卵孢霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及卵孢霉素的生物合成基因簇，具體地，是由一種球孢白僵菌(Beauveria bassiana)產(chǎn)生的具有殺蟲和抑菌功能的卵孢霉素生物合成基因簇的克隆、測序、分析、功能研究及其應(yīng)用。整個基因簇共包含7個基因：OpS1、OpS2、OpS3、OpS4、OpS5、OpS6、OpS7。通過對上述生物合成基因的遺傳操作可阻斷卵孢霉素的生物合成，或使其產(chǎn)量發(fā)生改變，或產(chǎn)生新的化合物。本發(fā)明還首次發(fā)現(xiàn)卵孢霉素的生物合成途徑，具有重大研究意義。
【專利說明】
卵孢霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因資源和基因工程領(lǐng)域，具體涉及具有殺蟲和抑菌作用的卵 孢霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵孢霉素（Oosporein)最初于上世紀60年代，鑒定是一種由球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)和布氏白僵菌（Beauveria brongniarti)產(chǎn)生胞外的紅色色素，具 有一定的殺蟲活性和抑菌作用。單胺氧化酶（ΜΑ0)的活性異?？梢饳C體多種功能障礙， 形成疾病狀態(tài)，如帕金森氏病、老年癡呆癥及近年來都市中較為流行的抑郁癥等均與ΜΑ0 活性異常有關(guān)，而卵孢霉素作為一類單胺氧化酶抑制劑，可能對于研發(fā)由于單胺酶活性異 常引起的疾病相關(guān)藥物有一定的幫助。目前雖然卵孢霉素早已被發(fā)現(xiàn)，并解析了其結(jié)構(gòu) (圖1)，然而卵孢霉素的生物合成途徑卻一直不清楚。
[0003] 因此，我們以微生物來源的卵孢霉素為目標(biāo)分子，從克隆卵孢霉素的生物合成基 因簇出發(fā)，采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及有機化學(xué)相結(jié)合的方法來研究其生物 合成，探索其生物合成途徑及調(diào)節(jié)機制，并驗證卵孢霉素的殺蟲及抑菌效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及具有殺蟲和抑菌作用的卵孢霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功 能研究及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第一方面提供了一種卵孢霉素的生物合成基因簇，所述基因簇包括編碼 卵孢霉素生物合成所涉及的7個卵孢霉素合成相關(guān)基因：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、 0pS6、0pS7 ;
[0006] 其中，OpSl位于基因簇核苷酸序列第24759 - 32012位，編碼聚酮合酶/苷色酸 合酶，長度為2211個氨基酸；
[0007] 0pS2位于基因簇核苷酸序列第32992 - 34102位，編碼轉(zhuǎn)運蛋白，長度為350個氨 基酸；
[0008] 0pS3位于基因簇核苷酸序列第36584 - 38809位，編碼轉(zhuǎn)錄因子，長度為741個氨 基酸；
[0009] 0pS4位于基因簇核苷酸序列第39149 - 40901位，編碼羥化酶，長度為427個氨基 酸；
[0010] 〇pS5位于基因簇核苷酸序列第41885 - 44041位，編碼漆酶，長度為590個氨基 酸；
[0011] 0pS6位于基因簇核苷酸序列第44430 - 45147位，編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，長度為 218個氨基酸；
[0012] 0pS7位于基因簇核苷酸序列第45713 - 46768位，編碼Cupin蛋白，長度為305個 氨基酸。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述基因簇的序列選自SEQ ID NO. 1中第8391-54012位。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述基因簇還包括所述7個卵孢霉素合成相關(guān)基因中的一個基 因或多個（如2個、3個、4個、5個、6個或7個）基因所構(gòu)成的組合或所構(gòu)成的基因簇或其 片段。
[0015] 本發(fā)明第二方面提供了一種卵孢霉素的生物合成相關(guān)蛋白，所述蛋白的氨基酸序 列是選自如SEQ ID N0. : 2-8所示的氨基酸序列。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :2所示的聚酮合酶/苷 色酸合酶。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :3所示的轉(zhuǎn)運蛋白。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :4所示的轉(zhuǎn)錄因子。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :5所示的羥化酶。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :6所示的漆酶。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :7所示的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移 酶。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)蛋白是SEQ ID N0. :8所示的Cupin蛋白。
[0023] 本發(fā)明第三方面提供了一種卵孢霉素的生物合成相關(guān)基因，所述基因編碼本發(fā)明 第二方面所述卵孢霉素的生物合成相關(guān)蛋白。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物合成相關(guān)基因是選自以下基因：
[0025] OpSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6、0pS7、或其組合。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述合成相關(guān)基因的核苷酸序列的信息如上所述或見表1。
[0027] 本發(fā)明第四方面提供了一種表達載體，所述表達載體含有本發(fā)明第一方面所述的 卵孢霉素的生物合成基因簇或其片段，或本發(fā)明第三方面所述的卵孢霉素的生物合成相關(guān) 基因。
[0028] 本發(fā)明第五方面提供了一種重組的宿主細胞，所述宿主細胞含有本發(fā)明第四方面 所述的表達載體，或其染色體上整合有外源的本發(fā)明第一方面所述的卵孢霉素的生物合成 基因簇或本發(fā)明第三方面所述的卵孢霉素的生物合成相關(guān)基因。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述重組的宿主細胞包括真核細胞，如球孢白僵菌、畢赤酵母。
[0030] 本發(fā)明第六方面提供了一種球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，在所述的球孢 白僵菌中，卵孢霉素的生物合成基因簇中的選自下組一個或多個基因被失活：〇pSl、0pS3、 0pS4、0pS5、0pS6、0pS7,從而不產(chǎn)生卵孢霉素。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的被失活基因選自下組的一個基因：0pSl，0pS3, 0pS4， 0pS5, 0pS6,和 0pS7。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的球孢白僵菌中，0ps2基因被保留。
[0033] 本發(fā)明第七方面提供了一種球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，所述的球孢白僵 菌中，卵孢霉素的生物合成基因簇中一個或多個基因被過表達，從而提高或恢復(fù)卵孢霉素 的產(chǎn)量，
[0034] 其中，所述的被過表達基因選自下組：0pSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6和0pS7。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的球孢白僵菌中，0ps2基因被敲除或下調(diào)。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的提高指，與原始菌株（球孢白僵菌）的卵孢霉素產(chǎn)量A0 相比，所述過表達的球孢白僵菌中的卵孢霉素產(chǎn)量A1與AO之比為> 1.5,較佳地>2.0,更 佳地彡2. 5,如1. 5-10,較佳地2-5。
[0037] 本發(fā)明第八方面提供了一種卵孢霉素生物合成基因或其蛋白的用途，用于合成 卵孢霉素的前體或中間體，其中所述的卵孢霉素生物合成基因或其蛋白選自下組：〇pSl、 0pS4、0pS5、0pS7〇
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的合成為體外酶促合成或人工合成。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，提供了一種OpSl基因或其蛋白的用途，所述OpSl基因或其蛋白 用于合成卵孢霉素的合成前體。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述卵孢霉素的合成前體為苷色酸。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所示OpSl基因或其蛋白以乙酰輔酶A為原料催化苷色酸的合 成。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述苷色酸的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0043]
[0044] 在另一優(yōu)選例中，提供了一種0pS4基因或其蛋白的用途，所述0pS4基因或其蛋白 用于催化式I化合物的脫羧羥化反應(yīng)，從而生成式Π 中間體。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述中間體為化合物2。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物2為三羥基甲苯。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物2的結(jié)構(gòu)如式II所示：
[0048]
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物2結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會部分轉(zhuǎn)化為化合物3和化合物4。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物3為酮式結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如式III所示：
[0051]
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所示化合物4由2個化合物2氧化聚合形成，其結(jié)構(gòu)如式IV所 示：
[0053]
[0054] 在另一優(yōu)選例中，提供一種0pS7基因或其蛋白的用途，所述0pS7基因或其蛋白用 于催化式II化合物的羥化反應(yīng)，生成四羥基甲苯。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述四羥基甲苯的結(jié)構(gòu)如式V所示：
[0056]
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述四羥基甲苯結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會部分轉(zhuǎn)化成化合物1。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物1為酮式結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如式VI所示：
[0059]
[0060] 在另一優(yōu)選例中，提供一種0pS5基因或其蛋白的用途，所述0pS5基因或其蛋白用 于催化四羥基甲苯的氧化聚合反應(yīng)，產(chǎn)生卵孢霉素。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述卵孢霉素的結(jié)構(gòu)如式VII所示：
[0062]
[0063] 本發(fā)明第九方面提供了一種制備卵胞霉素的方法，包括步驟：
[0064] (i)在適合培養(yǎng)的條件并且在添加原料化合物的情況下，培養(yǎng)產(chǎn)生卵胞霉素的宿 主細胞，從而產(chǎn)生卵胞霉素，其中所述的原料化合物選自下組：苷色酸（式I)、化合物2 (式 II)、四羥基甲苯（式V)或其組合；和
[0065] (ii)分離或純化出所述的卵胞霉素。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是球孢白僵菌。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是導(dǎo)入外源卵胞霉素合成相關(guān)基因的球孢白僵 菌，其中所述的基因選自下組：0pSl、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6或0pS7基因。
[0068] 本發(fā)明第十方面提供了一種對宿主細胞進行改造的方法，包括步驟：
[0069] (a)測定所述宿主細胞中屬于卵胞霉素合成基因簇的各相關(guān)基因的表達和/或活 性；
[0070] (b)根據(jù)測定結(jié)果，向所述宿主細胞中導(dǎo)入卵胞霉素合成基因簇的相關(guān)基因，從而 提高/恢復(fù)所述宿主細胞產(chǎn)生卵胞霉素的能力，
[0071 ] 其中，所述的基因族的相關(guān)基因包括一種或多種以下基因：0pSl、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6 或 0pS7。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是球孢白僵菌。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述基因簇的OpSl基因失活或活性下降時，還包括步驟：
[0074] 向培養(yǎng)體系中添加原料化合物，所述原料化合物選自下組：苷色酸（式I)、化合物 2(式II)、四羥基甲苯（式V)或其組合，以恢復(fù)卵胞霉素的形成。
[0075] 本發(fā)明第十一方面提供了一種與卵胞霉素相關(guān)的化合物，所述化合物選自下組：
[0076] 化合物2 (式II)、化合物3 (式III)、化合物4 (式IV)和化合物1 (式VI)。
[0077] 本發(fā)明第十二方面提供了一種提高球孢白僵菌產(chǎn)生卵胞霉素的能力的方法，包括 步驟：
[0078] 向所述的球孢白僵菌中導(dǎo)入卵胞霉素合成基因簇的相關(guān)基因，從而提高或恢復(fù)所 述球孢白僵菌產(chǎn)生卵胞霉素的能力，其中，所述的基因簇的相關(guān)基因包括一種或多種以下 基因：0pSl、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6或0pS7 ;或敲除所述的球孢白僵菌中卵胞霉素合成基因 族的0pS2基因，從而提1?所述球抱白僵菌廣生卵胞霉素的能力。
[0079] 本發(fā)明第十三方面提供了一種分離的0pS2多肽或其編碼基因的用途，所述0pS2 多肽或基因用于抑制卵孢霉素的合成。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述0pS2多肽選自下組：（i)具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序 列的多肽；
[0081] (ii)將SEQ ID N0:3氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的且具有抑制卵胞菌素合成功能的由（i)衍生的多肽。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述0pS2多肽的編碼序列選自下組：
[0083] (1)編碼如SEQ ID N0:3所述多肽的多核苷酸序列；
[0084] (2)如SEQ ID N0:10所示的多核苷酸序列；
[0085] (3)與（1)或⑵所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸的。
[0086] 本發(fā)明第十四方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述卵孢霉素的生物合成基因 簇或其部分基因的用途，其特征在于，所述基因簇中部分基因被用于在球孢白僵菌ARSEF 2860相關(guān)基因缺失的突變株中進行異源互補，從而恢復(fù)產(chǎn)生卵孢霉素；或?qū)⑺龌虼刂?部分基因在畢赤酵母中進行異源表達，從而產(chǎn)生卵孢霉素的合成前體、中間體以及卵孢霉 素類似物。
[0087] 在另一優(yōu)選例中，所述畢赤酵母選自GS115。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述卵孢霉素的合成前體為苷色酸（式I)。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述卵孢霉素的合成中間體為化合物2(式II)、化合物3(式 III)、四羥基甲苯（式V)和化合物1(式VI)。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述卵孢霉素類似物為化合物4(式IV)。
[0091] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0092] 圖1顯示了卵孢霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及顏色。
[0093] 圖2顯示了卵孢霉素合成基因簇結(jié)構(gòu)。
[0094] 圖3顯示了 OpSl敲除載體結(jié)構(gòu)。
[0095] 圖4顯示了各基因敲除突變體及野生型菌株發(fā)酵液顏色變化。
[0096] 圖5顯示了各突變體及野生型菌株發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果。
[0097] 圖6顯示了 0pS3過表達載體結(jié)構(gòu)。
[0098] 圖7顯示了野生型、0pS3敲除及過表達突變體發(fā)酵液顏色對比。
[0099] 圖8顯示了野生型及各突變體發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果。
[0100] 圖9顯示了野生型菌株及各突變體卵孢霉素產(chǎn)量對比。
[0101] 圖10顯示了野生型菌株及各突變體卵孢霉素合成相關(guān)基因的RT-PCR結(jié)果。
[0102] 圖11顯示了 OpSl與OrSA的結(jié)構(gòu)域組成對比。
[0103] 圖12顯示了野生型菌株與Λ OpSl突變體苷色酸喂養(yǎng)實驗發(fā)酵液顏色對比。
[0104] 圖13顯示了野生型和Λ OpSl突變體苷色酸喂養(yǎng)實驗的HPLC檢測結(jié)果。
[0105] 圖14顯示了野生型及OpSl異源表達菌株發(fā)酵液和苷色酸標(biāo)樣（OrA)的HPLC檢 測結(jié)果。
[0106] 圖15顯示了野生型菌株和各突變體菌株發(fā)酵液的顏色對比。
[0107] 圖16顯示了野生型及各突變體發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果。
[0108] 圖17顯示了野生型與突變體GS115: :0pS4發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果。
[0109] 圖18顯示了野生型與突變體Λ 0pS7: :0pS3的"化合物1"喂養(yǎng)試驗HPLC檢測結(jié) 果。
[0110] 圖19顯示了卵孢霉素的合成途徑。
[0111] 圖20顯示了大蠟螟生物測定結(jié)果。
[0112] 圖21顯示了被白僵菌感染的大蠟螟血淋巴鏡檢結(jié)果。
[0113] 圖22顯示了野生型和突變體感染蟲尸對比。
[0114] 圖23顯示了卵孢霉素抑菌試驗。
【具體實施方式】
[0115] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，以球孢白僵菌來源的卵孢霉素為目標(biāo)分子，從 克隆其在球孢白僵菌ARSEF 2860中的生物合成基因簇出發(fā)，采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)、 生物分析信息學(xué)、生物化學(xué)及有機化學(xué)相結(jié)合的方法研究其生物合成，首次鑒定了卵孢霉 素的生物合成基因簇，具體地，所述基因簇包括7個基因，分別為：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6、0pS7。其中，OpSl編碼聚酮合酶/苷色酸合酶、0pS2編碼轉(zhuǎn)運蛋白、0pS3編碼 轉(zhuǎn)錄因子、0pS4編碼羥化酶、0pS5編碼漆酶、0pS6編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、0pS7編碼Cupin 蛋白；并且，發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)了卵孢霉素的生物合成途徑，并驗證了卵孢霉素的殺蟲及抑 菌效果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0116] 卵胞霉素合成相關(guān)基因及蛋白
[0117] 如本文所用，本發(fā)明公開了一種卵胞霉素合成基因簇（gene cluster)，所述基因 簇包括：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6、0pS7 基因。
[0118] 其中，OpSl基因編碼酮合酶/苷色酸合酶，且OpSl基因至少具有選自下組的一個 或多個特征：
[0119] ⑴編碼如SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0 :2所示的氨 基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii) 具有如SEQ ID NO :9所示的多核苷酸序列；（iv)具有與如SEQ ID NO :9所示的多核苷酸序 列互補的多核苷酸。
[0120] 0pS2基因編碼轉(zhuǎn)運蛋白，且0pS2基因至少具有選自下組的一個或多個特征：（i) 編碼如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列經(jīng)過 一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :10所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID NO :10所示所示的多核苷酸序列互補的 多核苷酸。
[0121] 0pS3基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，且0pS3基因至少具有選自下組的一個或多個特征：（i) 編碼如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過 一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :11所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID NO :11所示多核苷酸序列互補的多核苷 酸。
[0122] 0pS4基因編碼羥化酶；且0pS4基因至少具有選自下組的一個或多個特征：（i)編 碼如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列經(jīng)過一 個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :12所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID NO :12所示多核苷酸序列互補的多核苷 酸。
[0123] 0pS5基因編碼漆酶；且0pS5基因至少具有選自下組的一個或多個特征：（i)編碼 如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個 或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID N0 : 13所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID NO :13所示多核苷酸序列互補的多核苷酸。
[0124] 0pS6基因編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶；且0pS6基因至少具有選自下組的一個或多個 特征：（i)編碼如SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0 :7所示的氨基 酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具 有如SEQ ID N0:14所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID N0:14所示多核苷酸序列互 補的多核苷酸。
[0125] 0pS7基因編碼Cupin蛋白；且0pS7基因至少具有選自下組的一個或多個特征： (i)編碼如SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列；（ii)編碼如SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列 經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如 SEQ ID N0:15所示的多核苷酸序列；（iv)具有與SEQ ID N0:15所示多核苷酸序列互補的 多核苷酸。
[0126] 在得到了卵胞霉素合成相關(guān)基因的氨基酸片段的情況下，可根據(jù)其構(gòu)建出編碼它 的核酸序列，并且根據(jù)核苷酸序列來設(shè)計特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通常可以 用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的核 苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的雯庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的常規(guī)方法所制備的雯庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次 或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0127] 卵孢霉素生物合成基因簇的確定
[0128] 發(fā)明人在完成球孢白僵菌ARSEF 2860菌株基因組測序的基礎(chǔ)上，通過Gene Blast的方法，找到了基因 orsA在球孢白僵菌中的同源基因 OpSl及其所在基因簇 (gene cluster)，其中包括：0pSl(BBA_08179)、0pS2(BBA_08180)、0pS3(BBA_08181)、 0pS4(BBA_08182)、OpS5 (BBA_08183)、OpS6 (BBA_08184)和 OpS7 (BBA_08185)(圖 2)。
[0129] 卵孢霉素生物合成基因簇相關(guān)性和完整性的確定
[0130] 由于微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因在染色體上是連鎖成簇存在的，本發(fā)明 人對已獲得序列中的各個基因進行敲除實驗，以驗證所獲得基因簇與卵孢霉素生物合成的 相關(guān)性及其完整性。
[0131] 基因敲除OpSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6,或0pS7完全中斷了卵孢霉素的產(chǎn)生并 且基因過表達OpSl，0pS3, 0pS4, 0pS5,或0pS7能夠增加卵孢霉素的產(chǎn)量，證明篩選到的基 因簇的確是與卵孢霉素生物合成相關(guān)的；基因敲除0pS2反而增加了卵孢霉素的產(chǎn)量，說明 0pS2有抑制卵孢霉素合成的作用；由此證實，得到的基因簇包含了卵孢霉素生物合成所需 要的所有基因。在各個基因敲除或過表達突變株中，有的完全中斷了卵孢霉素的產(chǎn)生，有的 產(chǎn)量有所變化，有的沒有明顯影響，有的有新化合物出現(xiàn)。
[0132] 基于以上實驗結(jié)果，并與同類化合物生物合成基因簇進行比較，本發(fā)明人確定 卵孢霉素的生物合成基因簇包含從OpSl到0pS7的7個開放讀碼框（圖2)，涵蓋染色體 22kb的區(qū)域。在整個基因簇中，OpSl編碼聚酮合酶/苷色酸合酶（Polyletide Synthase/ Orsellinic acid Synthase)、0pS2 編碼轉(zhuǎn)運蛋白（Transporter)、0pS3 編碼轉(zhuǎn)錄因子 (Transcription Factor)、0pS4 編碼輕化酶（Hydroxylase)、0pS5 編碼漆酶（Laccase)、 0pS6 編碼谷胱甘膚 S 轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferases/GSTs)、0pS7 編碼 Cupin 蛋白 (Cupin domain containing protein)(表 1,圖 2) 〇
[0133] 表 1
[0134]
[0135] 其中，"一"指"不產(chǎn)生"；"ΝΑ"指"未做過表達實驗"。
[0136] 卵孢霉素前體的合成途徑
[0137] 聚酮合酶（PKS)是一類多功能酶，由多個模塊組成，以乙酰輔酶A(Acetyl-C〇A)為 起始底物，每個模塊以丙二酰輔酶A(Malonyl-CoA)為前體，依次引入一個二碳單位。PKS 起始模塊只含有AT-domain和ACP-domain，按"AT-ACP"的順序排列。其延伸模塊由三 個核心結(jié)構(gòu)域（Core-domain)組成，即酮酯酰合成結(jié)構(gòu)域（KS-domain)、?；D(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域 (AT-domain)和酰基載體蛋白結(jié)構(gòu)域（ATP-domain)，按"KS-AT-ACP"的順序排列。PKS的最 后一個模塊還含有一個硫酯酶結(jié)構(gòu)域（Te-domain)，按"KS-AT-ACP-Te"的順序排列。除了 這些核心結(jié)構(gòu)域外，PKS中往往還含有一些修飾結(jié)構(gòu)域（Tailoring-Domain),如酮酯酰還 原酶結(jié)構(gòu)域（KR-domain)、脫氫酶結(jié)構(gòu)域（DH-domain)、烯?；€原酶結(jié)構(gòu)域（ER-domain) 以及甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（MT-domain)等。PKS根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為3類，其中真菌的PKS屬 于type I迭代型PKS。Type I迭代型PKS只含有一個模塊，通過對這個模塊的重復(fù)利用來 合成不同的產(chǎn)物?；?OpSl被預(yù)測為type I迭代型PKS編碼基因，且與構(gòu)巢曲霉中的苷 色酸合酶基因（orsA)同源，它們所編碼的PKS的結(jié)構(gòu)域組成對比如圖11所示。
[0138] 卵孢霉素的前體苷色酸被實驗證明是由OpSl(PKS)負責(zé)合成的。具體地，發(fā)明 人對球孢白僵菌AOpSl突變體進行苷色酸回補喂養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，苷色酸的添加使突變體 AOpSl恢復(fù)合成卵孢霉素的能力，因此說明苷色酸確實是卵孢霉素合成的前體，且由OpSl 負責(zé)合成。
[0139] 卵孢霉素的生物合成途徑
[0140] 發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，如圖19所示，卵孢霉素的生物合成由OpSl、0pS4、0pS5、 0pS7介導(dǎo)。
[0141] 具體地，卵孢霉素的生物合成途徑如下：
[0142] (1)聚酮合酶OpSl以乙酰輔酶A為原料催化苷色酸的合成；
[0143] (2)苷色酸由羥化酶0ps4催化，經(jīng)脫羧羥化反應(yīng)生成"化合物2"（三羥基甲苯）；
[0144] (3) "化合物2"不穩(wěn)定，會轉(zhuǎn)化為其酮式結(jié)構(gòu)"化合物3"，并且化合物2會氧化聚 合形成少量的"化合物4"（5, 5' -二脫氧卵孢霉素）；
[0145] (4) "化合物2"（三羥基甲苯）經(jīng)Cupin蛋白0pS7羥基化生成四羥基甲苯，少量 四羥基甲苯會轉(zhuǎn)化為其酮式結(jié)構(gòu)"化合物1" ；
[0146] (5)四羥基甲苯由漆酶0pS5催化，經(jīng)氧化和自由基二聚化反應(yīng)生成卵孢霉素。
[0147] 載體
[0148] 本文所用的術(shù)語"載體"包括能使插入目的基因進入宿主細胞表達的克隆載體以 及其他載體。表達載體可包括原核表達載體和真核表達載體，可以是質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或 病毒等。典型的表達載體帶有能使基因表達的調(diào)控序列，并在適當(dāng)位置有可插入外源基因 的限制性內(nèi)切酶位點。
[0149] 在具體的實施方式中，本發(fā)明表達載體含有本發(fā)明的卵孢霉素生物合成基因，或 含有本發(fā)明的卵孢霉素生物合成基因簇。
[0150] 宿主細胞
[0151] 本文所用的術(shù)語"宿主細胞"具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，即，包含 外源性目的基因并能使之表達的細胞。例如，宿主細胞可以是原核宿主細胞（例如，大腸桿 菌、枯草桿菌、鏈霉菌、小單胞菌）、真核宿主細胞（例如，酵母）、植物細胞等等。
[0152] 在具體的實施方式中，本發(fā)明的宿主細胞宜包含本發(fā)明的表達載體，或染色體上 整合有單拷貝或多拷貝的外源的卵孢霉素生物合成基因，或單拷貝或多拷貝的卵孢霉素生 物合成基因簇。
[0153] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的宿主細胞包括球孢白僵菌、畢赤酵母。
[0154] 優(yōu)選地，本發(fā)明的工程菌是通過球孢白僵菌（Beauveria bassiana ARSEF2860)基 因工程改造而獲得。
[0155] 卵孢霉素生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因失活的突變球孢白僵菌
[0156] 本發(fā)明還提供一種球孢白僵菌突變株，所述突變株中本發(fā)明的卵孢霉素生物合成 基因的一個或多個基因失活，從而所述突變株不產(chǎn)生卵孢霉素。
[0157] 在具體的實施方式中，所述失活的一個或多個基因選自編碼如SEQ ID N0. :9、 11-15所示基因。更佳地，所述的被失活基因選自0?31、0?33、0?34、0?35、0?36或0?37。
[0158] 本發(fā)明提供的卵孢霉素生物合成基因簇中一個或多個結(jié)構(gòu)基因被失活的球孢白 僵菌突變株，可作為驗證卵孢霉素基因簇中基因功能的模型或?qū)φ站?，?或用于外源 表達卵孢霉素的宿主細胞。
[0159] 卵孢霉素生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因過表達的突變球孢白僵菌或突變畢赤酵母
[0160] 本發(fā)明還提供一種球孢白僵菌突變株，所述突變株中本發(fā)明的卵孢霉素生物合成 基因的一個或多個基因過表達，從而所述突變株提高或恢復(fù)產(chǎn)生卵孢霉素。
[0161] 在具體的實施方式中，所述過表達的一個或多個基因選自編碼如SEQ ID N0. :9、 11-15所示基因。更佳地，所述的被失活基因選自0?31、0?33、0?34、0?35、0?86或0?37。
[0162] 本發(fā)明提供的卵孢霉素生物合成基因簇中一個或多個結(jié)構(gòu)基因過表達的球孢白 僵菌突變株，可作為驗證卵孢霉素基因簇中基因功能的模型或?qū)φ站?，?或用于外源 表達卵孢霉素的宿主細胞。
[0163] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0164] (1)本發(fā)明為卵胞霉素提供了生物合成途徑，探索了一種新的生物合成機制。
[0165] (2)本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適 的表達體系在外源宿主中表達以得到相應(yīng)的酶或其他更高的生物活性或產(chǎn)量。這些外源宿 主包括鏈霉菌、球孢白僵菌、假單孢菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物等。
[0166] (3)本發(fā)明首次夠公開了一種卵胞霉素生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)，并對各個基因的 功能進行了分析研究。
[0167] (4)本發(fā)明提供了一種新的尋找沉默中間產(chǎn)物的方法，即通過對調(diào)控基因簇中各 基因表達的轉(zhuǎn)錄因子在突變體中進行過表達，從而得到中間產(chǎn)物。
[0168] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計。
[0169] 通用方法：
[0170] 1.根癌農(nóng)桿菌AGL-1的轉(zhuǎn)化方法
[0171] 1. 1根癌農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)制備：
[0172] ⑴以牙簽挑取原始菌株AGL-1，于YEB平板（含50μ g/ml羧芐青霉素）上劃線培養(yǎng) 進行活化。⑵挑取平板上單菌落，接種至4ml YEB液體培養(yǎng)基（含50 μ g/ml羧芐青霉素） 中，28°C，200rpm，培養(yǎng)過夜。⑶取2ml上述菌液轉(zhuǎn)接至50ml YEB液體培養(yǎng)基（含50 μ g/ ml羧芐青霉素）中，28°C，200rpm，培養(yǎng)至菌液0D600為0. 5( -般約8h)。⑷取出菌液，冰 浴3〇111；[11，4°(1|，8000印111，5111；[11離心收集菌體。（5)棄上清，加入10111120111103(]12重懸菌體沉 淀。（6)41：，8,000印111，51^11，再次離心收集菌體。（7)上清，以211112011110 &(：12再次重懸菌 體，加入無菌甘油至終濃度為15~20%。分裝至1. 5ml EP管，100 μ 1/管，液氮速凍后保 存于-80°C。
[0173] 1. 2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)：
[0174] ⑴取出-80°C凍存的農(nóng)桿菌感受態(tài)，置于冰上融化約10min。⑵向感受態(tài)中加 0.5~lyg目的質(zhì)粒，混勻后冰上靜置30min。⑶依次處理如下：液氮5min，37°C水浴 5min，處理后立即置于冰上2min。⑷加入lml無抗YEB液體培養(yǎng)基，28°C，150rpm，復(fù)蘇3h。 (5) 8, OOOrpm，2min離心收集菌體。（6)棄上清，以100 μ 1無抗YEB重懸菌體后均勻涂布于 YEB平板（含50 μ g/ml羧芐青霉素及50 μ g/ml卡那霉素），28°C倒置培養(yǎng)2天。（7) PCR驗 證轉(zhuǎn)化子，挑取陽性轉(zhuǎn)化子以3ml YEB液體（含50 μ g/ml羧芐青霉素和50 μ g/ml卡那霉 素）過夜搖菌，28°C，220rpm。⑶將菌液取部分保存于-80°C，甘油終濃度為15%。
[0175] 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化：
[0176] ⑴白僵菌分生孢子孢懸液的制備：選取馬鈴薯固體培養(yǎng)基PDA平板上培養(yǎng)兩周的 球孢白僵菌，刮取適量菌絲至lml無菌0. 05% Tween-20水溶液，渦旋振蕩分離菌絲與分生 孢子；以玻璃絲棉或三層擦鏡紙過濾去除菌絲，收集濾液；12, OOOrpm，lmin，離心菌液收集 孢子；棄上清，以lml無菌水重懸孢子，清除殘余營養(yǎng)；12, OOOrpm，lmin，再次離心收集孢 子；可重復(fù)步驟4~5 -次，以徹底清除孢子表面殘余營養(yǎng)；棄上清，以適量無菌水重懸孢 子，血球計數(shù)器統(tǒng)計孢子數(shù)目后，將孢懸液濃度調(diào)至5 X 105conidia/ml，作為工作液用于后 續(xù)實驗操作。⑵白僵菌轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)接已成功轉(zhuǎn)化相應(yīng)載體的AGL-1凍存菌至3ml液體YEB (含 50 μ g/ml羧節(jié)青霉素和50 μ g/ml卡那霉素），28°C，220rpm，培養(yǎng)過夜；8, OOOrpm，2min，離 心收集菌體；棄上清，以適量的頂液體重懸菌體，調(diào)整至〇D65。為0· 15 ;28°C，150rpm，誘導(dǎo) 培養(yǎng)至0D65。為0. 5~0. 8, 一般需6h ;取誘導(dǎo)好的農(nóng)桿菌菌液及新鮮制備的白僵菌孢懸液 各100 μ 1，于1. 5ml EP管中混和均勻；取上述混合液100 μ 1涂布于頂平板，28°C共培養(yǎng) 48h ;待滅菌后的M-100固體培養(yǎng)基溫度降至60°C，加相應(yīng)抗生素（噻孢霉素，草胺膦/苯 菌靈）；每塊共培養(yǎng)頂平板以15ml上述M-100培養(yǎng)基覆蓋，25°C培養(yǎng)3-5天至單個抗性菌 落出現(xiàn)；以牙簽將上述抗性菌落挑取至新的M-100抗性培養(yǎng)基平板上，進行第二次篩選；以 SDB液體培養(yǎng)基對二次篩選平板上的抗性菌落搖菌培養(yǎng)，并在M-100平板背面的相應(yīng)位置 做好標(biāo)記；抽濾SDB培養(yǎng)菌絲，抽提基因組，進行PCR驗證。
[0177] 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化溶液及培養(yǎng)基
[0178] 2. 5 X誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液
[0179]
[0180] M-100微量元素溶液
[0181]
[0182] Μ-100 鹽溶液
[0183]
[0184] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（液體）
[0185]
[0186] 滅囷后冷卻到50 C后添加：
[0187]
[0188] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（固體）
[0189]
[0190] 滅囷后冷卻到50 C后添加：
[0191]
[0192] M-100(For 1L)
[0193]
[0194] MES和AS母液配制：
[0195]

[0196] 4.卵孢霉素分離純化方法：
[0197] 4. 1卵孢霉素的萃?。?br>[0198] 用抽濾法分離白僵菌菌絲與培養(yǎng)基，將分離得到的發(fā)酵液經(jīng)50°C真空旋蒸濃縮為 原體積的四分之一。向濃縮的發(fā)酵液中加入三氟乙酸并震蕩搖勻至發(fā)酵液由紫紅色變?yōu)槌?色（pH~2)。用三倍體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，分離有機相和水相。將乙酸乙酯相經(jīng)真 空旋蒸蒸干，最終溶于適量甲醇中。
[0199] 4. 2卵孢霉素的分離：
[0200] 先將大孔樹脂D101懸浮于工業(yè)酒精中，并裝填于層析柱中。用pH~2的水（用 三氟乙酸調(diào)pH)平衡層析柱中的填料大孔樹脂至流出的洗脫液pH~2 (即大孔樹脂顯酸 性）。將所得卵孢霉素粗提物均勻滴加于層析柱頂端，使樣品充分吸附于大孔樹脂之上。用 水（pH~2)作為流動相洗脫3個柱體積，再用氫氧化鉀水溶液（pH~12)洗脫樣品。收集 洗脫下來的紫色溶液，用三氟乙酸調(diào)至pH~2 (溶液變?yōu)槌壬?，隨后經(jīng)真空旋蒸濃縮至原 體積的十分之一。用乙酸乙酯再次萃取溶液，并濃縮蒸干，并用少許甲醇溶解，裝于EP管 中。將EP管置于-20°C沉淀過夜后，12000rpm離心lmin，收集沉淀。沉淀即為析出的卵孢 霉素晶體。
[0201] 5. UV 287nm下卵孢霉素的標(biāo)準曲線繪制。
[0202] 用分離純化的卵孢霉素分別配置成濃度為1 Omg/ml、8mg/ml、6mg/ml、4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml 和 0· 4mg/ml 的二甲基亞諷（DMSO)溶液。在紫外 UV 287nm 條件下HPLC檢測，上樣量3 μ 1。計算不同濃度下卵孢霉素的積分峰面積，繪制成卵孢霉素 標(biāo)準曲線。線性化方程為：y = 2E-07x-0. 4486(y為卵孢霉素的質(zhì)量，X為卵孢霉素峰面 積）。
[0203] 6.球孢白僵菌RNA的制備
[0204] 6. 1白僵菌RNA的抽提：
[0205] (1)液氮研磨冷凍白僵菌菌絲成粉末，取100mg于EP管中；（2)立即加入1ml Trizol，用移液槍吹打混勻，計入1/5體積（200μ 1)氯仿，混勻，于冰上放置2-3min ;(3)于 12000rpm，4°C離心5min，吸取上清 400μl于另一EP管中，加入l/2體積（200μl)氯仿： 異戊醇（24:1)，混勻；（4) 12000rpm，4°C離心5min，將上清轉(zhuǎn)入另一 EP管中（重復(fù)多次去蛋 白），加入1/2體積（200μ 1)異丙醇，混勻，冰上靜置10min ; (5) 12000rpm，4°C離心15min， 棄上清，加入800 μ 1 75%乙醇洗2次；（6) 12000rpm，4°C離心5min，棄上清，室溫晾干；（7) 用50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀；（8)測定RNA濃度。
[0206] 6.2去除0嫩雜質(zhì)：
[0207] 配置50 μ 1的反應(yīng)體系，降解DNA :
[0208]
[0209] 于 37°C 反應(yīng) lh。
[0210] 6. 3 回收純化 RNA:
[0211] (1)50 μ 1反應(yīng)體系中再加入50 μ 1DEPC水，再加入100 μ 1氯仿：異戊醇（24:1)， 混勻；（2) 12000rpm，4°C離心5min，將上清移入另一個ΕΡ管中，加入100μ 1氯仿：異戊醇 (24:1)混勻；（3) 12000rpm，4°C離心5min，將上清移入另一 ΕΡ管中，加入10μ1 3Μ乙酸鈉 和250 μ 1無水乙醇（冰?。?，混勻，于-80°C放置20min ; (4) 12000rpm，4°C離心10min，棄上 清，用800 μ 175%乙醇洗2次；（5) 12000rpm。4°C離心5min，收集沉淀，晾干，用30 μ 1 DEPC 水溶解；(6)測RNA濃度。
[0212] 7.球孢白僵菌cDNA的制備（Τ0Υ0Β0 RNA反轉(zhuǎn)試劑盒）
[0213] 7. 1RNA 變性：
[0214] 配置12 μ 1反應(yīng)體系
[0215]
[0216] 于65°C反應(yīng)5min后，立即置于冰上。
[0217] 7. 2RNA 反轉(zhuǎn)：
[0218] 配置反轉(zhuǎn)反應(yīng)體系20 μ 1
[0219]
[0220] 反應(yīng)程序
[0221]
[0223] 8.畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化方法
[0224] 8. 1畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：
[0225] (1)從YPD平板上挑去GS115單菌落，接種于5ml常規(guī)YPD培養(yǎng)基中，30°C搖床培 養(yǎng)過夜；⑵取種子培養(yǎng)液〇. 02-0. lml，分別接種于2瓶50ml YPD培養(yǎng)基（裝于250ml三角 瓶）中，過夜培養(yǎng)至〇D6QQ= 1.3-1.5 ;(3)將兩瓶菌液分裝于2支50ml離心管內(nèi)，于1500g， 4°C離心5min，分別用50ml冰浴的無菌水沖懸菌體；(4) 1500g，4°C離心5min，分別用25ml 冰浴的無菌水重懸菌體；（5)再次離心（方法同上），分別用2ml的冰浴1M山梨醇重懸菌 體；（6)離心（同上），分別用0. lml冰浴的1M山梨醇重懸菌體，并分裝于預(yù)冷的EP管中， 每管80 μ 1,置于冰上備用。
[0226] 8. 2畢赤酵母電轉(zhuǎn)方法：
[0227] (1)取線性化的質(zhì)粒5-10 μ g加于GS115電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌液內(nèi)，混勻；(2)將混勻的 感受態(tài)菌液移入預(yù)冷的的電轉(zhuǎn)杯（2mm)中，于冰上放置5min ; (3)電轉(zhuǎn)（2kv) ; (4)迅速向電 轉(zhuǎn)杯中加入冰浴的1M山梨醇lml，將混合液轉(zhuǎn)入1. 5ml EP管中；（5)將菌液置于30°C靜置 孵育1-2h ; (6)將菌液混勻，取200 μ 1菌液涂于博來霉素/遺傳霉素的YPDS平板上，30°C 培養(yǎng)2-3天。
[0228] 8. 3畢赤酵母突變體的篩選：
[0229] (1)用槍頭挑去篩選平板上的突變體菌落，分別接種于3ml的YH)培養(yǎng)基（含 博來霉素/遺傳霉素）中，與30°C搖床培養(yǎng)24h ; (2)分別取菌液lml于相應(yīng)的EP管中； (3) 12000rpm離心lmin，棄上清；（4)分別用200μ 1的裂解液將菌體重懸，分別加入100mg 的0. 5mm瓷珠；（5)于振蕩器上震蕩8次，每次30s ; (6) 12000rpm離心lmin，將上清移入另 一 EP管中；（7) PCR驗證突變體。
[0230] 8. 4畢赤酵母的發(fā)酵及誘導(dǎo)表達：
[0231] (1)取常規(guī)YPD培養(yǎng)基中的畢赤酵母菌液100 μ 1，接種于50ml MGY培養(yǎng)基（裝 于250ml三角瓶中），30°C，220rpm搖床培養(yǎng)24h ; (2) 1500g離心5min，棄上清，用lml常規(guī) MMH培養(yǎng)基重懸菌體，轉(zhuǎn)接于100ml MMH培養(yǎng)基（裝于500ml三角瓶），調(diào)至0D_= 1 ; (3) 在MMH培養(yǎng)基中加入0. 5%的甲醇（500μ 1)，誘導(dǎo)基因表達，30°C，220rpm搖床培養(yǎng)48h。
[0232] 9.畢赤酵母轉(zhuǎn)化及表達所用培養(yǎng)基
[0233] YPD+Agar 培養(yǎng)基（For 100ml)(遺傳霉素 0. 5mg/ml 或博來霉素 0. lmg/ml)
[0234]

[0235] YPD 培養(yǎng)基（For 100ml)(遺傳霉素 0. 5mg/ml 或博來霉素 0. lmg/ml)
[0236]
[0237] MGY 培養(yǎng)基（For 100ml)
[0238]
[0239] MMH 培養(yǎng)基（For 500ml)
[0242] 裂解液
[0243]
[0244] 實施例1卵孢霉素合成基因簇的鑒定
[0245] 對球孢白僵菌ARSEF 2860進行測序，獲得測序的基因組數(shù)據(jù)，對該數(shù)據(jù)進行比較 基因組分析，找到了球孢白僵菌中OpSl及其所在的基因簇，其中包括：0pSl(BBA_08179)、 0pS2(BBA_08180)、 0pS3(BBA_08181)、 0pS4(BBA_08182)、 0pS5(BBA_08183)、 0pS6(BBA_08184)和 0pS7(BBA_08185)(圖 2)。
[0246] 生物信息學(xué)分析顯示，這些基因可能分別編碼如下蛋白，包括：0pSl編碼聚酮合 酶/苷色酸合酶、0pS2編碼轉(zhuǎn)運蛋白、0pS3編碼轉(zhuǎn)錄因子、0pS4編碼羥化酶、0pS5編碼漆 酶、0pS6編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、0pS7編碼Cupin蛋白（表1)。
[0247] 實施例2卵孢霉素合成相關(guān)基因及其功能的鑒定
[0248] 分別對 OpSl (BBA_08179)、0pS2 (BBA_08180)、0pS3 (BBA_08181)、 0pS4 (BBA_08182)、0pS5 (BBA_08183)、0pS6 (BBA_08184)和 0pS7 (BBA_08185)進行了敲除及 過表達，并用高效液相色譜（HPLC)對敲除突變體的發(fā)酵液進行檢測，觀察特定基因的缺失 或過表達對卵孢霉素合成的影響。
[0249] 2. 10pS基因簇中各基因?qū)β焰呙顾睾铣傻挠绊?br>[0250] 以植物遺傳中常用的雙元載體PCAMBIA1300的pDHt-ks為骨架，向其中分別引入 草胺磷抗性基因 Bar和苯菌靈抗性基因 Ben，構(gòu)建了用于真菌轉(zhuǎn)化的雙元載體pDHt-Bar 和pDHt-Ben ;以載體pDHt-Bar為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建了用于敲除基因 OpSl、0pS2、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6和0pS7的敲除載體。
[0251] 使用引物OpSlUF/OpSlUR及OpSIDF/OpSIDR (具體引物序列見表2)，分別PCR擴 增出敲除載體的上下游同源臂，并將上下游同源臂片段分別連接于載體pDHt-Bar的上下 游位點（圖3)。用構(gòu)建好的OpSl敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL-1獲得含有敲除載體的農(nóng) 桿菌，用于轉(zhuǎn)化球孢白僵菌ARSEF 2860。通過草胺磷抗性平板篩選獲得球孢白僵菌的OpSl 敲除突變體（Δ OpSl)
[0252] 按上述方法依次敲除，獲得敲除突變體AOpSl、A〇pS2、A〇pS3、A〇pS4、A〇pS5、 Λ 0pS6和Λ 〇PS7,用0. 05 %的Tween溶液分別收集各突變體及野生型菌株WT的孢子，制成 濃度為10s個孢子/ml的孢子懸液，取40 μ 1孢子懸液分別接種于裝有20ml SDB培養(yǎng)基的 三角瓶中，于25°C，200rpm搖床培養(yǎng)3天，作為種子培養(yǎng)基。
[0253] 取1ml種子培養(yǎng)基分別接種于裝有50ml SDB培養(yǎng)基的三角瓶中，并置于25°C光照 培養(yǎng)箱中（光照時間為12h/天），靜置培養(yǎng)5天。最后，濾去菌絲體，收集發(fā)酵液。
[0254] 結(jié)果顯示，如圖4所示，野生型菌株WT的發(fā)酵液呈紅色，除Λ 〇PS2發(fā)酵液紅色加 深外，其他基因的敲除突變體發(fā)酵液均無顏色。
[0255] 用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，所得粗提物經(jīng)真空旋蒸濃縮后，用甲醇洗脫并用高效液 相色譜（HPLC)檢測。HPLC檢測使用CNW公司C18柱（12:〇|，4. 6mmX 250mm，5 μ m)。洗脫 條件為：柱溫401：，水（含0.1%三氟乙酸）：乙腈=87:13，洗脫35 1^11。紫外檢測波長為 UV 287nm。
[0256] 檢測結(jié)果如圖5所示，圖中卵孢霉素的峰被標(biāo)記為紅色。結(jié)果表明，基因 OpSl、 0pS3、0pS4、0pS5、0pS6和0pS7的缺失導(dǎo)致卵孢霉素?zé)o法合成，而基因0pS2的缺失反而增 加了卵孢霉素的產(chǎn)量。
[0257] 表 2
[0258]


[0263] 以載體pDHt-Ben為基礎(chǔ)構(gòu)建了基因0pS3的過表達載體，用引物gpdA-F/ gpdA-R(表2)經(jīng)PCR擴增出球孢白僵菌3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA(BBA_05480)的啟動 子連接于載體pDHt-Ben下游的酶切位點SpeI處，獲得載體pDHt-Ben-gpdA。然后，用 引物0pS3-F/0pS3-R (表2)擴增得到基因0pS3，并連接于載體pDHt-Ben-gpdA下游酶 切位點Xbal處。用驗證引物gpdA-YF/0pS3-YR (表2)驗證連接方向，所得過表達載體 pDHt_ben-gpdA-〇pS3 結(jié)構(gòu)如圖 6 所不。
[0264] 將構(gòu)建好的載體通過根癌農(nóng)桿菌AGL-1的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化球孢白僵菌，經(jīng)含有苯菌靈的 抗性平板篩選得到球孢白僵菌0pS3基因的過表達突變體WT: :0pS3。
[0265] 分別收集球孢白僵菌野生型菌株WT、Λ 〇PS3突變體和過表達突變體WT: :0pS3的 孢子，制成濃度為10s個孢子/ml的孢子懸液，發(fā)酵各突變體及野生型菌株，過濾分離菌絲 體和發(fā)酵液，如圖7所示，野生型菌株WT的發(fā)酵液呈紅色，Λ 〇PS3菌株的發(fā)酵液無顏色，而 WT: :0pS3的發(fā)酵液紅色加深。
[0266] 將收集的發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測，檢測結(jié)果顯示，0pS3的過表達可以顯著提高卵孢霉 素的產(chǎn)量，而0pS3的缺失則導(dǎo)致白僵菌無法合成卵孢霉素（圖8,卵孢霉素的峰被標(biāo)記為紅 色）。
[0267] 定量實驗：
[0268] 用分離純化的卵孢霉素標(biāo)樣繪制卵孢霉素在HPLC紫外檢測波長為UV 287nm條件 下的標(biāo)準曲線。用卵孢霉素的峰面積比對標(biāo)準曲線，得到野生型菌株WT及各突變體的卵孢 霉素產(chǎn)量，如圖9所示。
[0269] 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子基因 0pS3的過表達顯著提高了卵孢霉素的產(chǎn)量，從不到 50 μ g/ml 提高到約 150 μ g/ml。
[0270] 作用機理研究：
[0271] 分別提取野生型WT、Λ 0pS3突變體及過表達突變體WT: :0pS3的菌絲體RNA并反 轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過半定量RT-PCR檢測OpS基因簇其他基因在野生型菌株WT和0pS3突 變體中的表達情況（圖10, tubulin基因為內(nèi)標(biāo)）。
[0272] 結(jié)果表明，相比于野生型菌株，基因 0pS3的缺失導(dǎo)致其他卵孢霉素合成相關(guān)基因 表達的沉默，而0pS3的過表達則極大地提高了這些基因的表達。
[0273] 2. 3聚酮合酶OpSl的功能鑒定
[0274] 對球孢白僵菌Λ OpSl突變體進行苷色酸（式I)回補喂養(yǎng)試驗。將球孢白僵菌野 生型菌株WT和Λ OpSl突變體的種子培養(yǎng)基分別接種于裝有50ml SDB培養(yǎng)基的三角瓶中。 野生型WT接種3瓶，而Λ OpSl突變體接種6瓶，其中3瓶加入300 μ 1 (100mg/ml)的苷色 酸（OrA)乙醇溶液，另外3瓶加入300 μ 1的乙醇作為對照，發(fā)酵5天，收集發(fā)酵液（圖12)。
[0275] 結(jié)果顯示，野生型WT的發(fā)酵液呈紅色，未添加苷色酸的Λ OpSl突變體的發(fā)酵液為 無色，而添加了苷色酸的Δ OpSl突變體發(fā)酵液也呈紅色。
[0276] 與此同時，將不同處理的發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測，紫外檢測波長為UV 254nm。結(jié)果如 圖13所示，圖中苷色酸的峰被標(biāo)記為黃色，而卵孢霉素的峰被標(biāo)記為紅色。由圖可見，苷色 酸的添加使突變體△ OpSl中恢復(fù)合成卵孢霉素的能力，這說明苷色酸確實是卵孢霉素合 成的前體，且由OpSl負責(zé)合成。
[0277]
[0278] 畢赤酵母異源表達：
[0279] 將基因 OpSl (BBA_08179)和磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶（PPTase)基因 BBA_06793 從球孢白僵菌cDNA中擴增出來（表2)，分別與載體pPICZB和pPIC3. 5K連接，得到異源表 達載體pPICZB-OpSl和pPIC3. 5K-06793,并依次轉(zhuǎn)化GS115,經(jīng)博來霉素和遺傳霉素篩選 后，得到基因 OpSl在畢赤酵母中的異源表達突變體GS115: :0pSl。
[0280] 將野生型菌株GS115和OpSl異源表達突變體GS115: :0pSl在MMH培養(yǎng)基中于 30°C，220rpm搖床培養(yǎng)48h。4000rpm離心收集發(fā)酵液，將野生型和異源表達突變體的發(fā)酵 液與苷色酸標(biāo)樣（OrA)分別經(jīng)HPLC檢測，紫外檢測波長為UV 210nm。
[0281] 結(jié)果如圖14所示，苷色酸被標(biāo)記為黃色，畢赤酵母野生型菌株GS115的發(fā)酵液中 沒有積累峰，而在OpSl異源表達菌株GS115: :0pSl的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了苷色酸的積累峰，分 子量為MW = 168。實驗證明，OpSl (PKS)負責(zé)苷色酸的合成。
[0282] 2. 4其他相關(guān)基因的功能鑒定
[0283] 如圖5所示，0pS4、0pS5、0pS6和0pS7的缺失均導(dǎo)致卵孢霉素不能合成，但卻沒有 在其發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物的積累。因此，為了找到各敲除突變體中卵孢霉素合成中間體 的積累峰，發(fā)明人將轉(zhuǎn)錄因子0pS3在各敲除突變體中進行過表達。
[0284] 將過表達載體pDHt-Ben_gpdA-〇pS3分別轉(zhuǎn)化敲除突變體Δ 0pS4、Δ 0pS5、Δ 0pS6 和 A〇pS7,得到轉(zhuǎn)錄因子過表達突變體 A0pS4::0pS3、A0pS5::0pS3、A0pS6::0pS3 和 A0pS7::0pS3。發(fā)酵野生型菌株及突變體（AOpSl、A〇pS2、A〇pS3、A0pS4::0pS3、 A0pS5::0pS3、A0pS6::0pS3 和 A0pS7::0pS3)并收集發(fā)酵液。
[0285] 結(jié)果表明，除野生型WT和Λ 0pS2突變體發(fā)酵液呈紅色外，原來無色的0pS5、0pS6 和0pS7敲除突變體，在過表達轉(zhuǎn)錄因子后，分別呈現(xiàn)出紅色和橙色（圖15)。
[0286] 隨后，將上述發(fā)酵液用HPLC檢測，紫外檢測波長為UV 254nm。
[0287] 結(jié)果顯示（圖16):
[0288] (1)在突變體Λ 〇PS4: :0pS3的發(fā)酵液中有一個苷色酸的積累峰（分子量為麗= 168)，被標(biāo)記為黃色。
[0289] (2)在突變體Λ 〇PS5: :0pS3的發(fā)酵液中有累積的峰，標(biāo)記為藍色，化合物分子量 為麗=154,命名為"化合物1"。
[0290] (3)在突變體Λ 〇PS7: : 0pS3的發(fā)酵液中有一個分子量為麗=140的累積峰，被標(biāo) 記為綠色，命名為"化合物2"，此外還有一個積累峰分子量為MW = 138,被標(biāo)記為橙色，命名 為"化合物3"。
[0291] (4)在突變體 A〇pS5: :0pS3、A〇pS6: :0pS3 和 A〇pS7: :0pS3 中均有一個積累峰， 分子量為麗=274,標(biāo)記為枚紅色，命名為"化合物4" ；突變體Λ 〇PS6: :0pS3的發(fā)酵液中 發(fā)現(xiàn)了卵孢霉素的峰（分子量為MW = 306)，被標(biāo)記為紅色。
[0292] 由此推斷，羥化酶0pS4、漆酶0pS5及Cupin蛋白0pS7參與催化以苷色酸為前體的 卵孢霉素的合成，且羥化酶0pS4直接催化以苷色酸為底物的反應(yīng)。而作為S-谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶的0pS6并不直接參與卵孢霉素的合成，而可能是起到清除卵孢霉素合成過程中產(chǎn)生 的自由基，從而保護細胞免于自由基傷害的作用。羥化酶0pS4與水楊酸羥化酶的氨基酸序 列同源性很高，而水楊酸羥化酶催化水楊酸脫羧羥基化，生成兒茶酚。因此發(fā)明人推測羥化 酶0pS4也催化類似的反應(yīng)，將苷色酸轉(zhuǎn)化為三羥基甲苯。
[0293] 2. 4. 10pS4基因的功能鑒定
[0294] 為了進一步研究羥化酶0pS4的功能及其所催化的反應(yīng)，發(fā)明人將基因0pS4從球 孢白僵菌的cDNA中擴增出來，并連接于載體pPICZB上，構(gòu)建了基因0pS4的異源表達載體 pPICZB-0pS4,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)博來霉素篩選得到基因0pS4的異源表達突變體 GS115::0pS4。
[0295] 分別用MMH培養(yǎng)基發(fā)酵野生型菌株GS115和突變體GS115: :0pS4,并分別在野生型 和突變體的發(fā)酵液中各加入300 μ 1 (100mg/ml)的苷色酸，于30°C，220rpm搖床培養(yǎng)24h。 4000rpm離心收集發(fā)酵液，用HPLC檢測，紫外檢測波長為UV 254nm，結(jié)果如圖17所示，其中 苷色酸的峰被標(biāo)記為黃色。
[0296] 結(jié)果表明，如圖17所示，相比于野生型菌株的發(fā)酵液，0pS4異源表達突變體 GS115: :0pS4的發(fā)酵液中的苷色酸被大量消耗并轉(zhuǎn)化為"化合物2"，分子量為麗=140,被 標(biāo)記為綠色。"化合物2"不穩(wěn)定，會轉(zhuǎn)化產(chǎn)生"化合物3"（MW = 138)和"化合物4"（MW = 274)，分別被標(biāo)記為橙色和枚紅色。
[0297] 分離"化合物4"，經(jīng)核磁共振鑒定，其結(jié)構(gòu)如式IV所示。
[0298]
[0299] NMR(CD30D，400MHz):
[0300]

[0301] 化合物4的結(jié)構(gòu)與卵孢霉素相似，與卵孢霉素相比，只缺少兩個羥基，由兩個三羥 基甲苯聚合而成，命名為"5,5' -二脫氧卵孢霉素"。由于"5,5' -二脫氧卵孢霉素"是"化 合物2"被氧化形成的產(chǎn)物，而"化合物2"的分子量為麗=140,因此推斷"化合物2"為三 羥基甲苯，且"化合物3"(Mff = 138)為酮式結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)分別如式II、式III所示。因此推斷 羥化酶0pS4催化苷色酸的脫羧羥化反應(yīng)，形成一個三羥基甲苯。
[0302]
[0303] 2. 4. 20pS7、0pS5基因的功能鑒定
[0304] 如圖16所示，在突變體A〇pS7: :0pS3的發(fā)酵液中有"化合物2"的積累，即"化合 物2"為0pS7的底物。分離純化突變體A〇PS5: :0pS3發(fā)酵液中的"化合物1"（分子量為 MW = 154)，經(jīng)核磁共振鑒定為一個醌類化合物，結(jié)構(gòu)如式VI所示。
[0305] 發(fā)明人推斷0pS7為一個單加氧酶，催化"化合物2"甲基鄰位碳的羥基化，生成一 個四羥基甲苯（式V)。當(dāng)其無法被利用時，便由烯醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的酮式結(jié)構(gòu)，即 "化合物1"。同時研究發(fā)現(xiàn)，漆酶0pS5可以將多酚類化合物氧化成醌類化合物，并經(jīng)自由基 反應(yīng)，在兩個自由基之間聚合形成碳碳單鍵，而漆酶0pS5敲除突變體中又有"化合物1"的 積累，因此發(fā)明人推斷漆酶0pS5催化"化合物1"的烯醇式結(jié)構(gòu)"四羥基甲苯"（式V)氧化 聚合形成卵胞菌素（式VII)。
[0308] NMR(CD30D，400MHz):
[0311] 驗證實驗：
[0312] 發(fā)明人用分離得到的"化合物1"喂養(yǎng)突變體A〇PS7: :0pS3,用HPLC檢測其發(fā)酵 液，結(jié)果如圖18所示。
[0313] 從圖中我們可以看到，在突變體A〇pS7: :0pS3中加入"化合物1"使得卵孢霉素的 合成得以恢復(fù)，因此"化合物1"是由〇pS7催化產(chǎn)生的。
[0314] 結(jié)合圖16, 0pS5的敲除阻斷了卵孢霉素的合成，且導(dǎo)致了"化合物1"的積累，因 此漆酶0pS5以"化合物1"為底物合成卵孢霉素。
[0315] 實施例3卵孢霉素的合成途徑
[0316] 發(fā)明人推斷卵孢霉素的合成途徑如圖19所示。具體如下：
[0317] (1)聚酮合酶OpSl以乙酰輔酶A為原料催化苷色酸的合成；
[0318] (2)苷色酸由羥化酶0ps4催化，經(jīng)脫羧羥化反應(yīng)生成"化合物2"（三羥基甲苯）；
[0319] (3) "化合物2"不穩(wěn)定，會轉(zhuǎn)化為其酮式結(jié)構(gòu)"化合物3"，并且化合物2會氧化聚 合形成少量的"化合物4"（5, 5' -二脫氧卵孢霉素）；
[0320] (4) "化合物2"（三羥基甲苯）經(jīng)Cupin蛋白0pS7羥基化生成四羥基甲苯，少量 四羥基甲苯會轉(zhuǎn)化為其酮式結(jié)構(gòu)"化合物1" ；
[0321] (5)四羥基甲苯由漆酶0pS5催化，經(jīng)氧化和自由基二聚化反應(yīng)生成卵孢霉素。
[0322] 實施例4卵孢霉素具有殺蟲和抑菌效果
[0323] 4. 1殺蟲實驗
[0324] 發(fā)明人以大蠟螟為實驗對象進行白僵菌殺蟲實驗。
[0325] 取球孢白僵菌野生型WT、無法合成卵孢霉素的突變體Λ OpSl以及卵孢霉素高產(chǎn) 菌株WT: :0pS3的孢子懸液（濃度為106個孢子/ml)，分別注射大蠟螟幼蟲，每條幼蟲注射 10 μ 1的孢子懸液，每種菌注射50條幼蟲；另設(shè)一組空白對照，注射0. 05%的Tween溶液。 將注射后的大蠟螟幼蟲按所注射孢子的不同分別養(yǎng)在不同容器里，并置于25°C飼養(yǎng)。每隔 12h記一次數(shù)，觀察大蠟螟的死亡情況。實驗結(jié)果如圖20所示。
[0326] 結(jié)果表明，球孢白僵菌野生型WT和卵孢霉素高產(chǎn)菌株WT: :0pS3的殺蟲毒力明顯 強于無法合成卵孢霉素的突變體△ OpSl，說明卵孢霉素在白僵菌的殺蟲過程中起著重要作 用。
[0327] 4. 2抑制昆蟲免疫系統(tǒng)實驗
[0328] 發(fā)明人分別在注射孢子后的第24h、第36h和第48h取被感染大蠟螟的血淋巴進行 鏡檢，結(jié)果如圖21所7K。
[0329] 從圖中可以看到，在注射白僵菌孢子24h后，野生型WT和卵孢霉素高產(chǎn)菌株 WT: :0pS3的孢子已經(jīng)突破大蠟螟血細胞的包裹開始萌發(fā)，而突變體Λ OpSl的孢子則無法 突破血細胞的包裹；注射后36h，當(dāng)WT和WT: :0pS3的孢子已經(jīng)開始大量繁殖，并形成蟲菌 體時，極少數(shù)的AOpSl孢子才剛開始突破包裹萌發(fā)。由此可見，卵孢霉素在抑制昆蟲免疫 系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用。
[0330] 與此同時，我們還觀察到被WT和WT: : 0pS3感染的大蠟螟的尸體呈紅色，而被 Λ OpSl感染的大蠟螟尸體不呈紅色，且蟲體內(nèi)菌絲生長緩慢，如圖22所示。
[0331] 綜上表明，卵孢霉素作為球孢白僵菌主要的外分泌次級代謝產(chǎn)物，不僅影響球孢 白僵菌的殺蟲過程，對于白僵菌的后續(xù)生長及再感染也至關(guān)重要。
[0332] 4. 3抑菌實驗
[0333] 與WT和WT::0pS3相比，突變體AOpSl感染的大蠟螟幼蟲更容易感染細菌，使蟲 尸腐爛發(fā)臭。因此，發(fā)明人推斷卵孢霉素還有抑菌作用，幫助白僵菌拮抗其他腐生微生物的 競爭。為此，發(fā)明人對卵孢霉素進行了革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌的抑菌實驗。
[0334] 實驗方法：
[0335] 配制不同濃度的卵孢霉素水溶液，浸潤厚濾紙片并貼于長有枯草芽孢桿菌的培養(yǎng) 基平板上，將培養(yǎng)基置于37 °C培養(yǎng)12h。
[0336] 實驗結(jié)果如圖23所示：
[0337] 在卵孢霉素濃度為lmg/ml和0. 8mg/ml的濾紙片周圍形成了明顯的抑菌圈，表明 卵孢霉素確實具有良好的抑菌作用。
[0338] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種卵孢霉素的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括編碼卵孢霉素生物 合成所涉及的7個卵孢霉素合成相關(guān)基因：OpSl、OpS2、OpS3、0pS4、OpS5、OpS6、OpS7 ; 其中，OpSl位于基因簇核苷酸序列第24759 - 32012位，編碼聚酮合酶/苷色酸合酶， 長度為2211個氨基酸； 0pS2位于基因簇核苷酸序列第32992 - 34102位，編碼轉(zhuǎn)運蛋白，長度為350個氨基 酸； 0pS3位于基因簇核苷酸序列第36584 - 38809位，編碼轉(zhuǎn)錄因子，長度為741個氨基 酸； 0pS4位于基因簇核苷酸序列第39149 - 40901位，編碼羥化酶，長度為427個氨基酸； 0pS5位于基因簇核苷酸序列第41885 - 44041位，編碼漆酶，長度為590個氨基酸； 0pS6位于基因簇核苷酸序列第44430 - 45147位，編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，長度為218 個氨基酸； 0pS7位于基因簇核苷酸序列第45713 - 46768位，編碼Cupin蛋白，長度為305個氨基 酸。2. -種卵孢霉素的生物合成相關(guān)蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列是選自如 SEQ ID NO. : 2-8所示的氨基酸序列。3. -種卵孢霉素的生物合成相關(guān)基因，其特征在于，所述基因編碼權(quán)利要求2所述卵 孢霉素的生物合成相關(guān)蛋白。4. 一種表達載體，其特征在于，所述表達載體含有權(quán)利要求1所述的卵孢霉素的生物 合成基因簇或其片段，或權(quán)利要求3所述的卵孢霉素的生物合成相關(guān)基因。5. -種重組的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權(quán)利要求4所述的表達載體， 或其染色體上整合有外源的權(quán)利要求1所述的卵孢霉素的生物合成基因簇或權(quán)利要求3所 述的卵孢霉素的生物合成相關(guān)基因。6. 一種球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，其特征在于，在所述的球孢白僵菌中，卵 孢霉素的生物合成基因簇中選自下組的一個或多個基因被失活：〇pSl、0pS3、0pS4、0pS5、 0pS6、0pS7,從而不產(chǎn)生卵孢霉素。7. 一種球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，所述的球孢白僵菌中，卵孢霉素的生物合 成基因簇中一個或多個基因被過表達，從而提高或恢復(fù)卵孢霉素的產(chǎn)量， 其中，所述的被過表達基因選自下組：〇pSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6和0pS7。8. -種卵孢霉素生物合成基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于合成卵孢霉素的 前體或中間體，其中所述的卵孢霉素生物合成基因或其蛋白選自下組：〇pSl、0pS4、0pS5、 0pS7〇9. 一種制備卵胞霉素的方法，包括步驟： (i) 在適合培養(yǎng)的條件并且在添加原料化合物的情況下，培養(yǎng)產(chǎn)生卵胞霉素的宿主細 胞，從而產(chǎn)生卵胞霉素，其中所述的原料化合物選自下組：苷色酸（式I)、化合物2 (式II)、 四羥基甲苯（式V)或其組合；和 (ii) 分離或純化出所述的卵胞霉素。10. -種對宿主細胞進行改造的方法，其特征在于，包括步驟： (a)測定所述宿主細胞中屬于卵胞霉素合成基因簇的各相關(guān)基因的表達和/或活性； (b)根據(jù)測定結(jié)果，向所述宿主細胞中導(dǎo)入卵胞霉素合成基因簇的相關(guān)基因，從而提高 /恢復(fù)所述宿主細胞產(chǎn)生卵胞霉素的能力， 其中，所述的基因簇的相關(guān)基因包括一種或多種以下基因：〇pSl、OpS3、0pS4、OpS5、 OpS6 或 OpS7。
【文檔編號】C12N9/02GK105985967SQ201510070362
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月10日
【發(fā)明人】王成樹, 馮鵬, 商艷芳
【申請人】中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院