用于抑制癌癥相關(guān)惡病質(zhì)的hdac抑制劑的制作方法
【專利摘要】提供了抑制患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的惡病質(zhì)的方法，所述方法包括施用HDAC抑制劑。方面包括以與未接受1類和2b類HDAC抑制劑的哺乳動(dòng)物相比有效地基本上保持所述哺乳動(dòng)物的體重的量施用1類和2b類HDAC抑制劑的方法。
【專利說(shuō)明】用于抑制癌癥相關(guān)惡病質(zhì)的HDAC抑制劑
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年11月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/906,738的優(yōu) 先權(quán)。W上提及的申請(qǐng)被通過(guò)引用如同全部重述一樣地并入本文。本文引用的所有參考文 獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，被通過(guò)引用W其全文并入。
[000；3]背景
[0004] 癌癥相關(guān)惡病質(zhì)是癌癥患者中與肌肉質(zhì)量損失、疲勞、無(wú)力和食欲不振相關(guān)的虛 弱狀態(tài)。惡病質(zhì)還與嚴(yán)重的臨床后果相關(guān)，所述臨床后果包括可W導(dǎo)致移動(dòng)困難的肌肉無(wú) 力和肺并發(fā)癥。惡病質(zhì)是癌癥患者死亡中的重要影響因素。
[0005] 惡病質(zhì)的特征在于不被常規(guī)營(yíng)養(yǎng)支持逆轉(zhuǎn)的骨骼肌質(zhì)量的損耗，導(dǎo)致嚴(yán)重影響患 者發(fā)病率和死亡率的明顯的體重減輕。它發(fā)生于多于80%的患有胃癌、膜腺癌和食道癌的 患者；70%的患有頭頸癌的患者；W及大約60%的患有肺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌的患 者。參見(jiàn)，例如，Muscle(2012)3,245-51。盡管惡病質(zhì)影響癌癥患者的死亡率，仍沒(méi)有開(kāi)發(fā)出 有效的療法W預(yù)防或阻礙惡病質(zhì)的進(jìn)展。例如，預(yù)測(cè)多于85%的膜腺癌患者，包括早期患 者，平均失去其患病前重量的14%。參迅，幽，BMC Cancer. 2010JU18; 10:363。惡病質(zhì)的膜 腺癌患者經(jīng)常無(wú)力和疲勞，并且對(duì)療法具有較低的耐受性并具有更不利的外科手術(shù)結(jié)果。 因此，惡病質(zhì)是膜腺癌的死亡率的主要驅(qū)動(dòng)者。不幸的是，在過(guò)去的40年，膜腺癌的5年存活 率保持在6 %，是所有惡性腫瘤中最低的。
[0006] 隨著鑒別惡病質(zhì)因素及其對(duì)骨骼肌的影響的新手段的出現(xiàn)，近期惡病質(zhì)領(lǐng)域在了 解癌癥和其他慢性疾病中調(diào)節(jié)肌肉萎縮的潛在機(jī)制方面取得重大進(jìn)展。結(jié)果，我們現(xiàn)在對(duì) 細(xì)胞因子和系統(tǒng)性炎癥如何通過(guò)對(duì)從肌纖維內(nèi)部發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)途徑起作用來(lái)調(diào)節(jié) 肌肉萎縮有所領(lǐng)會(huì)。但是，將運(yùn)些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成有效的療法是有挑戰(zhàn)性的，并且，在本文描述 的方面之前，一直缺少用于惡病質(zhì)的有效治療。
[0007] 骨骼肌質(zhì)量部分地通過(guò)蛋白合成與蛋白調(diào)節(jié)的相對(duì)速率來(lái)調(diào)節(jié)。Alamdari，N,等 人，Acetylation and deacetylation-novel factors in muscle wasting, Metabolism. 2013年1月；62(1): 1-11。當(dāng)?shù)鞍捉到馑俾蚀笥诘鞍缀铣蓵r(shí)，出現(xiàn)骨骼肌質(zhì)量的 損失。14.。蛋白乙酷化和脫乙酷化改變(modify)轉(zhuǎn)錄因子和基因轉(zhuǎn)錄，其可W通過(guò)使蛋白 更加易受或較不易受降解的影響來(lái)影響肌肉質(zhì)量。1^.組蛋白乙酷基轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白 脫乙酷酶化DAC)在調(diào)節(jié)蛋白乙酷化和脫乙酷化中起作用。
[000引但是，已經(jīng)證明運(yùn)些分子對(duì)肌肉消耗和惡病質(zhì)的作用是相互矛盾的一證據(jù)表明， 例如，HDA巧審制劑(例如，曲古抑菌素 A (TSA))的使用導(dǎo)致超乙酷化，超乙酷化可W增加蛋白 降解，導(dǎo)致增加的月幾肉消耗和惡病質(zhì)。相矛盾的結(jié)果由Narver等人（Sustained improvement of spinal muscular atrophy mice treated with trichostatin A plus nu化ition. Ann化urol. 2008;64:465-70)發(fā)現(xiàn)。但是，由于用TSA治療還伴隨著有力的營(yíng)養(yǎng) 支持，運(yùn)些結(jié)果遭到質(zhì)疑。Alamdari等人，在5。因此，認(rèn)為HDA巧Φ制劑增加而不是減少惡病 質(zhì)，或他們的使用產(chǎn)生沖突并且矛盾的結(jié)果。
[0009]癌癥惡病質(zhì)的發(fā)展和進(jìn)展由肌肉組織中對(duì)腫瘤的復(fù)雜、多因素的病理生理學(xué)響應(yīng) 引起。迄今為止，沒(méi)有可用的經(jīng)FDA批準(zhǔn)的療法W預(yù)防或阻礙惡病質(zhì)患者中的肌肉消耗的進(jìn) 展。迄今為止，祀向惡病質(zhì)發(fā)病機(jī)理的不同方面的若干研究用藥物已經(jīng)經(jīng)過(guò)人體試驗(yàn)，但 是，具有不同的臨床結(jié)果。例如，齡￥曰的13的8￥138(13；[1]1曰旨1'111]1曰13)，一種阻斷肌生成抑制蛋白 (myos化tin)和激活蛋白（activin)與II型激活蛋白受體結(jié)合的mAb，獲得抑A突破性療法認(rèn) 定，而GTx的肌肉消耗藥物enobosarm，一種選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)物，在后期臨床試驗(yàn)中失 敗。
[0010] 核屯、組蛋白的乙酷化通過(guò)控制DNA的核小體組裝在基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)中起重要作 用。組蛋白的脫乙酷化導(dǎo)致核小體的緊密組裝W及由轉(zhuǎn)錄因子與DNA目標(biāo)的受限的接近引 起的轉(zhuǎn)錄抑制。組蛋白乙酷化使核小體結(jié)構(gòu)松弛，為轉(zhuǎn)錄因子提供更多的接近。組蛋白脫乙 酷化和乙酷化之間的平衡由組蛋白脫乙酷轉(zhuǎn)移酶化MC)和組蛋白乙酷轉(zhuǎn)移酶化AT)調(diào)節(jié)。 運(yùn)些因子的異常的平衡與異常的細(xì)胞生長(zhǎng)和癌癥的多個(gè)形式相關(guān)，如美國(guó)專利號(hào)8,318， 808中討論的，該專利W引用的方式全文并入本文。尤其是，HDA巧審制劑改變乙酷化和脫乙 酷化之間的平衡，在許多腫瘤細(xì)胞類型中導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯、分化和調(diào)亡。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 號(hào)8,318,808。
[0011] 已經(jīng)在人類中鑒定了 18種皿AC，并且其特征在于依賴鋒或煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸 (NADKDiscov Med 10(54):462-470，November 2010)，并且與W下類別相關(guān)：1 類化DAC 1、 2、3和8);11 類(HDAC 4、5、6、7、9和10;111類(3^化1111-7(511?1'));和1￥類(皿40 ll)〇Id. [001^ 本文特別感興趣的是美國(guó)專利號(hào)8,318,808中描述的皿A巧Φ制劑，并且基于，例如 通過(guò)芳族Ω-氨基酸接頭與化馨合基序偶聯(lián)的脂肪酸。在許多方面，HDA巧Φ制劑可W具有 式：
[0013]
[0014] 其中X選自Η和CH3; Y是(CH2)n，其中η是0-2;Z選自（CH2)m和（CH)2，其中m是0-3; A 是控基;B是鄰氨基苯基或徑基;并且Q是面素、氨或甲基。一種特定的HDA巧審制劑(N-徑基- 4-(3-甲基-2-苯基-下酷基氨基)-苯甲酯胺）也被稱為AR-42。在一個(gè)方面，AR-42的結(jié)構(gòu)如 下：
[0015]
[0016] AR-42是組蛋白和非組蛋白蛋白二者的廣譜脫乙酷酶抑制劑，當(dāng)與vorinostat (即，SAHA)相比時(shí)，其具有已被證明的在實(shí)體瘤和血液性惡性腫瘤中的更大的效力和活性。 參見(jiàn)，例女日，Lu YS 等人，Efficacy of 曰 novel histone de 曰 cetyl 曰 se inhibitor in murine models of hepatocellular carcinoma,Hepatology.20070ct;46(4):1119-30; Kulp SK 等人，Anti tumor effects of a novel phenylbutyr ate-based histone deacetylase inhibitor,(S)-HDAC-42, in prostate cancer,Clin Cancer Res.2006Sep l；12(17):5199-206.
[0017] AR-42也可^具有有助于其治療譜的另外的不依賴組蛋白的機(jī)制。參見(jiàn)，例如， Chen MC 等人，Novel mechanism by which histone deacety lase inhibitors facilitate topoisomerase Iladegradation in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 2011 Jan; 53( 1): 148-59; Chen CS 等人，Hi stone acetylation-independent effect of histone deacetylase inhibitors on Akt through the reshuffling of protein phosphatase lcomplexes，J Biol Qiem.2005Nov 18:280(46):38879-87;Yoo CB 等人，Epigenetic therapy of cancer: past, present and future, Nat Rev Drug Discov.2006Jan；5(1):37-50〇
[0018] AR-42在包括但不限于乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、卵巢腫瘤、血液細(xì)胞瘤（例如淋己 瘤、骨髓瘤和白血?。?、肝部腫瘤和腦瘤的腫瘤中具有已被證明的抑制作用。參見(jiàn)，例如， Mims A等人，Increased anti-leukemic activity of decitabine via A民-42-induced upregulation of mi民一29b:a novel epigenetic-targeting approach in acute myeloid leukemia,Leukemia.2012Nov26.doi:10.1038/leu.2012.342.[Epub ahead of print] ;Burns SS等人，Histone deacetylase inhibitor A民-42differentially affects cell-cycle transit in meningeal and meningioma cells,potently inhibiting NF2- deficient meningioma growth,Cancer Res.2013Jan 15:73(2) :792-803;Lu YS等人， 民adiosensitizing effect of a phenylbutyrate-derived histone deacetylase inhibitor in hepatocellular carcinoma,Int J 民adiat Oncol Biol Phys.2012Jun 1; 83(2) ;Zimmerman B等人，Efficacy of novel histone deacetylase inhibitor，A民42，in a mouse model of,human T-lymphotropic virus type ladult T cell lymphoma,Leuk 民 es.2011Nov;35(ll):1491-7;Zhang S 等人，The novel histone deacetylase inhibitor,A民一42,inhibits gpl30/Stat3pathway and induces apoptosis and cell cycle arrest in multiple myeloma cells，Int J Cancer.2011Jul 1;129(1):204-13。 [0019] 概述
[0020] 本文描述的方面提供了抑制患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的惡病質(zhì)的方法，包括向所述 哺乳動(dòng)物施用1類和化類皿A巧Φ制劑。一個(gè)方面提供了通過(guò)^與未接受1類和化類HDA巧印制 劑的哺乳動(dòng)物相比，有效地基本上保持所述哺乳動(dòng)物的體重的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類 和2b類皿A巧Φ制劑，抑制所述哺乳動(dòng)物中的惡病質(zhì)的方法。在另一個(gè)方面，W在至少15天的 時(shí)間段內(nèi)有效地基本上保持所述哺乳動(dòng)物的體重的至少約90%的量向患有癌癥的哺乳動(dòng) 物施用1類和化類冊(cè)A巧Φ制劑。在另一個(gè)方面，1類和化類冊(cè)A巧Φ制劑是AR-42。在又另一個(gè) 方面，患有癌癥的哺乳動(dòng)物具有至少一個(gè)腫瘤，并且在用AR-42治療后最初15天期間，腫瘤 體積不減小超過(guò)6 %。
[0021] 本文描述的其他方面提供了通過(guò)向患有癌癥的哺乳動(dòng)物施用AR-42,抑制惡病質(zhì) 的方法，其中與未用AR-42治療的患有癌癥的哺乳動(dòng)物相比，癌癥惡病質(zhì)中肌肉萎縮的多個(gè) 介質(zhì)（例如，促惡病質(zhì)驅(qū)動(dòng)物諸如比-6、比-61?(1、1^、]?誠(chéng)尸1、六甘〇容111-1)的表達(dá)被降化。
[0022] 另外的方面提供了通過(guò)向患有癌癥的哺乳動(dòng)物施用AR-42抑制惡病質(zhì)的方法，其 中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)引起的脂肪組織的損失和骨骼肌纖維尺寸的減 小大體上恢復(fù)。
[0023] 本文描述的方面提供了保持患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的骨骼肌重量的方法，所述方 法是通過(guò)W與未接受1類和化類HDA巧φ制劑的哺乳動(dòng)物相比，在至少15天的時(shí)間段內(nèi)有效 保持所述哺乳動(dòng)物的骨骼肌重量的至少約90%的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類和化類HDA巧審 制劑。
[0024] 另外的方面提供了延長(zhǎng)患有癌癥的哺乳動(dòng)物存活的方法，所述方法是通過(guò)W與未 接受1類和2b類HDA巧審制劑的哺乳動(dòng)物相比，有效地大體上延長(zhǎng)所述哺乳動(dòng)物的存活的量 向所述哺乳動(dòng)物施用1類和化類HDA巧Φ制劑。
[0025] 如本文公開(kāi)的，AR-42表現(xiàn)出在癌癥惡病質(zhì)的動(dòng)物模型中抑制、降低或阻止肌肉消 耗和延長(zhǎng)存活的體內(nèi)效力。此外，AR-42對(duì)與癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)的作用不依賴于AR-42降低 腫瘤負(fù)荷的作用。
[00%] 附圖
[0027]圖1A示出了對(duì)C-26荷瘤小鼠中癌癥誘導(dǎo)的惡病質(zhì)的示例性抑制，并且描繪了媒介 物治療的無(wú)腫瘤小鼠（對(duì)照)對(duì)用媒介物(媒介物)或每隔一天W50mg/kg口服AR-42(AR-42) 治療的荷瘤小鼠在15-天研究期間總重量(左圖，包括腫瘤)和體重（中間圖，不包括腫瘤）的 變化。箭頭指出了 AR-42治療的時(shí)間。右圖，AR-42對(duì)C-26荷瘤小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)缺乏抑制作 用。W平均值 ±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。P 值:a，0.045 ;b ,0.0027 ;c ,0.049 ;d，0.0048;
[00%]圖IB示出了來(lái)自每組的具有腫瘤負(fù)荷的代表性小鼠的照片，描繪AR-42對(duì)癌癥惡 病質(zhì)的治療作用；
[0029] 圖1C示出了研究過(guò)程中Ξ個(gè)治療組的示例性的平均每日飲食消耗。W平均值± S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)(n = 8);
[0030] 圖ID示出了與媒介物治療的荷瘤小鼠和無(wú)腫瘤小鼠 （n = 8)的那些相比，AR-42在 無(wú)腫瘤和荷瘤小鼠二者中對(duì)后肢肌肉，包括脾腸肌、腔骨前肌和四頭肌的重量的示例性作 用（P值：a,<0.001;b,0.0042;c,0.0046);
[0031] 圖IE示出了與媒介物治療的荷瘤小鼠和無(wú)腫瘤小鼠 （n = 8)的那些相比，AR-42在 無(wú)腫瘤和荷瘤小鼠二者中對(duì)屯、臟、脂肪組織和脾臟的示例性作用（P值：a，<〇.〇〇l;b， 0.0059;c，0.001;d,0.009);
[0032] 圖2A示出了在的C-26荷瘤小鼠中肌肉纖維大小的示例性保持，左側(cè)描繪來(lái)自無(wú)腫 瘤對(duì)照小鼠和用媒介物或AR-42治療的荷瘤小鼠的脾腸肌肌肉的H&E染色切片的顯微照片。 比例尺，100μπι，并且在右側(cè)，脾腸肌肌肉的肌肉纖維的橫切面積W頻率直方圖呈現(xiàn)，顯著性 (Ρ<0.001)。^平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)；
[0033] 圖2B示出了用媒介物、vo;rinos1:at(50mg/kg，口服，每日 Kromid邱sin(0.6mg/kg， 腹膜內(nèi)，每周2次)或AR-42(50mg/kg，口服，每隔一天)治療的荷瘤小鼠的示例性的Kap 1 an- Meier存活率曲線。存活被定義為體重(不包括腫瘤）的損失達(dá)到起始體重的20%的時(shí)間，其 充當(dāng)退出研究的人道終點(diǎn)(*，P<〇. 001，媒介物對(duì)AR-42; η = 8);
[0034] 圖2C示出了來(lái)自每組的代表性小鼠的示例性照片，描繪了AR-42對(duì)vorinostat和 romidepsin在荷瘤小鼠中對(duì)癌癥惡病質(zhì)的治療作用，如姿態(tài)、皮毛化aircoat)和身體狀況 所證明的；
[0035] 圖2D示出了在腫瘤細(xì)胞注射后15天，與媒介物-治療的荷瘤小鼠 （n = 8)相比，媒介 物治療的無(wú)腫瘤小鼠 （n = 6)和用AR-42(n = 8)、￥〇1'；[]1〇31:曰1:(]1 = 8)或1'〇1111(1邱3；[]1(]1 = 5)治 療的荷瘤小鼠的骨骼肌中Atrogin-l//MAFbx和MuRFl的示例性相對(duì)mRNA表達(dá)水平。W平均 值±5.0.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，P值:a, <0.001 ;b ,0.016 ;c ,0.0063;
[0036] 圖3A示出了對(duì)與糖酵解和葡萄糖代謝的旁路途徑相關(guān)的中間物的水平的示例性 作用；
[0037] 圖3B示出了AR-42對(duì)來(lái)自無(wú)腫瘤小鼠和荷瘤小鼠（每組n = 8)的脾腸肌肌肉中糖原 代謝的示例性的作用。從腫瘤細(xì)胞注射后第6天開(kāi)始，用媒介物或AR-42(50mg/kg，口服，每 隔一天)治療荷瘤小鼠，在第17天結(jié)束。用媒介物或AR-42平行治療無(wú)腫瘤對(duì)照小鼠。W盒須 圖呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。盒的底部和頂部代表第一和第Ξ四分位數(shù)，并且V'號(hào)和盒內(nèi)的帶分別代表平 均數(shù)和中位數(shù)值。須的終點(diǎn)代表每組的最大值和最小值；
[003引圖4示出了，AR-42阻斷C-26荷瘤小鼠的肌肉中游離氨基酸和參與調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞的 氨基酸代謝物W及膜島素抗性的生物標(biāo)志物的水平的惡病質(zhì)誘導(dǎo)的變化。從按圖3A和3B所 述的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生用于分析的樣品。按圖3A和3B所述W盒須圖呈現(xiàn)數(shù)據(jù)；
[0039] 圖5A示出了（上圖）AR-42對(duì)無(wú)腫瘤對(duì)C-26荷瘤小鼠的血清中促惡病質(zhì)細(xì)胞因子 比-6(左)和LIF(右）的水平的示例性的作用，W及(下圖MR-42對(duì)無(wú)腫瘤對(duì)C-26荷瘤小鼠的 骨骼肌中比-6Ra的mRNA表達(dá)的作用的qPCR分析。W平均值± S. D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，P值:a，<0.001; b，0.006;C，0.012(n = 3)。按圖3所述治療小鼠；
[0040] 圖5B示出了 RNA-序列數(shù)據(jù)(左)和文氏圖（右）的示例性主成分分析，示出了四個(gè)治 療組中差異表達(dá)的基因 。TF，無(wú)腫瘤;T，荷瘤的；veh，媒介物治療的;AR，AR-42治療的。按圖3 所述治療小鼠；
[0041] 圖5C示出了通過(guò)RNA-序列進(jìn)行的AR-42對(duì)6個(gè)關(guān)鍵促惡病質(zhì)驅(qū)動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄物水平 的作用的示例性分析（P值：a，〇.〇24;b，0.028; C ,0.015 ;d，0.007; e，0.024;f ,0.026 ;g, 0.01;h，0.012;i，<0.001;j，0.014;n = 3)。按圖 3 所述治療小鼠；
[0042] 圖加示出了四個(gè)治療組的小鼠的骨骼肌中通過(guò)qPCR進(jìn)行的AR-42對(duì)6個(gè)關(guān)鍵促惡 病質(zhì)驅(qū)動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄物水平的作用的示例性分析(*，？<0.001;11 = 6)。^平均值±5.0.呈現(xiàn)數(shù) 據(jù)。按圖3所述治療小鼠；
[0043] 圖6A示出了通過(guò)推遲AR-42的治療直到腫瘤和惡病質(zhì)末期，在C-26荷瘤小鼠中抑 制癌癥惡病質(zhì)。在18天的研究期間，媒介物治療的無(wú)腫瘤對(duì)照小鼠（T/F，Veh)和用媒介物治 療的荷瘤小鼠（T，Veh)對(duì)在第6天(T，AR42/D6)、第10天(T，AR42/D10)或第12天（T，AR42/ D12)開(kāi)始用口服AR-42治療的那些，體重（不包括腫瘤）的變化（在左側(cè)示出KP值：a, 0.0015;b，0.023(n = 8)。箭頭表示AR-42治療開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)。W平均值呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。為了清楚 展示，沒(méi)有示出每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的S.D.棒。右側(cè)是示出了在推遲治療試驗(yàn)中，AR-42對(duì)C-26荷瘤 小鼠的腫瘤生長(zhǎng)缺乏抑制作用的結(jié)果。W平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)(n = 8);
[0044] 圖6B示出了描繪盡管推遲治療，AR-42對(duì)荷瘤小鼠的癌癥惡病質(zhì)的治療作用的示 例性照片，如由正常姿態(tài)、光滑皮毛和更好的身體狀況所證明的，盡管有大腫瘤負(fù)荷；
[0045] 圖6C示出了如圖6A所述在疾病進(jìn)展的不同階段開(kāi)始的AR-42治療對(duì)C-26荷瘤小鼠 的后肢肌肉，包括脾腸肌、腔骨前肌和四頭肌的重量的示例性作用。W平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù) 據(jù)(n = 8;*，P<0.001);
[0046] 圖6D示出了在第15天和第16天，相對(duì)于媒介物治療的無(wú)腫瘤和荷瘤對(duì)照，AR-42對(duì) 荷瘤小鼠的握力的作用。W平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)(n = 8;P值:a，0.01;b，0.022;c，<0.001; d，0.0019)DN，牛頓；
[0047]圖7示出了，在惡病質(zhì)的化C小鼠模型中，AR-42保護(hù)免受癌癥誘導(dǎo)的肌肉消耗。示 出了與媒介物治療的荷瘤小鼠的那些相比，AR-42相對(duì)媒介物在無(wú)腫瘤小鼠和荷瘤小鼠二 者中對(duì)后肢肌肉，包括脾腸肌、腔骨前肌和四頭肌的質(zhì)量的示例性作用。按圖1A所述的相同 方法治療小鼠，除了在腫瘤細(xì)胞注射后第20天處死小鼠。W平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)(n = 8); [004引圖8示出了用于實(shí)時(shí)RT-PCR的引物的示例性序列；
[0049] 圖9示出了AR-42和媒介物治療的C-26荷瘤小鼠 （n = 6)之間與肌肉疾病或功能相 關(guān)的差異表達(dá)基因（>4倍)的示例性Ingenuity Pathway Analysis(IPA) (QIAGEN)。
[0050] 圖10示出了來(lái)自用媒介物或AR-42治療的無(wú)腫瘤小鼠和c-26荷瘤小鼠的血清樣品 的示例性的細(xì)胞因子譜分析(平均數(shù)±5.0.;每組n = 3);并且
[0051 ]圖11示出了來(lái)自AR-42治療的對(duì)媒介物治療的C-26荷瘤小鼠 （η = 3)的肌肉中差異 表達(dá)基因（>4倍)的示例性RNA-序列分析。
[00對(duì)詳述
[0053] 在描述本文描述的幾個(gè)示例性方面之前，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于W下說(shuō)明書(shū)中陳 述的構(gòu)建或方法步驟的細(xì)節(jié)。本文描述的方面能夠W不同方式實(shí)施或完成。
[0054] 本文描述的方面公開(kāi)了口服AR-42在削弱惡病質(zhì)誘導(dǎo)的重量損失和骨骼肌萎縮W 及在癌癥惡病質(zhì)的CD2F1小鼠結(jié)腸26(C-26)腫瘤模型中延長(zhǎng)存活的作用。小鼠 CD2F1惡病質(zhì) 模型在，例如BMC化11〇6'.2010化18;10:363中描述，其通過(guò)引用全文并入本文。觀察到的 抗-惡病質(zhì)作用與AR-42在患病的肌肉組織中重編程細(xì)胞代謝和下調(diào)IL-6水平W抑制肌肉 消耗和不依賴AR-42降低腫瘤負(fù)荷的作用的、與惡病質(zhì)相關(guān)的其他作用相關(guān)。
[0055] 本文描述的方面公開(kāi)了口服AR-42在削弱惡病質(zhì)誘導(dǎo)的重量損失、骨骼肌萎縮W 及在癌癥惡病質(zhì)的Lewis肺癌化LC)腫瘤模型中延長(zhǎng)存活的作用。參見(jiàn)，例如，Expert Opin Drug Discov.Nov 1,2009；4(11):1145-1155〇
[0056] 描述于美國(guó)專利號(hào)8,318,808的HDA巧Φ制劑可W用于本文描述的各種方法。運(yùn)些 HDA巧Φ制劑是基于，例如，通過(guò)芳族Ω-氨基酸接頭與化馨合基序偶聯(lián)的脂肪酸。在許多 方面，HDA巧Φ制劑可W具有式：
[0化7]
[0化引其中X選自Η和CH3; Y是(CH2)n，其中η是0-2;Z選自（CH2)m和（CH)2，其中m是0-3; A 是控基;B是鄰氨基苯基或徑基;并且Q是面素、氨或甲基。
[0059] 在另一方面，本文描述的方法利用AR-42,也被稱為（S)-N-徑基-4-(3-甲基-2-苯 基下燒酷胺基)苯甲酯胺，其具有W下化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0060]
[0061]在又另一個(gè)方面，AR-42包括鹽、溶劑化物、水化物、無(wú)水物、共晶物和其他結(jié)晶形 式和組合。AR-42可W被配制成具有增加的穩(wěn)定性、增加的生物利用度、持續(xù)釋放和其他特 性的多種劑型。
[0062] 在一方面，HDA巧Φ制劑被分類表征為鋒依賴的或煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NAD)依 賴的（Discov Med 10(54):462-470，November 2010)，并且基于其HDAC底物被分成具有 18 個(gè)家族亞型的4類：1 類化DAC 1、2、3和8);11類化DAC 4、5、6、7、9和 類(sirtuin 1-7 (SIRT));和IV類化DAC 11)。社.在另一個(gè)方面，HDAC抑制劑包括但不限于Vorinostat (SAHAKI類和II類抑制劑）、縮酪膚(Depsipeptide)I類抑制劑和AR-42(I類和Hb類抑制 劑）。參迅，魚(yú)幽，S化址l，B.D.and Allis，C.D. (2000)化ture403 :41-45。其他HDA巧審制劑 (例如，曲古抑菌素 A或TSA)抑制1類和2類HDACdHDA巧Φ制劑的底物的種類和亞型有差異。
[0063] 在其他方面，HDA巧Φ制劑抑制1類和2b類皿AC。在又另一方面，HDA巧Φ制劑是AR- 42。
[0064] 在癌癥惡病質(zhì)的結(jié)腸26(C-26)腫瘤模型中，C26腫瘤的一部分被移植到同基因 BALB/c小鼠中并且小鼠發(fā)生未分化癌(undifferentiated carcinoma)。骨骼肌萎縮(通過(guò) 肌肉力量和抗疲勞的測(cè)量)與觀察的生化變化相關(guān)，并且模型被描述為"對(duì)于癌癥惡病質(zhì)的 研究的良好標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。BMC化ncer.2010Jul 8;10:363。
[0065] 在一個(gè)方面，提供了通過(guò)W與未接受1類和化類HDA巧審制劑的哺乳動(dòng)物相比，有效 地大體上保持哺乳動(dòng)物的體重的量向患有癌癥的哺乳動(dòng)物施用1類和化類HDA巧Φ制劑，抑 制所述哺乳動(dòng)物的惡病質(zhì)的方法。在另一方面，HDA巧Φ制劑是AR-42。
[0066] 在又另一方面，在用AR-42治療后約最初15天后，哺乳動(dòng)物的體重不降低超過(guò)約 6%。
[0067] 在另一方面，癌癥選自由膜腺癌、結(jié)腸癌、頭部癌癥、頸部癌癥、胃癌和食道癌組成 的組。在另一方面，哺乳動(dòng)物是人類。
[006引 AR-42可W W約Img/kg至約lOOmg/kg哺乳動(dòng)物的量施用并且至少每日一次地施 用。在另一方面，AR-42每日兩次地W約50mg/kg哺乳動(dòng)物體重的量施用。
[0069] 在又另一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，化-6的水平降低了約56%。在另 一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，白血病抑制因子化IF)的水平降低了約88%。在另 一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，Atrogin-lmRNA的表達(dá)恢復(fù)到基底水平。
[0070] 在一個(gè)方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，MuRFlmRNA的表達(dá)恢復(fù)到基底水平。 在另一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的IL-6RamRNA水平的升高降低了 約 85 %。
[0071] 在又另一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的脂肪組織的損失大 體上恢復(fù)。在另一方面，與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的骨骼肌纖維大小的 減小被AR-42恢復(fù)。
[0072] 還提供了保持患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的骨骼肌重量的方法，包括W與未接受1類 和化類皿A巧Φ制劑的哺乳動(dòng)物相比，在至少15天的時(shí)間段內(nèi)有效保持所述哺乳動(dòng)物的骨骼 肌重量的至少約90%的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類和化類HDA巧Φ制劑。
[0073] 在另一方面，提供了延長(zhǎng)患有癌癥的哺乳動(dòng)物的存活的方法，包括W與未接受1類 和化類皿A巧Φ制劑的哺乳動(dòng)物相比，有效地大體上延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物的存活的量向所述哺乳動(dòng) 物施用1類和化類HDA巧Φ制劑。在又另一方面，在向哺乳動(dòng)物施用AR-42后，哺乳動(dòng)物存活至 少約21天。
[0074] 在另一方面，AR-42的施用削弱了惡病質(zhì)誘導(dǎo)的重量損失和骨骼肌萎縮并延長(zhǎng)了 哺乳動(dòng)物的存活。不圓于理論，認(rèn)為抗-惡病質(zhì)作用與AR-42重新編程細(xì)胞代謝和在患病的 肌肉組織中下調(diào)IL-6水平W抑制肌肉消耗的能力和其他不依賴AR-42對(duì)降低腫瘤負(fù)荷的作 用的其他惡病質(zhì)-相關(guān)作用相關(guān)。
[0075] 在一個(gè)方面，用多種技術(shù)測(cè)量AR-42的抗-惡病質(zhì)作用，所述技術(shù)包括癌癥中肌肉 萎縮的已確立的介質(zhì)的表達(dá)的qRT-PCR分析（例如，Cancer Cell.2008Nov δ 1) 、 血清和脾腸肌肌肉組織中抗炎性細(xì)胞因子 的水平 的測(cè)量 (Am J Patho 1. 201 IMar; 178 (3): 1059-68)、代謝組譜分析（J Cachexia Sarcopenia Muscle.2013Jun;4(2): 145-55)、 測(cè)量肌肉組織中游離氨基酸的水平（J Cachexia Sarcopenia Muscle.2013Jun;4(2) :145- 55;Am J 陸ysiol 化docrinol Metab.2007化b;292(2):E501-12)、通過(guò)測(cè)量與糖酵解通路 相關(guān)的生化水平來(lái)測(cè)量惡病質(zhì)的肌肉的"糖酵解簽名"（Caches ia Sar copen ia Muscle. 2013Jun:4(2):145-55)、測(cè)量惡病質(zhì)的肌肉組織中糖原膽積水平（Cell Death Differ.20120ct :19(10):1698-708)、分析惡病質(zhì)的肌肉中支鏈氨基酸的新陳代謝（Int J Biochem Cell Biol.20130ct;45(10) :2163-72)和測(cè)量惡病質(zhì)肌肉中2-?基下酸和視晶酸 (ophthalmate)的水平（PLoS One.2010May 28;5(5):el0883;Int J Cancer.2010Feb 1; 126(3)756-63)。
[0076] 如本文描述的HDA巧Φ制劑，可W施用至需要治療的患者(例如，患有癌癥并且表現(xiàn) 出惡病質(zhì)癥狀的患者）。在一個(gè)方面，某些癌癥尤其與惡病質(zhì)相關(guān)，包括但不限于膜腺癌、胃 癌、頭部癌癥、頸部癌癥和食道癌Γ惡病質(zhì)相關(guān)的癌癥"）。在另一方面，1類、2b類HDA巧審制 劑(例如，AR-42)被施用至需要治療的患者。
[0077] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"大體上"指例如，不患有癌癥的哺乳動(dòng)物的重量或量的"大多 數(shù)"、"大部分"或至少50 %、60 %、70 %、80 %和90 %。
[007引如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"治療"、"降低"、"抑制（suppress)"、"抑制（inhibit)"、"預(yù) 防"或類似術(shù)語(yǔ)不必須指100%或完全治療或預(yù)防。而是，運(yùn)些術(shù)語(yǔ)指如在本領(lǐng)域中被認(rèn)為 是有益的特定疾病的治療或預(yù)防的不同程度(例如，100%、90%、80%、70%、60%、50%、 40%'30%'20%'10%、5%或1%)。
[0079]術(shù)語(yǔ)"治療"或"預(yù)防"也指將疾病的發(fā)作延遲一段時(shí)間或無(wú)限期地延遲發(fā)作。術(shù)語(yǔ) "治療（treatment)"或"治療（treating)"指向患者施用藥物或治療或給患者開(kāi)處方藥物 (例如，由醫(yī)生、護(hù)±或其他醫(yī)學(xué)專業(yè)人±)，其中患者或第Ξ方(例如，看護(hù)人、家庭成員或 健康護(hù)理人員）施用該藥物或治療。術(shù)語(yǔ)"有效的量'指治療、降低、抑制（suppress)、抑制 (inMbit)、預(yù)防疾病或病癥(例如，惡病質(zhì))或延長(zhǎng)患有疾病或病癥的哺乳動(dòng)物的存活的藥 物或治療(例如，I類和Ilb類HDA巧Φ制劑)的量。
[0080]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"延長(zhǎng)(prolong)"或"延長(zhǎng)(prolonging)"指與未接受治療的 哺乳動(dòng)物相比，增加接受治療的哺乳動(dòng)物的存活的時(shí)間。在此方面，"延長(zhǎng)的存活"可W指使 哺乳動(dòng)物的壽命增加例如，不患有癌癥的哺乳動(dòng)物的壽命的1 %、5 %、10%、20%、30%、 40%'50%'60%'70%'80%或90%。
[0081 ] 本文描述的任何皿A巧Φ制劑可W經(jīng)口、經(jīng)腸道外儲(chǔ)庫(kù)-IM、SQ和儲(chǔ)庫(kù)-SQ)、 經(jīng)舌下、經(jīng)鼻（吸入）、經(jīng)銷內(nèi)、局部或經(jīng)直腸施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的劑型適用于本文 描述的HDA巧Φ制劑的遞送。
[0082] 在一個(gè)方面，示例的皿A巧φ制劑W 口服劑型(例如，丸劑、膠囊劑、錠劑(caplet)或 片劑等)施用于被診斷患有與惡病質(zhì)相關(guān)的癌癥(例如，膜腺癌、膀脫癌、胃癌、頭部癌癥和 頸部癌癥)的患者。
[0083] HDA巧Φ制劑可W被配制成適當(dāng)?shù)乃幬镏苿?，諸如用于口服施用的片劑、膠囊劑或 馳劑，或用于腸道外施用的無(wú)菌溶液或懸液。本文描述的HDA巧Φ制劑可W用本領(lǐng)域公知的 技術(shù)和過(guò)程被配制成藥物組合物。
[0084] 在一個(gè)方面，在公認(rèn)的藥學(xué)實(shí)踐要求的單位劑型中，約0.1至lOOOmg、約5至約 lOOmg或約10至約50mg的HDA巧Φ制劑(例如，AR-42)或生理學(xué)上可接受的鹽或醋可W與生理 學(xué)上可接受的媒介物、載體、賦形劑、粘合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑等配合。包含HDA巧審制 劑的組合物或制劑中活性物質(zhì)的量是使得獲得指示的范圍內(nèi)的適當(dāng)劑量的量。
[0085] 在另一方面，組合物可W配制成單位劑型，每個(gè)劑量包含從約1至約500mg或約10 至約lOOmg活性成分。術(shù)語(yǔ)"單位劑型"指的是適于作為用于人類受試者和其他哺乳動(dòng)物的 單一劑量的物理上分散的單元，每一個(gè)單元包含計(jì)算W產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)先確定的 量的活性材料與合適的藥學(xué)賦形劑的組合。
[0086] 在一個(gè)方面，將一種或更多種HDA巧Φ制劑與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體混合W形 成組合物。在混合或添加化合物時(shí)，所得的混合物可W是溶液、懸液、乳液或類似物。脂質(zhì)體 懸液或任何其他納米顆粒遞送系統(tǒng)也可W用作藥學(xué)上可接受的載體。運(yùn)些可W根據(jù)本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的方法制備。所得混合物的形式取決于許多因素，包括預(yù)期的施用方式和化 合物在選擇的載體或媒介物中的溶解性。在一個(gè)方面，有效濃度足W減少或緩解被治療的 疾病、素亂或病癥的至少一個(gè)癥狀，并且可W由經(jīng)驗(yàn)確定。
[0087] 在又另一方面，AR-42抑制惡病質(zhì)中的肌肉消耗，如在惡病質(zhì)的C-26和化C腫瘤模 型中示出的。促炎性細(xì)胞因子，化-6和TNF，代表兩個(gè)模型的主要促惡病質(zhì)因子(31，32)。細(xì) 胞因子譜分析表明，盡管AR-42對(duì)C-26荷瘤小鼠的血清TNF水平?jīng)]有影響，它降低血清化-6 水平和肌肉內(nèi)IL-6RamRNA表達(dá)。但是，與無(wú)腫瘤小鼠相比，運(yùn)些AR-42-治療的C-26荷瘤小鼠 仍然表現(xiàn)出升高的血清IL-6水平和IL-6RamRNA，表明降低的IL-6信號(hào)傳導(dǎo)不單獨(dú)地對(duì)AR- 42介導(dǎo)的肌肉消耗的抑制負(fù)責(zé)。
[0088] 機(jī)械地，AR-42的抗-惡病質(zhì)作用是獨(dú)特的，因?yàn)槊驛巧Φ制劑丙戊酸和曲古抑菌素 A 不能逆轉(zhuǎn)C-26荷瘤小鼠的肌肉損失，盡管它們具有調(diào)節(jié)肌肉抑制素(myostatin)/卵泡抑制 素（follistatin)軸的能力（33)。類似地，我們的發(fā)現(xiàn)表明，與AR-42不同，vorinostat和 romid邱sin對(duì)削弱C-26模型中的惡病質(zhì)誘導(dǎo)的重量損失無(wú)效。此矛盾可歸因于AR-42的更 強(qiáng)的抑制荷瘤小鼠的肌肉中E3連接酶Atrogin-巧日MuRFl的mRNA表達(dá)的能力，其可W反映它 們各自調(diào)節(jié)骨骼肌中全基因表達(dá)的能力的差異。近來(lái)的證據(jù)暗示異常的乙酷化/轉(zhuǎn)錄因子 表達(dá)和患病的肌肉中肌肉消耗之間的機(jī)械聯(lián)系，引起惡病質(zhì)-相關(guān)基因的不受控的表達(dá)[綜 述：（34)]。已經(jīng)報(bào)道，P300/CBP的組蛋白乙酷轉(zhuǎn)移酶活性差異性地調(diào)節(jié)骨骼肌中化XO家族 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性和核定位（35)，W及I類皿AC，特別是皿AC1，通過(guò)調(diào)節(jié)Foxo及其祀 Atrogin-l和MuRFl的表達(dá)在介導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)匿乏引起的肌肉萎縮或肌肉廢用(muscle disuse)引 起的肌肉萎縮中起重要作用(22)。
[0089] RNA-序列分析掲示了 AR-42逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)中腫瘤誘導(dǎo)的改變的能力。鑒定了總計(jì) 677個(gè)基因，所述基因在AR-42治療的荷瘤小鼠和媒介物-治療的荷瘤小鼠之間W4倍或更大 地差異性地表達(dá)?？蒞想到，差異化表達(dá)的基因的運(yùn)樣大的數(shù)量可能由AR-42對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因 子/調(diào)節(jié)物的轉(zhuǎn)錄活性和/或表達(dá)的作用產(chǎn)生。除了化xolW外，AR-42還調(diào)節(jié)許多其他轉(zhuǎn)錄 因子 / 調(diào)節(jié)物的表達(dá)，包括 C/EBPδ、Fos、Jun-b、DAXX、ERNl、HIF3α、MAFF、MAFK和Mef2c(圖 11)。在運(yùn)些轉(zhuǎn)錄因子之中，已經(jīng)詳細(xì)記載了Mef2c在骨骼、屯、臟和平滑肌的發(fā)育中的重要性 (36)，W及AP-1信號(hào)級(jí)聯(lián)與癌癥-相關(guān)的肌肉消耗有關(guān)(37)。
[0090] 已經(jīng)提出，C-26荷瘤小鼠的惡病質(zhì)肌肉表現(xiàn)出腫瘤Warbu巧生理學(xué)，其特征在于高 糖酵解率(38)。我們的新陳代謝數(shù)據(jù)掲示了 C-26荷瘤小鼠的骨骼肌代謝(其完全被AR-42逆 轉(zhuǎn)）的明顯的重新編程。此外，AR-42對(duì)2-徑基下酸和視晶酸、膜島素抗性的生物標(biāo)志物（17) 和氧化應(yīng)激（18)的抑制作用是值得注意的，因?yàn)榇罅孔C據(jù)已經(jīng)將膜島素抗性(39,40)和氧 化應(yīng)激(41)與惡病質(zhì)相關(guān)聯(lián)。
[0091] 機(jī)械地，AR-42在荷瘤小鼠中保持骨骼肌的完整性的能力產(chǎn)生于其對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)錄程 序中腫瘤誘導(dǎo)的變化和代謝表型的多樣的、累積的作用。運(yùn)是具有治療意義的:在腫瘤生長(zhǎng) 末期，AR-42的經(jīng)口施用仍然在減緩C-26荷瘤小鼠的肌肉消耗的進(jìn)展中有效。整體上，運(yùn)些 發(fā)現(xiàn)表明，HDA巧審制劑(例如，AR-42)可W被用作癌癥惡病質(zhì)的綜合治療策略的一部分，如 本文描述的。
[0092] 本文描述的適用于HDA巧Φ制劑的施用的藥物載體或媒介物包括適用于特定施用 方式的任何運(yùn)樣的載體。此外，活性材料也可W與不損害期望的作用的其他活性材料、或與 補(bǔ)充期望的作用或具有其他作用的材料混合。化合物可W在組合物中作為單獨(dú)的藥學(xué)活性 成分配制，或可W與其他活性成分組合。
[0093] 在另一方面，如果皿A巧Φ制劑表現(xiàn)出不足的溶解性，可W使用增溶的方法。運(yùn)樣的 方法是已知的并且包括但不限于，使用助溶劑諸如二甲基亞諷(DMS0)、使用表面活性劑諸 如吐溫和溶解于碳酸氨鋼水溶液?；衔锏难苌?，諸如鹽或前藥，也可W用于配制有效的 藥物組合物。
[0094] 化合物的濃度對(duì)于在施用時(shí)遞送一定量是有效的，該量減輕或緩解針對(duì)其施用化 合物的素亂的至少一個(gè)癥狀。典型地，配制組合物用于單劑量施用。
[0095] 在另一方面，本文描述的HDA巧Φ制劑可W與保護(hù)其免于從身體快速清除的載體制 備，諸如時(shí)間-釋放制劑或包衣。運(yùn)樣的載體包括控釋制劑，諸如但不限于微囊化的遞送系 統(tǒng)?；钚曰衔锟勺鉝對(duì)受治療的患者施加治療上有用的作用、對(duì)受治療的患者不產(chǎn) 生不需要的副作用的量包括于藥學(xué)上可接受的載體中。治療有效濃度可W通過(guò)在受治療的 素亂的已知的體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)中測(cè)試化合物來(lái)從經(jīng)驗(yàn)上確定。
[0096] 在另一方面，本文描述的皿A巧Φ制劑和組合物可W封閉于多個(gè)或單個(gè)劑量容器 中。被封閉的化合物和組合物可W在試劑盒中提供，例如，包括可裝配在一起W便使用的部 件部分。例如，凍干形式的AR-42和適當(dāng)?shù)南♂寗┛蒞作為在使用前組合的獨(dú)立部件提供。 試劑盒可W包括AR-42和用于共同施用的第二治療劑。AR-42和第二治療劑可W作為獨(dú)立的 部件部分提供。試劑盒可W包括多個(gè)容器，每個(gè)容器容納本文描述的化合物的一個(gè)或更多 個(gè)單位劑量。在一個(gè)方面，容器可W適合期望的施用方式，包括但不限于用于經(jīng)口施用的片 劑、明膠膠囊、延遲釋放膠囊和類似物；用于腸道外施用的儲(chǔ)庫(kù)產(chǎn)品、預(yù)填充注射器、安飯 瓶、小瓶和類似物；W及用于局部施用的貼片、medipad、霜?jiǎng)┖皖愃莆铩?br>[0097] 藥物組合物中示例性HDA巧審制劑的濃度將取決于活性化合物的吸收、失活和排出 速率、劑量時(shí)間表和施用的量w及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素。
[0098] 在另一方面，活性成分可W-次施用，或可分成W時(shí)間間隔施用的多個(gè)較小劑量。 應(yīng)該理解，準(zhǔn)確的劑量和治療持續(xù)時(shí)間是被治療的疾病的函數(shù)，并且可W使用已知的試驗(yàn) 方案根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或從體內(nèi)或體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)推斷。應(yīng)注意，濃度和劑量值也可W隨著待緩 解的狀況的嚴(yán)重性變化。還應(yīng)理解，對(duì)于任何特定受試者，應(yīng)該根據(jù)個(gè)體需要和施用組合物 或監(jiān)督組合物的施用的人員的專業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)整具體的劑量方案，W及本文陳述的濃度 范圍僅是示例性的并且不意圖限定要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。
[0099] 如果期望經(jīng)口施用，可W在保護(hù)其避免胃的酸性環(huán)境的組合物中提供化合物。例 如，組合物可W配制成保持其在胃中的完整性并且在小腸中釋放活性化合物的腸溶衣中。 組合物也可W與抗酸藥或其他運(yùn)樣的成分組合配制。
[0100] 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體，并且可W被壓制成片劑或包封 于明膠膠囊中。出于經(jīng)口治療施用的目的，一種或更多種活性化合物可W與賦形劑合并，并 且可片劑、膠囊劑或錠劑的形式使用。藥學(xué)上相容的粘合劑和佐劑材料可W作為組合 物的一部分包括。
[0101] 片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑和類似物可W包含任意的W下成分或具有類似性質(zhì)的化 合物:粘合劑，諸如但不限于黃著膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠;賦形劑諸如微晶纖維素、 淀粉或乳糖;崩解劑諸如但不限于海藻酸和玉米淀粉;潤(rùn)滑劑諸如但不限于硬脂酸儀;助流 劑諸如但不限于膠體二氧化娃;甜味劑諸如薦糖或糖精;和矯味劑諸如薄荷、水楊酸甲醋或 水果矯味劑。
[0102] 當(dāng)單位劑型是膠囊劑時(shí)，它可W包含，除W上類型的材料W外，液體載體諸如脂肪 油。此外，單位劑型可W包含多種其他材料，其修飾劑量單位的外形，例如，糖包衣和其他腸 溶劑?；衔镆部蒞作為馳劑、懸液、糖漿、薄片(wafer)、口香糖或類似物的一部分施用。糖 漿可W包含，除活性化合物W外，薦糖作為甜味劑和某些防腐劑、染料和著色劑W及矯味 劑。
[0103] 活性材料也可W與不損害期望的作用的其他活性材料、或與補(bǔ)充所需作用的材料 混合。HDA巧Φ制劑可W，例如，與抗腫瘤劑、激素、醬類化合物或視黃醇組合使用。抗腫瘤劑 可W是許多化療劑之一，諸如烷基化劑、抗代謝物、激素劑、抗生素、秋水仙堿、長(zhǎng)春花生物 堿、L-天冬酷胺酶、丙卡己阱(procarbazine)、徑基脈、米托坦(mitotane)、亞硝基脈類或咪 挫甲酯胺。適當(dāng)?shù)脑噭┌ù龠M(jìn)微管蛋白去極化的那些試劑。實(shí)例包括秋水仙堿和長(zhǎng)春花 生物堿類，包括長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春花新堿。
[0104] 在另一方面，本文描述的HDA巧Φ制劑可W共同施用或在用疫苗免疫患者之前或之 后施用W增強(qiáng)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面，疫苗是，例如，DNA疫苗和HPV疫苗。
[0105] 在一個(gè)方面，用于腸道外的、經(jīng)皮的、皮下的或局部應(yīng)用的溶液或懸液可W包括任 意W下組分:無(wú)菌的稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、天然存在的植物油諸如 芝麻油、挪子油、花生油、棉巧油和類似物，或合成的脂肪媒介物諸如油酸乙醋和類似物、聚 乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑;抗微生物劑諸如苯甲醇和對(duì)徑基苯甲酸甲醋類;抗 氧化劑諸如抗壞血酸和亞硫酸氨鋼;馨合劑諸如乙二胺四乙酸化DTA);緩沖劑諸如乙酸鹽、 巧樣酸鹽和憐酸鹽;和用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑諸如氯化鋼和右旋糖。腸道外制劑可W封裝 于安飯瓶、一次性注射器或玻璃、塑料或其他適當(dāng)?shù)牟牧现瞥傻亩鄤┝啃∑恐?。可W按需要 滲入緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑和類似物。
[0106] 當(dāng)經(jīng)靜脈施用時(shí)，適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于，生理鹽水、憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)和 包含增稠劑和溶解劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物)的溶液。包括組織祀向 的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體懸液或任何其他納米顆粒遞送系統(tǒng)也可W適合作為藥學(xué)上可接受的載 體。運(yùn)些可W根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。
[0107] 在其他方面，HDA巧Φ制劑可W與保護(hù)化合物避免身體快速清除的載體制備，諸如 時(shí)間釋放制劑或包衣。運(yùn)樣的載體包括控釋制劑，諸如但不限于植入物和微囊化的遞送系 統(tǒng)和可生物降解的、生物相容的聚合物諸如膠原蛋白、乙締乙酸乙醋（ethylene vinyl ace化te)、聚酸酢、聚乙醇酸、聚原酸醋、聚乳酸和類似物。制備運(yùn)樣的制劑的方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的。
[0108] 在又另一方面，在本公開(kāi)內(nèi)容的方法中使用的化合物可W經(jīng)腸道或經(jīng)腸道外施 用。當(dāng)經(jīng)口施用時(shí)，在本公開(kāi)內(nèi)容的方法中使用的化合物可本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用 于經(jīng)口施用的一般劑型施用。運(yùn)些劑型包括片劑和膠囊劑的一般固體單位劑型和液體劑 型，諸如溶液、懸液和馳劑。當(dāng)使用固體劑型時(shí)，它們可W是持續(xù)釋放類型，運(yùn)樣在本文描述 的方法中使用的化合物需要每日僅施用一次或兩次。
[0109] 口服劑型可W向患者每日施用1次、2次、3次或4次。本文描述的HDA巧審制劑可W每 日施用3次或更少的次數(shù)，或甚至每日1次或2次。因此，在本公開(kāi)內(nèi)容的方法中使用的HDAC 抑制劑化合物可口服劑型施用。無(wú)論使用何種口服劑型，它們可W被設(shè)計(jì)W保護(hù)本文 描述的方法中使用的化合物免受胃的酸性環(huán)境。腸溶包衣片是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此 夕h用每個(gè)被包衣W保護(hù)免受酸性的胃的小球填充的膠囊，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0110] 使用術(shù)語(yǔ)"治療有效量"和"治療有效的時(shí)間段"表示W(wǎng)對(duì)降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有效 的劑量和時(shí)間段的治療。如W上所述，運(yùn)樣的施用可W是腸道外的、經(jīng)口的、經(jīng)舌下的、經(jīng)皮 的、局部的、鼻內(nèi)的或直腸內(nèi)的。在一個(gè)方面，當(dāng)全身施用時(shí)，治療組合物可足W將化合 物的血液水平保持在從約0. ΙμΜ至約1 OOmM的劑量施用。對(duì)于局部施用，比此低得多的濃度 可W是有效的，并且高得多的濃度是可W被耐受的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，導(dǎo)致HDA巧審制 劑或AR-42的較低有效濃度的運(yùn)樣的治療作用可隨著組織、器官或待被治療的特定動(dòng)物或 患者大幅變化。還應(yīng)理解，盡管患者可W在一個(gè)劑量開(kāi)始，該劑量可W隨著患者狀況改變而 隨時(shí)間變化。
[0111] 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明顯的是:施用的準(zhǔn)確劑量和頻率將根據(jù)施用的本公開(kāi)內(nèi)容 的方法中使用的特定化合物、被治療的特定狀況、被治療的狀況的嚴(yán)重程度、特定患者的年 齡、重量、總體身體狀況W及該個(gè)體可能服用的其他藥物，如本領(lǐng)域的管理醫(yī)師公知的。 實(shí)施例
[0112] W下非限制性實(shí)施例說(shuō)明了本文描述的方面。
[01。] 實(shí)施例1
[0114] 癌癥惡病質(zhì)模型 [011引 C-26模型
[0116] 在一個(gè)方面，通過(guò)向雄性CD2F1小鼠（大約6周齡；HarIan Laborator ies , Indianapolis，IN)的右脅皮下注射C-26細(xì)胞(0.5xl06細(xì)胞于0.1ml)建立腫瘤（11)。將荷瘤 小鼠 W及作為非-惡病質(zhì)對(duì)照的無(wú)腫瘤小鼠隨機(jī)分配到用AR-42(50mg/kg，通過(guò)灌胃口服， 每隔一天;Arno Therapeutics,Inc. ,Flemington,NJ)或媒介物(0.5% 甲基纖維素(w/v)和 0.1%吐溫-80(v/v)于無(wú)菌水)治療的組中，治療從細(xì)胞注射后6天開(kāi)始。為了研究推遲治療 的作用，在癌細(xì)胞注射后6、10和12天開(kāi)始用藥物和/或媒介物治療。
[0117] 在另一方面，比較AR-42與其他皿AC抑制劑的作用。在此方面，用vorinostat (50mg/kg，口服，每日一次）和;romidepsin(0.6mg/kg ;腹膜內(nèi)；每周2次）（ChemieTek (Indianapo 1 iS, IN))治療C-26荷瘤小鼠的另外的組。
[011引 LLC模型
[0119] 在另一方面，通過(guò)向右脅注射0.5x106LLC細(xì)胞在雄性巧7BL/6小鼠（大約6周齡； 化rlan)中建立皮下腫瘤。從細(xì)胞注射后6天開(kāi)始，如對(duì)C-26模型一樣進(jìn)行用AR-42和媒介物 的治療。在兩個(gè)模型中，每日監(jiān)測(cè)體重和食物消耗，并且不低于每?jī)商斓販y(cè)量腫瘤大小。處 死前將小鼠禁食2小時(shí)，在處死時(shí)收集后肢肌肉、屯、臟、脾臟、附睪脂肪和血液，并且測(cè)量實(shí) 體組織的重量。在液氮冷卻的2-甲基下燒中冷凍肌肉樣品，并且隨后儲(chǔ)存在-80°C直到分 析。
[0120] 實(shí)施例2
[0121] 握力測(cè)量
[0122] 小鼠使用數(shù)字握力計(jì)(Col皿bus Ins化uments,Columbus,0H)測(cè)量前肢握力。從每 個(gè)小鼠得到5個(gè)測(cè)量，其平均數(shù)被指定為該小鼠的握力。
[01U]肌肉纖維大小的形態(tài)計(jì)量分析
[0124]使用低溫恒溫器化eica)從冷凍的骨骼肌樣品上切下10-μπι切片并隨后用H&E染 色。使用Olympus ΒΧ51顯微鏡（Olympus America, Inc.)拍攝圖像，并且使用Olympus CellSens 1.11軟件確定肌肉纖維橫截面面積。從每個(gè)組的5只小鼠的每一只的肌肉的5個(gè) 不同切片得到測(cè)量值。
[01巧]RNA分離、qRT-PCR和RNA-序列分析
[01%]用TRIzol試劑(Xife Technologies,Carlsbad,CA)從勻質(zhì)化的脾腸肌肌肉（n = 3/ 組)分離總RNA，并且隨后使用RNAeasy迷你試劑盒(Qiagen,化lencia,CA)純化。如之前所述 (42)，使用具有iQ SYBR Green Supermix的Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad, Hercules，CA)進(jìn)行qRT-PCR。圖8中列出了引物序列。在俄亥俄州立大學(xué)綜合癌癥中屯、 (0SUCCC)核酸共享資源進(jìn)行RNA-序列庫(kù)生成和數(shù)據(jù)分析。
[0127] 代謝組學(xué)和細(xì)胞因子圖譜分析
[0128] 在細(xì)胞注射后第17天，從每個(gè)治療組收集脾腸肌肌肉和血清(n = 8/組）。將肌肉提 交給Metabolon，Inc. (Durham,NC)用于通過(guò)專有質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行270個(gè)代謝中間物的代謝組 學(xué)分析。將血清提交給Eve Technologies(A化erta,Canada)用于使用小鼠細(xì)胞因子陣列 (32-重板)進(jìn)行32個(gè)細(xì)胞因子的分析。
[0129] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0130] 通過(guò)使用SAS 9.3軟件(SAS，Inc;化巧，NC)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于使用重復(fù)量度的試 驗(yàn)，用混合作用模型分析數(shù)據(jù)，并入遍及每個(gè)受試者的觀測(cè)依賴性。對(duì)于設(shè)及獨(dú)立組的其他 試驗(yàn)，用AN0VA分析數(shù)據(jù)。對(duì)于時(shí)間-對(duì)-事件試驗(yàn)（圖2B )，用對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn)比較存活功能的差 異。用化Im's方法調(diào)整多樣性W控制總體家族誤差率在0.05。通過(guò)使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件（Ingenuity Systems,Redwood City,CA)分析RNA-序列數(shù)據(jù)。僅選擇> 4倍變化且P<0.05的基因用于通路分析。
[0131] 實(shí)施例3
[0。。AR-42抑制C-26結(jié)腸腺癌模型的癌癥惡病質(zhì)
[0133]在一個(gè)方面，從注射C-26細(xì)胞后6天，當(dāng)形成明顯的腫瘤時(shí)，每隔一天用AR-42 (50mg/kg)或媒介物通過(guò)灌胃經(jīng)口地治療小鼠。媒介物組顯示出從第12天開(kāi)始的體重的大 幅下降，而AR-42治療的小鼠保持它們的體重在與無(wú)腫瘤對(duì)照的小鼠的體重相當(dāng)?shù)乃剑▓D 1A，左圖）。截止到研究終點(diǎn)（第15天），減去腫瘤的質(zhì)量（1 cm3體積=1克質(zhì)量)后，媒介物-治 療組的重量損失的大小達(dá)到>20%，并且AR-42-治療小鼠的重量損失達(dá)到6% (中圖）。此效 應(yīng)不能歸因于降低的腫瘤負(fù)荷，因?yàn)锳R-42不相對(duì)于媒介物改變腫瘤生長(zhǎng)(右），或增加食物 攝入，因?yàn)槠骄咳障脑贏R-42-治療組和媒介物-治療組是相當(dāng)?shù)?，并且低于無(wú)腫瘤小鼠 的平均每日消耗（圖1C)。盡管AR-42-治療的小鼠有大腫瘤負(fù)荷，它們警覺(jué)、反應(yīng)敏捷、有活 力，并且在截止研究終點(diǎn)，不具有在媒介物-治療的相對(duì)物中觀察到的駝背的姿態(tài)和粗糖的 皮毛（圖1B)。
[0134] 實(shí)施例4
[0。引 AR-42保護(hù)肌肉避免惡病質(zhì)誘導(dǎo)的萎縮癥
[0136] 與體重的維持一致，在AR-42-治療的荷瘤小鼠中維持骨骼肌重量。作為惡病質(zhì)的 指示，相對(duì)于來(lái)自無(wú)腫瘤對(duì)照小鼠的相應(yīng)肌肉，來(lái)自媒介物治療的荷瘤小鼠（荷瘤的/媒介 物）的脾腸肌、腔骨前肌和四頭肌的重量分別降低了20.6%、10.5%和18.1%，而AR-42治療 的荷瘤小鼠（荷瘤的/AR-42)中的那些肌肉的重量分別降低了 9.6%、0.8%和5.8%(圖10)。
[0137] 荷瘤的/媒介物小鼠表現(xiàn)出惡病質(zhì)的其他標(biāo)志，包括屯、臟組織和特別是脂肪組織 質(zhì)量的顯著損失（無(wú)腫瘤對(duì)照的29.3±6.0%)，運(yùn)被AR-42治療緩解（圖1E，上圖）。有趣的 是，AR-42顯著降低了無(wú)腫瘤小鼠的脂肪組織質(zhì)量的大約50%，但是使荷瘤小鼠的脂肪組織 質(zhì)量的損失恢復(fù)到與無(wú)腫瘤/AR-42小鼠相當(dāng)?shù)乃?，運(yùn)個(gè)二分的作用表明其保持脂質(zhì)平衡 的能力。
[0138] 在另一方面，相對(duì)于無(wú)腫瘤對(duì)照小鼠（11)，C-26荷瘤小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重?cái)U(kuò)大的脾臟， 運(yùn)沒(méi)有通過(guò)AR-42改善（圖化，下圖）。由于C-26荷瘤小鼠的脾增大來(lái)自骨髓源抑制細(xì)胞和脾 臟(12)中其他免疫細(xì)胞的擴(kuò)張，此發(fā)現(xiàn)表明，AR-42主要作用于肌肉而非通過(guò)免疫機(jī)制。
[0139] AR-42抗肌肉損耗的保護(hù)性作用通過(guò)終止惡病質(zhì)-引發(fā)的骨骼肌纖維大小的減小 證明。相對(duì)于無(wú)腫瘤對(duì)照，荷瘤的/媒介物小鼠在第15天的肌肉纖維的平均橫截面積表現(xiàn)出 48.2 % 的降低（1297.6 ± 638.8對(duì)2503.5 ± 917.5μπι2)，其被AR-42恢復(fù)（2146.3 ± 923.4μπι2) (圖2Α，左圖）。荷瘤的/媒介物小鼠的惡病質(zhì)肌肉中，纖維大小分布向更小的橫截面積的突 出轉(zhuǎn)變被AR-42逆轉(zhuǎn)（圖2Α，右圖）。
[0140] AR-42延長(zhǎng)了 C-26荷瘤小鼠的存活
[0141 ] 在C-26荷瘤小鼠中比較AR-42與其他HDA巧審制劑（即，vorinostat和romid邱sin) 的作用。從腫瘤細(xì)胞注射后第6天開(kāi)始，用AR-42(每隔一天50mg/kg，經(jīng)口地）、vorinostat [每日一次50mg/kg，經(jīng)口地（13)] jomid邱sin[每周兩次0.6mg/kg，腹膜內(nèi)（14)]或媒介物 連續(xù)治療小鼠，直到重量損失達(dá)到開(kāi)始重量的20%，如通過(guò)每日體重測(cè)量和減去腫瘤質(zhì)量 確定的。如所示的，口服AR-42在保護(hù)運(yùn)些小鼠免受腫瘤-相關(guān)的損耗方面有效，在第21天當(dāng) 腫瘤體積達(dá)到安樂(lè)死的闊值時(shí)具有100%累計(jì)存活率（圖2B)。與之相比，vorinostat和 romidepsin對(duì)體重表現(xiàn)出有限的或無(wú)可觀的保護(hù)作用。此外，與媒介物-(第15天）、 romidepsin-(第16天)和vorinostat-治療的小鼠（第18天)不同，荷瘤的/AR-42小鼠在腫瘤 細(xì)胞注射后的21天警覺(jué)、反應(yīng)敏捷、有活力，并且表現(xiàn)的健康(圖2C)。
[01創(chuàng)實(shí)施例3
[01創(chuàng)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)的差異化作用
[0144] 骨骼肌質(zhì)量由蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡調(diào)節(jié)。不圓于理論，相信AR-42對(duì) vorinostat和romidepsin的差異化的抗惡病質(zhì)作用可W歸因于其調(diào)節(jié)控制蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的 通路的能力的差異。運(yùn)由AR-42對(duì)Atrogin-1/MAFbx和MuRFl的mRNA表達(dá)的抑制作用支持， Atrogin-1/MA即X和MuRFl是參與泛素-介導(dǎo)的骨骼肌蛋白降解（15，16)的兩種E3連接酶（圖 2D)。
[0145] 脾腸肌肌肉的qPCR掲示了，相對(duì)于無(wú)腫瘤/媒介物對(duì)照(n = 6)，惡病質(zhì)肌肉（荷瘤 的/媒介物;n = 8)中Atrogin-1和MuRFlmRNA水平的顯著升高(分別為29.4 ± 3.5倍和25.8 ± 3.9倍）eAR-42能夠?qū)trogin-1 (2.7 ±0.7倍)和MuRFl (1.1 ±0.2倍)mRNA的表達(dá)恢復(fù)到基 礎(chǔ)水平(n = 8) eVo;rinostat(n = 8)和romid邱sin(n = 5)也顯著降低惡病質(zhì)肌肉中運(yùn)兩種E3 連接酶的mRNA表達(dá)，但W比AR-42更小的程度(Ahogin-l/MuRFI: vorinostat，9.6 + 1.8/ 5.5±1.1倍^〇1111(1巧3111，19.6±3.1/14.6±3.3倍）（圖20)。
[0146] 為確認(rèn)AR-42的抗惡病質(zhì)活性不是對(duì)C-26模型特異性的，還在化C模型中評(píng)價(jià)。月中 瘤細(xì)胞注射后6天開(kāi)始，用AR-42(50mg/kg，口服，每隔一天)治療荷皮下化C腫瘤的巧7BL/6 小鼠，并且持續(xù)直到第20天，此時(shí)處死收獲后肢肌肉。如圖7中所示，AR-42保護(hù)荷LLC腫瘤的 C57化/6小鼠避免肌肉質(zhì)量損失（脾腸肌:媒介物，非-惡病質(zhì)對(duì)照的81.7 ± 3.7 % ; AR-42， 92.2±3.5%;腔骨前肌:媒介物，80.3±4.0%;43-42,93.4±3.9%;四頭肌:媒介物，84.4 ±4.6%;43-42,93.4±4.8%;所有?值<0.05，11 = 8)。
[0147] 實(shí)施例4
[014引 AR-42在荷瘤小鼠中保持肌肉的代謝完整性
[0149] 由于惡病質(zhì)，骨骼肌響應(yīng)腫瘤/宿主衍生的炎性和神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激因子（1)而經(jīng)歷 復(fù)雜的代謝變化。因此，我們進(jìn)行了代謝譜分析W探究AR-42對(duì)惡病質(zhì)誘導(dǎo)的骨骼肌的代謝 表型的變化的作用。如上所述用媒介物或AR-42治療無(wú)腫瘤小鼠和C-26荷瘤小鼠，在第17天 收集脾腸肌肌肉用于代謝組學(xué)分析。在4組(n = 8/組）中的肌肉生化譜的比較掲示了 AR-42 恢復(fù)骨骼肌中惡病質(zhì)誘導(dǎo)的代謝變化的能力，其如W下總結(jié)的。
[0150] 糖酵解.來(lái)自荷瘤的/媒介物小鼠的惡病質(zhì)肌肉表現(xiàn)出比無(wú)腫瘤對(duì)照的顯著更低 的葡萄糖和關(guān)鍵糖酵解中間物的水平（圖3A)"AR-42逆轉(zhuǎn)了運(yùn)些代謝變化，將葡萄糖和中間 物的肌肉內(nèi)水平恢復(fù)至，或者，在一些情況下，高于在無(wú)腫瘤/媒介物小鼠中檢測(cè)的基線水 平。此外，升高的葡萄糖被分流到山梨糖醇-果糖生物合成和戊糖憐酸途徑，導(dǎo)致山梨糖醇、 果糖、核糖(一種源自戊糖憐酸途徑的代謝物)的增加的產(chǎn)生。
[0151] 糖原膽積.來(lái)自荷瘤的/媒介物小鼠的肌肉顯示出短鏈低聚麥芽糖和葡萄糖-1-憐 酸的顯著降低（圖3B)，表明惡病質(zhì)肌肉的糖原膽積的耗盡。AR-42治療顯著地補(bǔ)充了運(yùn)些糖 原代謝中間物。
[0152] 游離氨基酸.與表征肌肉消耗的升高的蛋白質(zhì)降解一致，來(lái)自荷瘤的/媒介物小鼠 的惡病質(zhì)肌肉中大量游離氨基酸相對(duì)于無(wú)腫瘤/媒介物小鼠中的那些顯著地提高（圖4)，表 明惡病質(zhì)表型。類似地，充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)的幾個(gè)氨基酸衍生物/代謝物增加，包括犬尿氨酸 化ynurenin)、N-乙酷基-天口冬氨酷-谷氨酸和丫-氨基下酸。相反，丙氨酸，其由肌肉釋放 W支持肝糖異生，在惡病質(zhì)肌肉中降低。此惡病質(zhì)表型被AR-42治療逆轉(zhuǎn)，表明其阻止肌肉 蛋白質(zhì)降解的能力。
[0153] 有機(jī)酸.氨基酸代謝物2-徑基下酸和視晶酸分別是膜島素抗性（17)和氧化應(yīng)激 (18)的生物標(biāo)志物。運(yùn)兩種有機(jī)酸在荷瘤的/媒介物小鼠的肌肉中的增加（圖4)表明，惡病 質(zhì)促進(jìn)膜島素抗性和氧化應(yīng)激，其反過(guò)來(lái)加劇肌肉消耗。AR-42將兩種生物標(biāo)志物急劇降低 至與在無(wú)腫瘤小鼠中測(cè)量的那些相當(dāng)?shù)乃健?br>[0154] 實(shí)施例5
[01巧]AR-42通過(guò)祀向多個(gè)促-惡病質(zhì)驅(qū)動(dòng)物抑制癌癥惡病質(zhì)
[0156] 為闡釋AR-42藉W介導(dǎo)其抗-惡病質(zhì)作用的機(jī)制，分別使用來(lái)自媒介物或AR-42-治 療的無(wú)腫瘤小鼠和C-26荷瘤小鼠的血清和脾腸肌肌肉用于細(xì)胞因子譜分析和全轉(zhuǎn)錄組鳥(niǎo) 槍測(cè)序法(RNA-序列）。
[0157] 細(xì)胞因子譜.32種檢測(cè)的細(xì)胞因子中（圖10)，IL-6和白血病抑制因子化IF)，兩種 公認(rèn)的惡病質(zhì)驅(qū)動(dòng)物（19)，在荷瘤的/媒介物小鼠的血清中相對(duì)于無(wú)腫瘤/媒介物小鼠顯著 增加（比-6,230±105對(duì)2.9±1.3口邑/1111;1^尸，19.7±9.3對(duì)1.7±1.5口邑/1111)(圖54，上圖），而 沒(méi)有觀察到其它細(xì)胞因子的顯著差異。與媒介物-治療的相對(duì)物相比，在荷瘤小鼠中，AR-42 分別降低了比-6和LIF水平的56 %和88 % (化-6，102 ± 38pg/ml; LIF，3.8 ± 1.6pg/ml)。鑒于 AR-42減弱比-6的惡病質(zhì)相關(guān)的增加的能力，我們檢驗(yàn)了AR-42對(duì)化-6受體α鏈（比-6Ra)的 肌肉內(nèi)mRNA水平的作用。與無(wú)腫瘤小鼠 （n = 6)的a-6RamRNA相比，荷瘤的/媒介物小鼠 （n = 9)的肌肉中IL-6RamRNA顯著增加（13± 1.4倍）dAR-42將此惡病質(zhì)誘導(dǎo)的增加降低了85% (2.0±0.2倍;11=10)(圖5，下圖）。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)表明，41?-42部分通過(guò)阻斷化-6信號(hào)傳導(dǎo)抑制肌 肉消耗。
[015引 RNA-序列分析.RNA-序列數(shù)據(jù)的主成分分析(Principal component analysis)掲 示了相對(duì)于無(wú)腫瘤/媒介物對(duì)應(yīng)物，C-26腫瘤在荷瘤的/媒介物小鼠的肌肉中對(duì)全基因表達(dá) 模式的明顯的作用（圖5B，左圖）。盡管AR-42在無(wú)腫瘤小鼠的非-惡病質(zhì)肌肉中對(duì)基因表達(dá) 的模式?jīng)]有明顯作用，它將腫瘤-誘導(dǎo)的惡病質(zhì)肌肉的基因表達(dá)的變化逆轉(zhuǎn)至接近無(wú)腫瘤 小鼠的狀態(tài)。據(jù)此，我們進(jìn)行了荷瘤的/媒介物小鼠和其他Ξ個(gè)治療組之間的差異化表達(dá)基 因的配對(duì)分析，其結(jié)果在文氏圖中展現(xiàn)（圖5B，右側(cè)）。配對(duì)分析的重疊的大面積表明，AR-42 W很大程度恢復(fù)全基因表達(dá)中腫瘤-誘導(dǎo)的變化。
[0159] 來(lái)自媒介物-和AR-42-治療的荷瘤小鼠的肌肉的基因表達(dá)的配對(duì)比較掲示了具有 4倍或更大的差異化表達(dá)的總計(jì)677個(gè)基因（376個(gè)上調(diào)和301個(gè)下調(diào)）（圖10)。使用 Ingenuity Pathway Analysis!；IPA)對(duì)運(yùn)些基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行的功能和疾病相關(guān)的分析掲 示了，運(yùn)些差異化表達(dá)基因的66個(gè)被注釋為萎縮癥、收縮能力、發(fā)育和肌肉形態(tài)W及骨骼肌 細(xì)胞大小、肌肉細(xì)胞死亡和蛋白質(zhì)分解代謝的類別（圖11)。
[0160] 運(yùn)些肌肉功能-相關(guān)基因和疾病-相關(guān)基因中，鑒于其已經(jīng)建立的與癌癥-誘導(dǎo)的 惡病質(zhì)的聯(lián)系，AR-42對(duì)W下6個(gè)基因的作用是值得注意的。運(yùn)些包括化xol(編碼叉頭框蛋 白01 )(20-23)及其祀基因 Trim63(MuRFl)和即xo32(Atrogin-l )(24,25)、PNPLA2[脂肪組織 甘油Ξ醋脂肪酶(ATGL) ] (26，27)、UCP3(解偶聯(lián)蛋白3) (28，29)和Mef 2c[肌源性轉(zhuǎn)錄因子肌 細(xì)胞增強(qiáng)因子](30)(圖5C)。由qRT-PCR進(jìn)行的運(yùn)6個(gè)基因的RNA-序列數(shù)據(jù)的驗(yàn)證表現(xiàn)了4個(gè) 治療組中相對(duì)mRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)組之間的高相關(guān)性（圖5D)。
[0161] 實(shí)施例6
[01創(chuàng)延遲的AR-42治療在抑制肌肉損耗中保持有效
[0163] W上發(fā)現(xiàn)證明了口服AR-42通過(guò)在骨骼肌中恢復(fù)代謝和基因表達(dá)譜在抑制癌癥相 關(guān)的肌肉損耗中的效力。在那些試驗(yàn)中，在惡病質(zhì)進(jìn)展早期當(dāng)損耗的明顯的標(biāo)志不可檢測(cè) 時(shí)開(kāi)始治療。為研究AR-42治療的推遲的開(kāi)始是否依然保護(hù)免受惡病質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞注射后 6天、10天和12天開(kāi)始用AR-42 (50mg/kg，口服，每隔一天)治療C-26荷瘤小鼠。
[0164] 與我們的早期數(shù)據(jù)（圖1) 一致，截止到第17天，荷瘤的/媒介物小鼠損失體重(不包 括腫瘤）的19%。與之相比，在第6天(D6)、第10天(D10)或第12天(D12)開(kāi)始的AR-42治療分 別將體重?fù)p失限制在6%、11%和12%(n = 8)(圖6A，左圖），對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯作用（右圖）。 此外，AR-42-治療的小鼠表現(xiàn)出比其媒介物-治療的對(duì)應(yīng)物更好的健康的跡象（圖6B)。AR- 42 的運(yùn)個(gè)保護(hù)作用反映在脾腸肌重量和， W 更小的程度，腔骨前肌和四頭肌肌肉的重量的 保留上（圖6C)。與對(duì)肌肉質(zhì)量的保護(hù)作用一致，手握肌力測(cè)定法化andgr iP dynamomet巧） 表明，在第15和16天，相對(duì)于媒介物-治療的對(duì)照，在所有藥物治療組中，AR-42幫助保留前 肢肌肉力量(圖6D)。
[01化]實(shí)施例7
[0166] 荷瘤的/媒介物小鼠表現(xiàn)出惡病質(zhì)的其他標(biāo)志，包括屯、肌，和特別是，脂肪組織質(zhì) 量的顯著損失(無(wú)腫瘤對(duì)照的29.3±6.0%)，該損失由AR-42治療緩解（圖化，上圖）。有趣的 是，AR-42顯著降低了無(wú)腫瘤小鼠的脂肪組織質(zhì)量的大約50%，但是使荷瘤小鼠的脂肪組織 質(zhì)量的損失恢復(fù)到與無(wú)腫瘤/AR-42小鼠相當(dāng)?shù)乃剑\(yùn)個(gè)對(duì)立的作用表明其保持脂質(zhì)平衡 的能力。
[0167] 相對(duì)于無(wú)腫瘤對(duì)照小鼠（11)，C-26荷瘤小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重?cái)U(kuò)大的脾臟，運(yùn)沒(méi)有通過(guò) AR-42改善（圖1E，下圖）。由于C-26荷瘤小鼠的脾增大來(lái)自骨髓源抑制細(xì)胞和脾臟中其他免 疫細(xì)胞的擴(kuò)張（12)，此發(fā)現(xiàn)表明，AR-42主要作用于肌肉而非通過(guò)免疫機(jī)制。
[0168] AR-42抗肌肉損耗的保護(hù)性作用通過(guò)終止惡病質(zhì)-引發(fā)的骨骼肌纖維大小的減小 證明。相對(duì)于無(wú)腫瘤對(duì)照，荷瘤的/媒介物小鼠在第15天的肌肉纖維的平均橫截面積表現(xiàn)出 48.2 % 的降低（1297.6 ± 638.8對(duì)2503.5 ± 917.5μπι2)，其被AR-42恢復(fù)（2146.3 ± 923.4μπι2) (圖2Α，左圖）。荷瘤的/媒介物小鼠的惡病質(zhì)肌肉中，纖維大小分布向更小的橫截面積的突 出轉(zhuǎn)變被AR-42逆轉(zhuǎn)（圖2Α，右圖）。
[01~]實(shí)施例8
[0170] 對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)的差異化作用
[0171] 由于骨骼肌質(zhì)量由蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡調(diào)節(jié)，AR-42對(duì)vorinostat和 romid邱sin的差異化的抗惡病質(zhì)作用可W歸因于其調(diào)節(jié)控制蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的通路的能力的 差異。運(yùn)由AR-42對(duì)Atrogin-1/MAFbx和MuRFl的mRNA表達(dá)的抑制作用支持，Atrogin-1/ ΜΑ即X和MuRFl是參與泛素-介導(dǎo)的骨骼肌蛋白降解的兩種E3連接酶（15，16)(圖2D)。如預(yù)期 地，脾腸肌肌肉的qPCR掲示了，相對(duì)于無(wú)腫瘤/媒介物對(duì)照(n = 6)，惡病質(zhì)肌肉（荷瘤的/媒 介物;n = 8)中Mrogin-l和MuRFlmRNA水平的顯著升高（分別為29.4±3.5倍和25.8±3.9 倍）dAR-42能夠?qū)trogin-1 (2.7 ±ο. 7倍)和MuRFl (1.1 ±ο. 2倍)mRNA的表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水 平(n = 8)。￥〇1'；[]1〇31:曰1:(]1 = 8)和1'〇1111(1邱3；[]1(]1 = 5)也顯著降低惡病質(zhì)肌肉中運(yùn)兩種63連接 酶的mRNA表達(dá)，但 W 比AR-42更小的程度(Atrogin-l/MuRFl: vorinostat，9.6 ± 1.8/5.5 ± 1.1倍^〇1111(1巧3111，19.6±3.1/14.6±3.3倍）（圖20)。
[017。實(shí)施例9
[0173] im
[0174] 在37°C、5%C02的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)的C-26和化C細(xì)胞分別保持在胎牛血清 (FBS)-補(bǔ)充的（10%)RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen，Carlsbad，CA)中。為了 注射進(jìn)入小鼠建立癌癥惡病質(zhì)模型，通過(guò)膜蛋白酶處理收獲細(xì)胞、在FBS-補(bǔ)充的培養(yǎng)基中 沉淀并且隨后W5 X 106細(xì)胞/ml的濃度重懸于無(wú)菌PBS中。
[0175] 小鼠
[0176] 在恒定光周期（12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗）、溫度和濕度W及自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食 的條件下，將CD2F1和巧7BL/6小鼠群養(yǎng)。通過(guò)口服灌胃施用藥物(AR-42、vorinostat、媒介 物)期間，將小鼠短暫地麻醉(異氣燒，3-4%)。通過(guò)每日稱量每籠的食物的重量并且用食物 的每日降低量除W籠中小鼠的數(shù)目來(lái)估計(jì)食物消耗。使用標(biāo)準(zhǔn)公式(長(zhǎng)X寬2xV6)從測(cè)徑儀 (ca 1 i P er)測(cè)量值計(jì)算腫瘤體積。
[0177] 握力測(cè)量
[0178] 為測(cè)量前肢握力，握住每只小鼠的尾己的基部，并將其在儀器上方降低，直到其前 爪抓住拉桿。然后將小鼠沿水平方向W直線從握力計(jì)緩緩移開(kāi)，直到小鼠釋放桿，并且記錄 獲得的最大力。從每個(gè)小鼠得到5個(gè)測(cè)量值，其平均數(shù)被指定為該小鼠的握力。
[0179] RNA-序列庫(kù)的產(chǎn)生和數(shù)據(jù)分析流水線
[0180] 使用Pico RNA忍片在Agilent 2100生物分析儀上評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量，并且使用Agilent Qubit RNA測(cè)定評(píng)價(jià)輸入的總RNA量。使用Illumina TruSeq RNA樣品制備試劑盒V2制備轉(zhuǎn) 錄組庫(kù)。使用Agilent Qubit DNA測(cè)定和用化rki址Imer Labchip DNA GX分析分別評(píng)價(jià)所 得庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量。W等份混合所有的庫(kù)產(chǎn)生樣品池，該樣品池在用Illumina化Seq 2500 測(cè)序儀上測(cè)序時(shí)能夠獲得大約4000萬(wàn)通過(guò)的過(guò)濾器讀數(shù)(passed filter reads)。使用 FastQC、RNASeQC和RSeQC軟件評(píng)價(jià)來(lái)自Illumina Hiseq CASAVA流水線的原始測(cè)序數(shù)據(jù)的 質(zhì)量。隨后的分析如下：使用Top化t 2(v2.0.7)RNA序列對(duì)齊器(aligner)將去多路復(fù)用的 通過(guò)過(guò)濾器的測(cè)序讀數(shù)與GRCm38/mmlO對(duì)齊;使用CufTLinks 2(c2.1.1)將對(duì)其的讀數(shù)與 UCSCmmlO基因注釋裝配;使用CuffCompare和化ffMerge匯編對(duì)齊的讀數(shù)和mmlO基因，并且 將轉(zhuǎn)錄物合并組裝成自定義的基因注釋;使用CuffDiff比較與每個(gè)治療組相關(guān)的差異化基 因表達(dá)。
[0181] 實(shí)施例10
[0182] 為確認(rèn)AR-42的抗-惡病質(zhì)活性不是對(duì)C-26模型特異性的，還在化C模型中評(píng)價(jià)了 AR-42。腫瘤細(xì)胞注射后第6天，開(kāi)始用AR-42(50mg/kg，口服，每隔一天)治療荷皮下11UX月中 瘤的巧7BL/6小鼠，并且持續(xù)直到第20天，此時(shí)處死采集后肢肌肉。
[0183] 如圖7中示出的，AR-42在惡病質(zhì)的化C小鼠模型中保護(hù)免受癌癥-誘導(dǎo)的肌肉損 耗。，比較了在無(wú)腫瘤和荷瘤小鼠二者中AR-42對(duì)媒介物對(duì)后肢肌肉，包括脾腸肌、腔骨前肌 和四頭肌的質(zhì)量的作用與媒介物治療的荷瘤小鼠中的那些。用圖1A描述的相同方法治療小 贏，除了在腫瘤細(xì)胞注射后第20天處死小贏。平均值±S.D.呈現(xiàn)數(shù)據(jù)(n = 8);(脯腸肌:媒 介物，非-惡病質(zhì)對(duì)照的81.7 ±3.7% ;AR-42,92.2 ±3.5% ;胚骨前?。好浇槲?，80.3 ± 4.0%;六民-42,93.4±3.9%;四頭肌:媒介物，84.4±4.6%;六民-42,93.4±4.8%;全部口值〈 0·05，η二8) D [0184] 參考文獻(xiàn)
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[0227] 盡管W上描述提及特定方面，應(yīng)理解這些方面僅僅是說(shuō)明性的。對(duì)本文描述的方 法可W進(jìn)行多種改變和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。因此，本說(shuō)明書(shū)意圖包括 隨附的權(quán)利要求和其等價(jià)物的范圍內(nèi)的改變和變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抑制患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的惡病質(zhì)的方法，包括以與未接受1類和2b類HDAC抑制 劑的哺乳動(dòng)物相比有效地基本上保持所述哺乳動(dòng)物的體重的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類和 2b類HDAC抑制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是AR-42。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在用AR-42治療后約最初15天后，所述哺乳動(dòng)物的 體重不降低多于約6%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥選自由胰腺癌、結(jié)腸癌、頭部癌癥、頸部癌 癥、胃癌和食道癌組成的組。5. 據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中以約lmg/kg至約100mg/kg所述哺乳動(dòng)物的量施用 AR-42〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中AR-42被一天至少一次地施用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中AR-42以約50mg/kg所述哺乳動(dòng)物的量被一天兩次 地施用。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，IL-6的水平降低 了約 56 %。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，LIF的水平降低 了約 88 %。11. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，Atrogin-lmRNA 的表達(dá)恢復(fù)到基線水平。12. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，MuRFlmRNA的表 達(dá)恢復(fù)到基線水平。13. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受A R - 4 2的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的 IL_6RamRNA水平的增加降低了約85%。14. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的脂 肪組織的損失大體上恢復(fù)。15. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中與未接受AR-42的哺乳動(dòng)物相比，惡病質(zhì)誘導(dǎo)的骨 骼肌纖維大小的減小被AR-42大體上恢復(fù)。16. 保持患有癌癥的哺乳動(dòng)物中的骨骼肌重量的方法，包括以與未接受1類和2b類HDAC 抑制劑的哺乳動(dòng)物相比在至少15天的時(shí)間段內(nèi)有效維持所述哺乳動(dòng)物骨骼肌重量的至少 約90 %的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類和2b類HDAC抑制劑。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述1類和2b類HDAC抑制劑是AR-42。18. 延長(zhǎng)患有癌癥的哺乳動(dòng)物的存活的方法，包括以與未接受1類和2b類HDAC抑制劑的 哺乳動(dòng)物相比有效延長(zhǎng)所述哺乳動(dòng)物的存活的量向所述哺乳動(dòng)物施用1類和2b類HDAC抑制 劑。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述1類和2b類HDAC抑制劑是AR-42。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物在向所述哺乳動(dòng)物施用AR-42后存 活至少約21天。
【文檔編號(hào)】A61K31/167GK106029061SQ201480063679
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2014年11月19日
【發(fā)明人】陳慶士, 塔尼奧斯·貝卡伊-薩布, 丹尼斯·格特里奇, 圭多·馬庫(kù)奇, 塞繆爾·庫(kù)爾普, 曾裕洲
【申請(qǐng)人】俄亥俄州國(guó)家創(chuàng)新基金會(huì)