二硫鍵連接)(“環(huán)肽43-55”)64-82 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala(“肽64-82”)測(cè)試了二個(gè)hemorphin序列即hemorphin 10(所述β鏈序列的氨基酸32-41)和heomrphin 7(氨基酸33-40)，并發(fā)現(xiàn)它們有活性。
這些序列如下Hemorphin 10Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-PheHemorphi.n 7Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg為測(cè)試這些序列的活性，如實(shí)施例14中所述進(jìn)行CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)。如表17-19中所示，這些肽在該檢測(cè)中均有活性。
表17處理殺傷％對(duì)照 47pINPROL10肽(43-55)100ng/ml 210ng/ml181ng/ml 111100ng/ml表18處理殺傷％對(duì)照 43肽(43-55)15肽(64-82)19Hemorphin1011Hemorphin7101所有的肽均在100ng/ml下測(cè)試表19處理殺傷％對(duì)照 47環(huán)肽(43-55)101在100ng/ml下測(cè)試實(shí)施例21通過(guò)甲酸切割從人α血紅蛋白得到的肽片段具有活性人α紅蛋白鏈在氨基酸位置94和95(Asp-Pro)之間有甲酸切割位點(diǎn)。通過(guò)將純化的人α鏈(如實(shí)施例16中)以1mg/ml的濃度在70％甲酸中于37℃保溫72小時(shí)得到切割。如實(shí)施例16通過(guò)反相HPLC，從未切割的α鏈和所述95-141片段純化所述1-94片段；使用SDS-PAGE(如實(shí)施例22中)進(jìn)行分級(jí)分離。通過(guò)電噴電離質(zhì)譜法確認(rèn)所述純化的1-94蛋白片段的身份。
為評(píng)價(jià)該片段的干細(xì)胞抑制活性，如在實(shí)施例14中使用CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)表20處理殺傷％對(duì)照150人α2121-94片段301Balb/c骨髓2純化的、非重組人α血紅蛋白，如在實(shí)施例16中(100ng/ml)3純化的甲酸切割的蛋白，如在本實(shí)施例中(100ng/ml)實(shí)施例22血紅蛋白α鏈、多肽1-141、多肽1-97、肽43-55和肽c(43-55)在大腸桿菌中做為遍在蛋白融合物表達(dá)按照最佳大腸桿菌密碼子使用，通過(guò)退火相應(yīng)的寡核苷酸合成肽43-55(“p13”)和c45-55(“p15”)(如在實(shí)施例20中)的基因(Anderssen和Kurland，Micro.Reviews 54198-210，1990)。通過(guò)設(shè)計(jì)一套寡聚物，以從人骨髓cDNA庫(kù)(Clontech，Palo Alto，CA)PCR擴(kuò)增而得到完整人α血紅蛋白鏈(“p141”)的基因。在適當(dāng)亞克隆后，通過(guò)PCR擴(kuò)增含有該p141基因的質(zhì)粒得到該1-97片段(“p1-97”)的基因?qū)⑸鲜龌蜃鰹楸樵诘鞍兹诤系鞍妆磉_(dá)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,132,213；5,196,321和5,391,490和PCT WO 91/17245)。宿主菌株大腸桿菌DH5αF’IQ(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)用含有適當(dāng)合成的基因(上述)的遍在蛋白表達(dá)載體pDSUb轉(zhuǎn)化。pDSUb是表達(dá)人遍在蛋白的pDS78/RBSII(圖22A)(Hochuli等，Biotechnology 61321-5，1988)的衍生物。Loetshcer等(JBC 26611213-11220，1991)通過(guò)從所述Hochuli質(zhì)粒切除氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)序列并再連接該質(zhì)粒(圖22B)修飾了pDS27/RBSII。通過(guò)成對(duì)退火具有為細(xì)菌表達(dá)而優(yōu)化的密碼子使用、編碼人遍在蛋白的激酶化(kinased)合成寡核苷酸，構(gòu)建合成的遍在蛋白基因。然后通過(guò)將該含有裝配寡核苷酸的合成遍在蛋白基因插入該衍生的pDS78/RBSII的Klenow平端化Bam H1-Bgl II消化物構(gòu)建pDSUb。得到的質(zhì)粒pDSUb(圖22C)顯示在大腸桿菌中以高水平表達(dá)遍在蛋白。
在定向克隆中，通過(guò)將Afl II-Pst I消化的編碼所述p97或p141蛋白的PCR產(chǎn)物和融合連接插入已用AflII和Pst I消化的pDSUb，構(gòu)建含有p97的質(zhì)粒和含有p141的質(zhì)粒。類似地，通過(guò)將激酶化的和退火的帶有適當(dāng)粘性末端并編碼該肽的寡核苷酸和融合連接插入Afl II-Pstt I消化的pDSUb，構(gòu)建含有p13的質(zhì)粒和含有p15的質(zhì)粒。
用100μg/ml氨芐青霉素、5μg/ml新霉素選擇轉(zhuǎn)化體，于30℃二天后菌落出現(xiàn)。通過(guò)跨越該插入位點(diǎn)的PCR篩選轉(zhuǎn)化體。然后通過(guò)SDS-PAGE篩選含有正確尺寸插入片段的菌落表達(dá)適當(dāng)尺寸的融合蛋白(參見(jiàn)以下)。通過(guò)加入滴定lac阻抑物的IPTG、將其從pDSUb啟動(dòng)子中除去，過(guò)量表達(dá)遍在蛋白融合物(DH5αF’IQ在F’因子含有一向上調(diào)節(jié)的lacIq基因，用10μg/ml新霉素選擇的)。
從表現(xiàn)過(guò)量表達(dá)的誘導(dǎo)的遍在蛋白融合蛋白的克隆制備質(zhì)粒DNA，使用測(cè)序酶2.0版本藥盒(United States Biochemical.)通過(guò)雙脫氧方法進(jìn)行測(cè)序。然后將陽(yáng)性克隆冷凍并在甘油中儲(chǔ)存于-80℃。將陽(yáng)性克隆在30℃保持于含有氨芐青霉素(100μg/ml)、新霉素(10μg/ml)和1％葡萄糖的LB平板上。每周將其劃線接種直至10次傳代，然后從冷凍種子小瓶中取出新鮮劃線物進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以確保菌株可靠性。
為得到用于檢測(cè)的蛋白，將250ml搖瓶中的100ml起始培養(yǎng)物通過(guò)在含有氨芐青霉素(100μg/ml)、新霉素(10μg/ml)和1％葡萄糖的2xYT培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(16-20小時(shí))由單菌落生長(zhǎng)。將搖瓶培養(yǎng)物在New Brunswick環(huán)境振蕩培養(yǎng)箱中保持于30℃和250rpm。次日早晨將該培養(yǎng)物用培養(yǎng)基稀釋至1升。于OD600＝0.5通過(guò)加入IPTG至1mM(終稀釋度)誘導(dǎo)細(xì)胞，并于OD600＝0.8通過(guò)離心收獲細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞再懸浮于低滲裂解緩沖液(100μl 50mM Tris，pH 10.0)中。然后通過(guò)對(duì)該懸浮液進(jìn)行三周期的冷凍-融化(用干冰-乙醇浴進(jìn)行冷凍，于60℃融化)裂解所述細(xì)菌細(xì)胞。然后對(duì)該懸浮液進(jìn)行超聲處理10分鐘，并于12,000g離心10分鐘。將得到的上清液命名為“S1”。將細(xì)胞沉淀再懸浮于50mM Tris，pH10和2x SDS麥黃酮上樣緩沖液(Novex，San Diego，CA)(1∶1)。然后將該混合物于95℃加熱15分鐘，并于12,000g離心10分鐘。將以這種方式可以再溶解的沉淀部分稱為“P1”。將得自剩余沉淀的沉淀部分稱為“P2”。如對(duì)P1那樣，將P2再懸浮于上樣緩沖液。通過(guò)SDS-PAGE分析來(lái)自S1、P1和P2的樣品。
用10-20％tricine凝膠(Novex)在小凝膠裝置中使用二個(gè)tricine緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。陽(yáng)極(底部)緩沖液是0.2M Tris，pH9.0。陰極(頂部)緩沖液是0.1M Tris、0.1M麥黃酮、0.1％ SDS，pH8.25。使用市售分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物“Multi-Mark”(Novex)。從Sigma購(gòu)買做為標(biāo)準(zhǔn)的牛遍在蛋白。以4mA的恒定電流進(jìn)行凝膠電泳，直至染料標(biāo)記到達(dá)凝膠底部。用含0.25％考馬斯藍(lán)R250(Sigma)的乙酸∶甲醇(10％∶40％)將凝膠染色，并在缺乏該染料的同樣溶液中脫色。
在細(xì)菌裂解液離心后的沉淀(P1和P2)中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(＞70％)完整的p141-遍在蛋白融合蛋白。與之鮮明對(duì)照，在可溶性部分(S1)中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(＞70％)p97-遍在蛋白融合蛋白。這證實(shí)除去C末端疏水性區(qū)產(chǎn)生具有改進(jìn)溶解度特性的產(chǎn)物。類似地，p13和p15肽亦包含于可溶性部分中。
在用于轉(zhuǎn)化宿主菌株BL21/DE3的pRSET(Invitrogen，San Diego，CA)中表達(dá)UCH-L3遍在蛋白酶(ubiquinase)(Recksteiner，M.(編輯)Ubiquitin，Plenum Press(紐約)1988；Wilkinson等，Science 246670-73，1989)。UCH-L3是在遍在蛋白C末端延伸處切割的遍在蛋白特異性蛋白酶。通過(guò)35％(w/v)硫酸銨沉淀，從細(xì)菌裂解液中將其部分純化。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)25.5kD條帶的存在，監(jiān)視使用的硫酸銨的準(zhǔn)確百分比。將上清液對(duì)50mM Tris，pH7.4透析，并對(duì)遍在蛋白肽融合物底物檢測(cè)。將活性上清液分成等份并冷凍于-20℃。典型的反應(yīng)混合物含有3μl裂解液、1μl 1M DTT、1μl UCH-L3(如上述)和5μl反應(yīng)緩沖液(50mM Tris，pH7.4)。于室溫進(jìn)行反應(yīng)20分鐘。對(duì)于大規(guī)模消化，將300μl裂解液與100μl 1M DTT、20μl UCH-L3和580μl反應(yīng)緩沖液混合。
如實(shí)施例16中通過(guò)反相HPLC進(jìn)一步純化包含于可溶性(S1)部分中的肽或蛋白；通過(guò)SDS-PAGE監(jiān)測(cè)部分，并通過(guò)電噴電離質(zhì)譜法確認(rèn)其身份(參見(jiàn)下述)。如上述用UCH-L3酶促消化所純化的肽或蛋白，產(chǎn)生非遍在蛋白化(non-ubiquinated)終產(chǎn)物。然后通過(guò)反相HPLC再純化該酶切物質(zhì)。純化后進(jìn)行SDS-PAGE，并通過(guò)電噴電離質(zhì)譜法確認(rèn)終產(chǎn)物的身份。
如上述用UCH-L3體外酶切的替代方法是在與表達(dá)所需遍在蛋白融合物的同一細(xì)菌中共表達(dá)遍在蛋白切割酶。為此目的，使用表達(dá)ubiquinase UBP1的載體(pJT184)(Tobias和Varshavsky，JBC 26612021-12028，1991)。共表達(dá)p97遍在蛋白融合物和UBP1的細(xì)菌在體內(nèi)表現(xiàn)出完全消化該融合蛋白；共表達(dá)p141遍在蛋白融合物和UBP1的細(xì)菌表現(xiàn)出部分(約70％)消化該融合蛋白。通過(guò)如上述硫酸銨沉淀接著用反相HPCL純化該體內(nèi)消化的p97蛋白。
為確認(rèn)所述表達(dá)和純化的多肽的身份，使用配有四極分析儀的VG Biotech BIO-Q儀器進(jìn)行電噴電離質(zhì)譜法。使用肌紅蛋白校正該儀器。用純化的p97得到的主要組分是分子量為10,339道爾頓的單峰；這可與計(jì)算分子量10,347很好地相匹配，確認(rèn)了該重組p97片段的身份。
實(shí)施例23重組p1-97保持干細(xì)胞抑制活性為評(píng)價(jià)重組p1-97的生物活性，如實(shí)施例18使用CFU-GEMM循環(huán)檢測(cè)表21處理殺傷％對(duì)照162人α211p97301人骨髓單核細(xì)胞2純化的非重組人α血紅蛋白，如在實(shí)施例16中(100ng/ml)3純化的重組p97，如在實(shí)施例22中(100ng/ml)實(shí)施例24人α血紅蛋白和肽43-55在睪酮或5-氟尿嘧啶(5FU)處理的小鼠中體內(nèi)抑制CFU-MIX循環(huán)為評(píng)價(jià)肽43-55在體內(nèi)的干細(xì)胞抑制活性，如實(shí)施例1中所述用丙酸睪酮或用5FU預(yù)處理B6D2 F1小鼠。具體地說(shuō)，在第0天將丙酸睪酮(100mg/kg體重)腹膜內(nèi)注射?；蛘撸?FU(200μg/kg體重)于0天注射小鼠。
24小時(shí)后(第1天)，靜脈注射各種劑量的肽43-55或載體。在第2天收獲骨髓并如實(shí)施例14進(jìn)行CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)。具體地說(shuō)，殺死小鼠，并從股骨制備單細(xì)胞骨髓懸浮液。清洗細(xì)胞一次，并在Fischer培養(yǎng)基中將濃度調(diào)整為5×106細(xì)胞/ml。對(duì)于每個(gè)測(cè)試條件，將一毫升細(xì)胞加入二個(gè)聚丙烯管中的每個(gè)。將所述管在無(wú)(“對(duì)照”)或有(“實(shí)驗(yàn)”)適當(dāng)濃度測(cè)試物質(zhì)的情況下于37℃溫育3小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，將30μg/ml阿糖胞苷(“Ara C”(Sigma))加入一半的管中，并將相同體積的Fischer培養(yǎng)基加入另一半管中。將這些管于37℃再溫育1小時(shí)，然后將其置于冰上并用冷Fischer培養(yǎng)基清洗二次。
將細(xì)胞在Fischer培養(yǎng)基中再調(diào)整至5×104-106/ml，并將0.5ml細(xì)胞懸浮液加入5ml Methocult M3430甲基纖維素培養(yǎng)基(Stem CellTechnologies，Vancouver，British Columbia)中。用渦旋混合器劇烈混合該混合物，并將1ml分配入5個(gè)35mm平皿中的每個(gè)。然后將這些35mm平皿與一敞開(kāi)的含有無(wú)菌水的35mm平皿一起置于蓋住的150mm平皿中。于37℃培養(yǎng)7天后使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)CFU-MIX集落。
按照以下公式，用培養(yǎng)基處理的與用Ara C處理的管的集落數(shù)量之差代表在該條件下循環(huán)中細(xì)胞的百分比%S=a-ba×100%]]>其中a＝僅用培養(yǎng)基溫育的管中的CFU-MIX數(shù)量b＝用Ara C溫育的管中的CFU-MIX數(shù)量表22處理殺傷％對(duì)照35人α鏈(500ng)213肽43-55(0.5ng)201睪酮預(yù)處理的動(dòng)物2每20g小鼠靜脈注射的量表231處理殺傷％對(duì)照62人α鏈(500ng)20肽43-55(0.5ng)23環(huán)肽43-55(0.5ng)21415FU預(yù)處理的動(dòng)物2每20g小鼠靜脈注射的量實(shí)施例25當(dāng)于N末端Phe(Phe43)生物素?；蛴赑he43或Phe46碘化時(shí)肽43-55做為干細(xì)胞抑制劑有活性通過(guò)固相肽合成技術(shù)(American Peptide Co.，Sunnyvale，CA)合成肽43-55。合成肽類似物使碘位于Phe43或Phe46的對(duì)位。通過(guò)將生物素的COOH利用C4碳接頭與Phe43的N末端NH2連接，合成生物素?；?3-55。
表24處理殺傷％對(duì)照 31肽43-55(1ng/ml)8生物素酰基化肽43-55(1ng/ml)15
實(shí)施例26嗎啡于體外抑制鼠CFU-MIX循環(huán)如在實(shí)施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中測(cè)試嗎啡表25處理殺傷％對(duì)照44人α鏈(100n/ml) 0嗎啡(10-7M)10(10-9M)15(10-11M) 32實(shí)施例27阿片制劑肽DAMGO和DALDA于體外抑制鼠CFU-MIX循環(huán)如在實(shí)施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中測(cè)試DAMGO和DALDA表26處理殺傷％對(duì)照33DAMGO(10-5M) 15(10-7M) 0(10-9M) 38DALDA(10-5M) 47(10-7M) 0(10-9M) 34
實(shí)施例28傷害感受肽于體外抑制鼠CFU-MIX循環(huán)如在實(shí)施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中測(cè)試傷害感受肽表27處理殺傷％對(duì)照31肽43-55(1ng/ml) 8傷害感受肽(10-7M) 6(10-9M) 0實(shí)施例29納洛酮拮抗人α和δ血紅蛋白鏈、Hemorphin10和肽43-55的抑制活性如在實(shí)施例24中進(jìn)行CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)。檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)自身或在納洛酮(10-5-10-7M)的存在下檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)。在這些濃度下納洛酮自身對(duì)該檢測(cè)無(wú)影響。
表28處理殺傷％對(duì)照38納洛酮136人α(100ng/ml) 0”+納洛酮152肽43-55(10ng/ml)6”+納洛酮150Hemorphin 10(100ng/ml) 0”+納洛酮1361在10-5M終濃度下使用表29處理殺傷％對(duì)照32人δ(100ng/ml) 10”+納洛酮1311在10-7M終濃度下使用實(shí)施例30低濃度納洛酮抑制鼠CFU-MIX循環(huán)如實(shí)施例24進(jìn)行CFU-MIX檢測(cè)。
表30處理殺傷％對(duì)照38人α(100ng/ml) 0納洛酮(10-10M) 0實(shí)施例31μ阿片制劑受體拮抗劑CTOP拮抗人血紅蛋白α鏈、肽43-55和肽64-82的抑制活性CTOP(H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2，在Cys2和Pen7之間有二硫鍵)是μ阿片制劑受體特異性拮抗劑生長(zhǎng)抑素的類似物。檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)自身或在CTOP(10-7M)的存在下檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)。CTOP自身在該濃度對(duì)該檢測(cè)無(wú)影響，但卻拮抗由α血紅蛋白或肽43-55引起的細(xì)胞周期抑制。
表31處理殺傷％對(duì)照42CTOP136人α(100ng/ml) 0”+CTOP120肽43-55(10ng/ml)8”+CTOP1211在10-7M終濃度下使用實(shí)施例32用人α鏈預(yù)處理增加了晚形成圓石形成細(xì)胞(Cobblestone-Forming Cell)的數(shù)量如Ploemacher和同事所述(Ploemacher等，Blood 742755-63，1989；van der Sluijs等，Exp.Hematol.18893-6，1990；Ploemacher等，Blood782527-33，1991；Ploemacher等，J.Tiss.Cult.Meth.1363-68，1991；Down和Ploemacher，Exp.Hematol.21213-21，1993)進(jìn)行圓石檢測(cè)。圓石檢測(cè)測(cè)定在單層基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞組(或“圓石”)的出現(xiàn)。非常原始的干細(xì)胞在軟瓊脂中不形成集落，但在存在基質(zhì)單層時(shí)形成圓石。將形成圓石的細(xì)胞稱為“圓石區(qū)形成細(xì)胞”(CAFC)。更加分化的(例如GM-CFC)祖代形成瞬時(shí)圓石，所述圓石在培養(yǎng)的前幾周內(nèi)出現(xiàn)然后消失，而更加原始的干細(xì)胞(例如長(zhǎng)期種群恢復(fù)細(xì)胞)形成的圓石僅在培養(yǎng)4-5周后出現(xiàn)。因此，在培養(yǎng)第7-14天時(shí)形成的CAFC富含CFU-GM，在第28-35天時(shí)形成的CAFC富含CFU-MIX，在第28-35天時(shí)形成的CAFC富含長(zhǎng)期種群恢復(fù)細(xì)胞。
如在實(shí)施例24中用丙酸睪酮處理B6D2F1小鼠。次日取出骨髓，并用或不用人α血紅蛋白鏈(100ng/106細(xì)胞)溫育4小時(shí)，然后將其鋪平板于圓石檢測(cè)中。使用的檢測(cè)包括在96孔板中限制性稀釋長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物(LTBMC)。通過(guò)讓FBMD-1鼠基質(zhì)細(xì)胞系(Breems等，Leukemia11142-50，1997)生長(zhǎng)直至連合制備該培養(yǎng)物；將具有匯合單層的96孔平板(96-well plates plates with confluent monolayer)儲(chǔ)存于33℃直至檢測(cè)。將鼠骨髓細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸浮液，并將0.2ml LTBMC培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies，Vancouver)中的以下稀釋度的細(xì)胞鋪于每個(gè)孔中27,000；9000；3000；1000；333。每種條件的每個(gè)稀釋度鋪20個(gè)孔并分布于二個(gè)板上。
如前述(Ploemacher等，Blood 782527-33，1991；Ploemacher等，J.Tiss.Cult.Meth.1363-68，1991；Breems等，Leukemia 81095-104，1994)計(jì)算圓石區(qū)形成細(xì)胞(CAFC)的頻率。結(jié)果示于圖23中。用人α血紅蛋白鏈預(yù)溫育循環(huán)干細(xì)胞將晚形成CAFC的比例提高約5倍。用α鏈處理非循環(huán)干細(xì)胞無(wú)任何效果。
實(shí)施例33人α血紅蛋白和肽43-55、環(huán)形43-55和64-82抑制人臍帶血CFU-GEMM循環(huán)如在實(shí)施例19中進(jìn)行人臍帶血CFU-GEMM循環(huán)檢測(cè)。具體地說(shuō)，從人臍帶血細(xì)胞分離單核細(xì)胞，并在添加了10％FBS、100ng/ml藥盒配體和100ng/ml人IL-3的IMDM組織培養(yǎng)基中調(diào)整至2-4×104細(xì)胞/ml。將所述細(xì)胞于37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
培養(yǎng)后，清洗細(xì)胞并以106細(xì)胞/ml的濃度再懸浮于無(wú)血清IMDM。將1ml細(xì)胞加入每種條件的二個(gè)聚丙烯管中的每個(gè)，并如實(shí)施例24中對(duì)小鼠骨髓那樣進(jìn)行循環(huán)檢測(cè)。用Ara C溫育后，用冷IMDM清洗細(xì)胞并調(diào)整至每0.5ml IMDM 10,000-20,000細(xì)胞，并與5ml MethocultH4433(Stem Cell Technologies)混合?；蛘撸褂肕ethocult H4435甲基纖維素培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies)，其中細(xì)胞濃度調(diào)整至每0.5mlIMDM 2500-5000細(xì)胞。將細(xì)胞如實(shí)施例24中鋪平板，并于第14-18天記錄CFU-GEMM集落。
表32處理殺傷％對(duì)照52人α(100ng/ml) 0肽43-55(1ng/ml) 20(10ng) 12(100ng) 5環(huán)肽43-55(1ng/ml) 32(10ng) 0(100ng)11肽64-82(1ng/ml) 21(10ng) 20(100ng) 39實(shí)施例34人α血紅蛋白和肽43-55抑制成人骨髓CFU-GEMM循環(huán)使用CellPro柱，從人骨髓純化后從Poietic Technologies(Gaithersburg，MD)得到CD34+干細(xì)胞。將細(xì)胞用藥盒配體和IL-3溫育48小時(shí)，并用于實(shí)施例26中的CFU-GEMM循環(huán)檢測(cè)。
表33處理殺傷％對(duì)照47人α鏈(ng/ml) 0肽43-55(ng/ml) 0實(shí)施例35動(dòng)員的人外周血中的CFU-GEMM積極地循環(huán)并可以被人α血紅蛋白、肽43-55、DAMGO或嗎啡抑制按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從正在進(jìn)行用環(huán)磷酰胺和G-CSF外周干細(xì)胞動(dòng)員的乳腺癌患者得到外周血。用Ficoll Hypaque除去紅細(xì)胞(用IMDM將細(xì)胞1∶1稀釋，并將20ml鋪層于16ml Ficoll頂部，于800g離心30分鐘；從界面移出單核細(xì)胞并在IMDM中清洗二次)。在一種情況下，將單核細(xì)胞于檢測(cè)前冷凍儲(chǔ)存于液氮中。如在實(shí)施例26中將單核細(xì)胞鋪平板以進(jìn)行CFU-GEMM循環(huán)檢測(cè)，除了每個(gè)平皿鋪2.5-5×105細(xì)胞。
表34處理殺傷％對(duì)照(患者#1)48人α鏈(100ng/ml)0表35處理殺傷％對(duì)照(患者#2)167人α鏈(ng/ml) 2肽43-55(10ng/ml)0嗎啡(10-7M)24”(10-9M) 0DAMGO(10-7M) 15”(10-9M) 0表36處理殺傷％對(duì)照(患者#3)129肽43-55(0.1ng/ml) 23”(1.0ng/ml)0”(10ng/ml) 151來(lái)自檢測(cè)前冷凍儲(chǔ)存的細(xì)胞實(shí)施例36高劑量人α或β血紅蛋白、肌紅蛋白、肽1-97、肽43-55、肽64-82、傷害感受肽或DALDA刺激靜止鼠干細(xì)胞循環(huán)檢測(cè)μg/ml劑量的血紅蛋白鏈、肌紅蛋白和肽對(duì)靜止干細(xì)胞的刺激。從如實(shí)施例24中的CFU-MIX循環(huán)檢測(cè)中測(cè)試的未處理B6D2F1得到骨髓。從未處理B6D2F1小鼠分離的干細(xì)胞一般緩慢循環(huán)，除非受刺激(例如被丙酸睪酮刺激(參見(jiàn)實(shí)施例1)或諸如5FU的化療(參見(jiàn)實(shí)施例4))進(jìn)入周期。
表37處理殺傷％對(duì)照3人α鏈(1μg/ml) 0(10μg/ml)24(100μg/ml) 40表38處理殺傷％對(duì)照9人β鏈(μg/ml) 55人肌紅蛋白(μg/ml) 30
表39處理殺傷％對(duì)照3人α鏈(100μg/ml) 41DALDA(10-5M) 24(10-3M) 41DALDE(10-5M) 0(10-3M) 0表40處理殺傷％對(duì)照0人α鏈(100μg/ml) 30肽43-55(10μg/ml) 26表41處理殺傷％對(duì)照16肽1-97(10μg/ml)62”(10μg/ml)41表42處理殺傷％對(duì)照4肽64-82(1μg/ml)25傷害感受肽(10-5M) 36
實(shí)施例37靜脈注射高劑量人α血紅蛋白刺激靜止鼠干細(xì)胞循環(huán)將人α血紅蛋白靜脈注射入未處理B6D2F1小鼠。24小時(shí)后，殺死小鼠，從股骨收集骨髓，并如實(shí)施例24中進(jìn)行CFU-MIX檢測(cè)。
表43處理殺傷％對(duì)照(未處理) 0培養(yǎng)基(注射對(duì)照) 0人α鏈(150μg/小鼠)48實(shí)施例38納洛酮拮抗高劑量人α血紅蛋白、肽43-55的干細(xì)胞刺激活性表44處理殺傷％對(duì)照 6人α鏈(100ng/ml) 48”+納洛酮101于10-7M終濃度下使用***雖然已用推薦實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到變化和修改。因此，所附權(quán)利要求書(shū)覆蓋要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這種相等的變化。
權(quán)利要求
1.藥用組合物，它包含由人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94組成的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
2.抑制干細(xì)胞增殖的方法，包括用干細(xì)胞增殖抑制量的包含血紅蛋白α鏈的多肽接觸造血細(xì)胞，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽和具有序列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr的肽。
4.刺激B細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，它包括用生長(zhǎng)刺激量的包含血紅蛋白α鏈的多肽接觸造血細(xì)胞，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
5.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物中癌癥的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失，所述多肽與放療或化療結(jié)合施用。
6.如權(quán)利要求5中的用途，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
7.如權(quán)利要求5中的用途，其中放療或化療以及施用所述肽重復(fù)一次或多次。
8.如權(quán)利要求5中的用途，其中多肽的施用是在放療或化療之后進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求5中的用途，其中多肽的施用是在放療或化療進(jìn)行24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行的。
10.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失，所述多肽是與化療或放射處理，以及重度骨髓抑制性治療結(jié)合在活體外施用到造血細(xì)胞的。
11.如權(quán)利要求10中的用途，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
12.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于在暴露于損害或破壞干細(xì)胞的藥物的哺乳動(dòng)物中抑制干細(xì)胞分裂的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
13.如權(quán)利要求12中的用途，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽和具有序列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr的肽。
14.如權(quán)利要求12中的用途，其中所述藥物是抗病毒劑。
15.在活體外保持哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞的方法，包括用干細(xì)胞增殖抑制量的包含血紅蛋白α鏈的多肽接觸造血細(xì)胞，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
16.如權(quán)利要求15中的方法，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽和具有序列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr的肽。
17.如權(quán)利要求15中的方法，其中所述造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、動(dòng)員的外周血細(xì)胞、胎肝和臍帶血細(xì)胞。
18.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于在患有骨髓增殖性或自免疫疾病或上皮干細(xì)胞高增殖的哺乳動(dòng)物中治療骨髓增殖性或自免疫疾病或上皮干細(xì)胞高增殖的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
19.如權(quán)利要求18中的用途，其中所述骨髓增殖性疾病是骨髓發(fā)育不良綜合癥。
20.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于在哺乳動(dòng)物中區(qū)別保護(hù)正常干細(xì)胞而不保護(hù)癌癥細(xì)胞免受化療或放射的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
21.如權(quán)利要求20中的用途，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽和具有序列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr的肽。
22.如權(quán)利要求20中的用途，其中在通過(guò)暴露于細(xì)胞毒性藥物或放射誘導(dǎo)所述正常干細(xì)胞增殖后給予所述多肽。
23.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于疫苗接種哺乳動(dòng)物的輔助劑的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
24.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于治療患有由干細(xì)胞高增殖引起的免疫抑制的哺乳動(dòng)物的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
25.包含血紅蛋白α鏈的多肽在制備用于在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行基因治療的藥物中的用途，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失，所述多肽在活體外接觸用預(yù)定的基因轉(zhuǎn)染的造血細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25中的用途，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
27.如權(quán)利要求25中的用途，其中所述造血細(xì)胞用至少一種刺激性細(xì)胞因子處理，以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖。
28.進(jìn)行活體外干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，包括用包含血紅蛋白α鏈的多肽和至少一種刺激性細(xì)胞因子接觸造血細(xì)胞，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失。
29.如權(quán)利要求28中的方法，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
30.如權(quán)利要求28中的方法，其中所述造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、動(dòng)員的外周血細(xì)胞、胎肝和臍帶血細(xì)胞。
31.藥用組合物，包含(a)包含血紅蛋白α鏈的多肽，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失和(b)至少一種抑制性化合物，選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽焦Glu-Glu-Asp-Cys-Lys、四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
32.如權(quán)利要求31中的藥用組合物，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
33.藥用組合物，包含(a)包含血紅蛋白α鏈的多肽，所述血紅蛋白α鏈中C末端疏水結(jié)構(gòu)域或C末端觸珠蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換或缺失，和(b)至少一種刺激性化合物，選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子和flk2/flt3配體。
34.如權(quán)利要求33中的藥用組合物，其中所述多肽選自具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
35.表達(dá)α血紅蛋白或其置換或缺失類似物的方法，包括將所述α血紅蛋白或其置換或缺失類似物做為遍在蛋白融合物表達(dá)。
36.如權(quán)利要求35中的方法，其中在大腸桿菌中進(jìn)行所述表達(dá)步驟。
37.如權(quán)利要求35中的方法，其中所述表達(dá)步驟包括表達(dá)遍在蛋白切割酶。
38.具有選自以下的序列的肽，生物素-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，(碘)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val和(碘)Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val。
39.刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用干細(xì)胞增殖刺激量的INPROL和/或阿片制劑化合物接觸造血細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求39中的方法，其中所述INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽和具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽。
41.如權(quán)利要求39中的方法，其中所述INPROL選自具有以下序列的肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中二個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵，Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr。
42.如權(quán)利要求39中的方法，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
43.刺激干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以結(jié)合阿片制劑受體的化合物接觸造血細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求43中的方法，其中所述化合物對(duì)阿片制劑受體μ亞類有選擇性。
45.刺激或抑制干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以結(jié)合傷害感受肽受體的化合物接觸造血細(xì)胞。
46.刺激或抑制干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以激活GTP結(jié)合蛋白的G抑制亞類的化合物接觸造血細(xì)胞。
47.刺激或抑制干細(xì)胞增殖的方法，包括用可以結(jié)合不包括經(jīng)典μ、κ或δ阿片制劑受體或ORL1的阿片制劑樣受體的化合物接觸造血細(xì)胞，其中所述受體(a)具有干細(xì)胞刺激和/或抑制特性和(b)具有可被納洛酮拮抗的干細(xì)胞刺激和/或抑制能力。
48.如權(quán)利要求47中的方法，其中所述阿片制劑樣受體具有以小于或等于1μM的解離常數(shù)Kd與肽Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val結(jié)合的能力。
49.如權(quán)利要求47中的方法，其中該解離常數(shù)小于或等于10nM。
50.鑒別INPROL受體的方法，包括在受體結(jié)合檢測(cè)中用INPROL接觸含有所述受體的材料。
51.如權(quán)利要求50中的方法，其中所述INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽、Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，生物素-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，(碘)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，(碘)Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
52.鑒別INPROL受體的方法，包括在腺苷酸環(huán)化酶檢測(cè)中用INPROL接觸含有所述受體的材料。
53.如權(quán)利要求52中的方法，其中所述INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽、Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，生物素-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，(碘)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，(碘)Phe-Pro-His-(碘)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
54.INPROL和/或阿片制劑化合物在制備用于在患有癌癥的哺乳動(dòng)物中治療癌癥的藥物中的用途，其中INPROL和/或阿片制劑化合物是與放療和/或化療結(jié)合施用的。
55.如權(quán)利要求54中的用途，其中放療和/或化療與INPROL和/或阿片制劑化合物的施用重復(fù)一次或多次。
56.如權(quán)利要求54中的用途，其中放療和/或化療是在施用INPROL和/或阿片制劑化合物的之前進(jìn)行的。
57.如權(quán)利要求54中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
58.INPROL和/或阿片制劑化合物在制備用于在暴露于損害或破壞干細(xì)胞的藥物的哺乳動(dòng)物中刺激干細(xì)胞分裂的藥物中的用途。
59.如權(quán)利要求58中的用途，其中所述藥物是抗病毒劑或抗瘤形成劑。
60.如權(quán)利要求58中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
61.在活體外保持哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞的方法，包括用干細(xì)胞增殖刺激量的INPROL和/或阿片制劑化合物接觸造血細(xì)胞。
62.如權(quán)利要求61中的方法，其中所述造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、動(dòng)員的外周血細(xì)胞、胎肝和臍帶血細(xì)胞。
63.如權(quán)利要求61中的方法，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
64.INPROL和/或阿片制劑化合物在制備用于在患有骨髓增殖性疾病、造血或上皮干細(xì)胞高增殖的哺乳動(dòng)物中治療骨髓增殖性疾病、造血或上皮干細(xì)胞高增殖的藥物中的用途。
65.如權(quán)利要求64中的用途，其中所述骨髓增殖性疾病是骨髓發(fā)育不良綜合癥或再生障礙性貧血。
66.如權(quán)利要求64中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
67.INPROL和/或阿片制劑化合物在制備用于治療或防止干細(xì)胞耗盡的藥物中的用途。
68.如權(quán)利要求67中的用途，其中所述干細(xì)胞耗盡是因?yàn)楂@得性免疫缺陷綜合癥。
69.如權(quán)利要求67中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
70.阿片制劑化合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中區(qū)別保護(hù)正常干細(xì)胞免受化療或放射的用途中的用途。
71.如權(quán)利要求70中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
72.INPROL和/或阿片制劑化合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行基因治療的藥物中的用途。
73.如權(quán)利要求72中的用途，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
74.進(jìn)行活體外干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，包括用干細(xì)胞刺激量的INPROL和/或阿片制劑化合物接觸造血細(xì)胞。
75.如權(quán)利要求72中的方法，其中所述造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、動(dòng)員的外周血細(xì)胞、胎肝和臍帶血細(xì)胞。
76.如權(quán)利要求72中的方法，其中所述阿片制劑化合物選自嗎啡、埃托啡、可待因、海洛因、氫嗎啡酮、羥氫嗎啡酮、羥甲左嗎喃、左洛啡烷、可待因、氫可酮、羥考酮、烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、butanorphanol、納布啡、哌替啶、阿法羅定、地芬諾酯、芬太尼、DAMGO、DALDA和傷害感受肽。
77.藥用組合物，包含(a)阿片制劑化合物和(b)至少一種抑制性化合物，選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽焦Glu-Glu-Asp-Cys-Lys、四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
78.藥用組合物，包含(a)阿片制劑化合物和(b)至少一種刺激性化合物，選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子和flk2/flt3配體。
79.INPROL在制備用于治療哺乳動(dòng)物中疼痛的藥物中的用途。
80.如權(quán)利要求79中的用途，其中所述INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽、Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
81.INPROL在制備用于治療哺乳動(dòng)物中免疫缺陷的藥物中的用途。
82.如權(quán)利要求81中的用途，其中所述INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-97序列的多肽、具有人α血紅蛋白鏈氨基酸1-94序列的多肽、Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
83.包含血紅蛋白α鏈的多肽，其中所述C末端疏水域已被置換或缺失，其中所述置換包括用非極性氨基酸置換所述疏水域的多于一個(gè)的疏水氨基酸，所述缺失包括缺失所述疏水域的多于一個(gè)的疏水氨基酸。
84.包含血紅蛋白α鏈的多肽，其中所述C末端觸珠蛋白結(jié)合域已被置換或缺失，其中所述置換包括用非極性氨基酸置換所述結(jié)合域的多于一個(gè)的疏水氨基酸，所述缺失包括缺失所述結(jié)合域的多于一個(gè)的疏水氨基酸。
85.藥用組合物，它包含(a)如權(quán)利要求84或85中的多肽和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
公開(kāi)的和要求保護(hù)的是干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離以及干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子用于調(diào)節(jié)干細(xì)胞細(xì)胞周期和加快化療后外周血細(xì)胞恢復(fù)的用途。亦公開(kāi)和要求保護(hù)了干細(xì)胞增殖的抑制劑和刺激劑。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1541706SQ200410007470
公開(kāi)日2004年11月3日 申請(qǐng)日期1997年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月3日
發(fā)明者S·D·沃爾佩, I·特塞爾羅瓦, S D 沃爾佩, 尥 申請(qǐng)人:威爾斯塔特醫(yī)療公司