專利名稱：細(xì)胞穿膜肽hPP10及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體講，涉及一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽及其用途。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的生物分子比如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統(tǒng)藥物不同的是，這些治療分子在體內(nèi)穩(wěn)定性低、需要在胞內(nèi)發(fā)揮功能的分子難以進(jìn)入細(xì)胞，因而會限制其作為藥物的推廣應(yīng)用。故開發(fā)能有效攜帶這些治療性生物大分子進(jìn)入靶細(xì)胞、經(jīng)濟(jì)、安全的載體系統(tǒng)是亟需解決的問題。近年來，非病毒藥物運輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應(yīng)等優(yōu)點被寄予厚望。迄今比較常用的生物大分子細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入方式有如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和有機高分子納米顆粒等可能存在著安全隱患如對細(xì)胞的毒性作用、胞內(nèi)釋放困難、難于組裝及操作，難于應(yīng)用到個體等這樣那樣的缺點。因此尋找新型的、理想的非病毒藥物輸送系統(tǒng)引起了學(xué)者們的廣泛興趣(圖21)。在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)技術(shù)的基礎(chǔ)研究取得了突破性進(jìn)展。國內(nèi)外學(xué)者在對一些病毒感染特性的研究中相繼發(fā)現(xiàn)了一類蛋白結(jié)構(gòu)域，如=HIV-ITat (48 60)、VP22(267 300)，以及果蠅蛋白ANTP(43 58)等具有介導(dǎo)異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿和核內(nèi)的功能，這一類富含陽離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細(xì)胞膜穿透妝(cell-penetrating peptides,CPP)、穿膜妝或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction
domains, PTDs)。1988年Green和Frankel等首次發(fā)現(xiàn)TAT-人免疫缺陷病毒(HIV)
的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以穿透細(xì)胞膜/核膜進(jìn)入細(xì)胞漿/細(xì)胞核，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白第48-60位氨基酸殘基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全發(fā)揮其穿膜功能。以后又相繼發(fā)現(xiàn)了多個源自病毒或其他生物的CPP,如I型單純皰疫病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)蛋白的VP22、果妮同源觸角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapediatranscription protein, ANTP)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前 S 抗原等。依據(jù)其來源不同可將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CPP大致分為兩類一類為如上面提及的TAT、VP22、ANTP 和前S抗原來源于病毒的短肽等；另一類為根據(jù)天然CPP的特點人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-U MAP、transportan和各種基于不同信號序列合成的肽段等。CPP能在體外或體內(nèi)作為載藥多肽，介導(dǎo)一系列生物活性分子如DNA、SiRNA、多肽、蛋白質(zhì)甚至納米顆粒等進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。這些CPP因其本身具有低毒副作用、不干擾所攜帶生物大分子活性等，而被廣泛用于體外或/和體內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)運送生物活性分子，尤其是在抗腫瘤治療的應(yīng)用研究方面更是引人注目。CPP研究在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用研究上都具有極大意義，作為一種有效的胞內(nèi)運載工具，有著廣泛的應(yīng)用前景(圖22)。然而來源于病毒或其他種屬生物蛋白結(jié)構(gòu)域的CPP，在臨床應(yīng)用上可能仍然存在一定的安全隱患，比如可能的細(xì)胞毒性和免疫原性問題。人們對TAT作為CPP進(jìn)行了大量研究，腹腔注射Tat- β -半乳糖苷酶，能進(jìn)入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用于臨床研究。另有報道稱，應(yīng)用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發(fā)了嚴(yán)重的肺部病理反應(yīng)?？梢?，針對不同治療需要，開發(fā)更為安全的、新型穿膜肽一一人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。2002年，Beck-Sickinger AG小組開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了第一個人源性穿膜肽--來源
于人降血鈣素(hCT)的第9-32的殘基。隨后相繼報道的人源性穿膜肽還有來自于hCLOCK蛋白(一種與生物節(jié)律調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，2004年)、Hph-l ( 一種人源轉(zhuǎn)錄因子，2006年)、Bag_l蛋白(一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質(zhì)激素受體的蛋白，2006年)、pl4ARF蛋白(一種人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳鐵蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86_101 (2010年)和TCTP蛋白(來源于人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個氨基酸殘基，2011年)的CPP等。與其他物種蛋白來源的CPP相比，人源性CPP弓丨起人體的免疫反應(yīng)的可能性小，潛在的不安 全因素相對少，作為人類疾病治療的藥物載體，具有絕對優(yōu)勢，有著更廣闊的開發(fā)、應(yīng)用前
旦
-5^ OFutaki S等發(fā)現(xiàn)穿膜肽的穿膜能力與多肽序列中精氨酸殘基的數(shù)量和位置有很大的相關(guān)性。我們在從事細(xì)胞穿膜肽研究中，通過對蛋白數(shù)據(jù)庫中一級結(jié)構(gòu)的檢索、分析發(fā)現(xiàn)人源性的賴氨酸特異性去甲基化轉(zhuǎn)移酶4A內(nèi)的一段長為20個氨基酸的短肽的一級結(jié)構(gòu)富含屬于堿性氨基酸的精氨酸和賴氨酸，分布著很強的正電荷，這與大多數(shù)已知CPP的結(jié)構(gòu)特點很相似，繼而分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它可形成經(jīng)典的α-螺旋構(gòu)象。推測這段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我們繼而合成了這段短肽并命名為hPPIO，觀察了其對培養(yǎng)細(xì)胞的穿膜效率，細(xì)胞毒性及穿膜機制，同時還觀察、評估了其向細(xì)胞內(nèi)遞送綠色熒光蛋白(GFP)和質(zhì)粒DNA的效果，為hPPIO作為一種新型人源性藥物運輸載體的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO以及將其用作細(xì)胞內(nèi)藥物運輸載體的用途。一方面，本發(fā)明提供了一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO。hPPIO是源于人類細(xì)胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A (lysine-specific demethylase 4A)的一段多肽序列，hPPIO的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (賴氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸)。另一方面，本發(fā)明提供了將所述新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO用作細(xì)胞內(nèi)藥物運輸載體的的用途。我們首次發(fā)現(xiàn)這一肽段具有穿透細(xì)胞膜的功能，并可攜帶蛋白、核酸(DNA質(zhì)粒)等跨膜進(jìn)入多種細(xì)胞(包括貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以及原代培養(yǎng)細(xì)胞等)內(nèi)，是一種極具開發(fā)前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運輸載體。本發(fā)明的優(yōu)點在于，與其他生物蛋白來源的CPP相比，人源性CPP — hPPIO引起人體的免疫反應(yīng)的可能性小，潛在的不安全因素相對少。因此，作為臨床應(yīng)用的藥物分子載體有著更為廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明新型人源性穿膜肽hPPIO的二級輪狀結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明新型人源性穿膜肽hPPIO的二級結(jié)構(gòu)中存在的螺旋及疊折分析示意圖。圖3是本發(fā)明新型人源性穿膜肽hPPIO的原核表達(dá)及純化結(jié)果的電泳照片。其中M :蛋白分子量標(biāo)志I pET15b-hPP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌IPTG誘導(dǎo)前裂解液2 pET15b-hPP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌IPTG誘導(dǎo)后裂解液3 :純化后的 hPP10_6xHis圖4是熒光標(biāo)記的hPPIO ChPPlO-FITC)穿膜進(jìn)入不同腫瘤細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況。圖5是hPP10-FITC穿膜進(jìn)入原代人外周血淋巴細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況。圖6不同濃度hPP10-FITC的穿膜效率。A :ECV_304胞內(nèi)熒光鏡下觀；B :ECV_304胞內(nèi)熒光定量。圖7表示孵育時間對hPP10-FITC入胞的影響。A hPP10-FITC短時間孵育后的熒光定量；B =TAT-FITC短時間孵育后的熒光定量；C hPP10-FITC長時間孵育后的熒光定量； D =TAT-FITC長時間孵育后的熒光定量。圖8表示血清對hPP10-FITC穿膜效率的影響。圖9表示不同細(xì)胞經(jīng)DMSO預(yù)處理對hPP10_FITC穿膜效率的影響。A =DMSO預(yù)處理各種不同類型細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況DMS0預(yù)處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后的胞內(nèi)熒光定量。圖10表示原代淋巴細(xì)胞經(jīng)5%DMS0預(yù)處理對hPP10-FITC穿膜效率的影響。A :DMS0預(yù)處理原代培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況；B :DMS0預(yù)處理原代培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況。圖11表示hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pDsRed轉(zhuǎn)染的效果。圖12表示pcDNA3. I-Gluc重組質(zhì)粒構(gòu)建提取和BamH I/Xbal I的雙酶切鑒定。泳道I :pcDNA3. I-Gluc ;泳道 2 pcDNA3. I-Gluc 的 Nco I/BamH I 的雙酶切。圖13表示hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染的效果。圖14表示pET15b-hPP10_GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建和Nde I/BamH I的雙酶切鑒定。泳道I :pET15b-hPP10-GFP ;泳道 2 :pET15b-hPP10_GFP 的 Nde I/BamH I 的雙酶切。圖 15 表示 SDS-PAGE 分析 IPTG 誘導(dǎo) pET15b_GFP、pET15b_hPP10_GFP 在 Rosetta細(xì)菌中的表達(dá)及純化。泳道3和4分別為純化的GFP和hPP10_GFP融合蛋白；泳道2和5分別為GFP和hPP10_GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；泳道I和6分別為GFP和hPP10_GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)。
圖16表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜進(jìn)入L929細(xì)胞的分布情況。圖17表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜進(jìn)入原代人外周血淋巴細(xì)胞的分布情況。圖18表示MTT檢測hPP10-FITC處理后對細(xì)胞活力的影響。圖19表示不同溫度下DMSO預(yù)處理后熒光短肽在胞內(nèi)的含量。

圖20表示不同內(nèi)吞抑制劑對hPPIO穿膜效率影響。A :肝素處理各種不同類型細(xì)胞后胞內(nèi)熒光強度；B :氯喹預(yù)處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后胞內(nèi)熒光強度；C :氯丙嗪處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后的胞內(nèi)熒光強度。 圖21是新型治療分子胞內(nèi)遞送策略示意圖。圖22是細(xì)胞穿膜肽(CPP)及其可攜帶入胞的生物藥物的工作原理示意圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的方案做更詳細(xì)的說明。實施例I、CPP —級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測、鑒定新型人源性CPP 二級結(jié)構(gòu)分析采用了 emboss的在線分析程序(其分析程序請參見網(wǎng)頁http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/pepwheel 在線分析多妝的輪狀結(jié)構(gòu);http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/ 在線分析二級結(jié)構(gòu)的螺旋、疊折等)。hPPIO的輪狀結(jié)構(gòu)示意圖，螺旋、疊折結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖I和圖2所示?；瘜W(xué)合成綠色熒光標(biāo)記的hPPIO :FITC-Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (hPP10-FITC)和無綠色熒光標(biāo)記hPPIO Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(hPPIO)純化定量、冷凍保存?zhèn)溆谩?. hPPIO的合成途徑有兩種I)化學(xué)合成；2)基因工程表達(dá)。hPPIO源于自然蛋白，可以在實驗室水平或工業(yè)水平進(jìn)行合成。2. I化學(xué)合成方法此種方法是選擇羧基樹脂(Fmoc-Tyr (tBu)-Wang resin),采用固相Fmoc法合成。具體合成步驟如下(I)用Fmoc基團(tuán)對α -氨基進(jìn)行保護(hù)的賴氨酸通過一個支臂連結(jié)到不溶性載體王氏樹脂(Wang resin)上；(2)用TFA(三氟乙酸)溶液洗滌賴氨酸一支臂一樹脂，使α-氨基脫保護(hù)；(3)將第二個預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α -氨基保護(hù)的異亮氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與賴氨酸形成共酯連接上去；(4)用TFA(三氟乙酸)溶液洗滌異亮氨酸一支臂一樹脂，使α-氨基脫保護(hù)；(5)將第三個預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α -氨基保護(hù)的脯氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與異亮氨酸形成共酯連接上去。重復(fù)進(jìn)行上述脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到耦合上最后一個氨基酸——精氨酸，脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，合成完成。
(6)將切割試劑加入到肽——樹脂中，把肽鏈從樹脂上切割下來，同時也將各個氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)從肽鏈上切割下來，加入乙醚，沉淀多肽，獲得多肽粗品。運用HPLC/MS進(jìn)行多肽的鑒定和純化，最終得到所需多肽。2. 2基因工程表達(dá)法采用原核表達(dá)方法，具體操作如下(I)設(shè)計編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點，交由上海生工公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C 5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補的雙鏈DNA片段(hPPIO)；(2)利用Ndel/Xhol兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b (購自 Novagen)線性化； (3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶。瞬時離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置于16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽性克隆pET15b-hPP10，酶切并測序驗證；(7)將驗證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌。經(jīng)O. Ig/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜；(8)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(9)用15ml無菌離心管裝3. 8ml Amp (+)LB液體培養(yǎng)基，接種O. 2ml對數(shù)生長期的菌懸液(I: 20)。37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h ；(10)于對數(shù)生長期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM，37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(11)在加入IPTG后6h取樣200 μ I菌懸液；(12)離心收集沉淀,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min。制備的菌體全蛋白上樣樣品；(13) SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況，如圖3。確認(rèn)的表達(dá)及純化。3. hPPIO具有很強穿膜效能3. IhPPlO-FITC具有顯著穿膜特征并在胞內(nèi)分布均勻；3. I. IhPPlO-FITC可以穿膜進(jìn)入體外培養(yǎng)的腫瘤等細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)均勻分布，具有顯著穿膜特征；取對數(shù)生長期的四種培養(yǎng)細(xì)胞疋(^-304、抱1^、!1印62、？03，依1\105個細(xì)胞/孔的密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)實驗組及對照組；至對數(shù)生長期(80%密度)時，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC,常規(guī)培養(yǎng)I小時；棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次；
熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光及其胞內(nèi)定位情況。結(jié)果見圖4，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)hPP10-FITC處理的各種細(xì)胞內(nèi)無綠色熒光。在經(jīng)hPP10-FITC溫育后，可在胞內(nèi)見到明顯綠色熒光，且這四種不同細(xì)胞系均有明顯胞內(nèi)熒光，提示hPP 10穿膜進(jìn)入細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞嗜向性。3. I. 2hPP10-FITC對人外周血淋巴細(xì)胞有穿膜特征新鮮采取、分離的健康人外周血淋巴細(xì)胞，依IX IO5個細(xì)胞/孔的密度接種于12孔板，設(shè)實驗組及對照組；在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2小時后，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC,常規(guī)培養(yǎng)I小時；棄去孵育液，PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光及其胞內(nèi)定位情況。結(jié)果見圖5，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)hPP10-FITC處理的人外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)不見綠色熒光。在經(jīng)hPP10-FITC溫育后，可見到明顯的胞內(nèi)綠色熒光，提示hPPIO可高效穿膜進(jìn)入新鮮制備的人外周血淋巴細(xì)胞。3. 2hPP10-FITC穿膜進(jìn)入細(xì)胞具有濃度依賴性ECV-304細(xì)胞在經(jīng)無血清的RPMI-1640處理Ih后，加入濃度梯度的hPP10_FITC(2. 5 μ Μ、5. O μ Μ、7. 5 μ Μ、10. O μ Μ)孵育Ih后，PBS清洗3次，觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光情況。并采用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光密度數(shù)值，具體方法如下細(xì)胞在經(jīng)不同濃度hPP10-FITC孵育結(jié)束后，PBS清洗3次，按300 μ I/孔加入0. IM NaOH，室溫裂解細(xì)胞lOmin，IOOOrpm離心3min。取細(xì)胞裂解液上清50μ I于96孔板在熒光酶標(biāo)儀中，激發(fā)光/吸收光為490nm/520nm下測定熒光密度值。實驗重復(fù)3次取平均值。在實驗中，采用經(jīng)典的穿膜肽TAT-FITC作為陽性對照。圖6A顯示，胞內(nèi)熒光強度隨hPP10-FITC濃度升高而增強，并且可見相同濃度下，胞內(nèi)hPP10-FITC熒光比TAT-FITC強。圖6B可見，隨著hPP10_FITC濃度的升高，胞內(nèi)熒 光強度隨之增強，提示hPP10-FITC穿膜進(jìn)入細(xì)胞具有濃度依賴性。當(dāng)hPP10-FITC濃度為5 μ M時，熒光強度已經(jīng)比較高，在后續(xù)實驗中均選用了 5 μ M的hPP10-FITC作為終濃度進(jìn)行實驗。3. 3hPP10胞內(nèi)持續(xù)時間顯著長于TATC0S7、ECV-304、PC3、HeLa在經(jīng)無血清的RPMI-1640培養(yǎng)處理Ih后，加入終濃度為5 μ M 的 hPP10-FITC 分別孵育 0. 5h、I. Oh,2. Oh,4. Oh、10h、20h 及 30h 后。PBS 洗滌三次，裂
解細(xì)胞，依前述方法用熒光酶標(biāo)儀檢測490nm/520nm檢測細(xì)胞裂解液上清熒光值。實驗均重復(fù)3次取平均值。不同的培養(yǎng)細(xì)胞隨著hPP10-FITC孵育時間的延長，其熒光值均有所增強，至4h其熒光值為最高(圖7A)。而TAT-FITC在孵育Ih時，胞內(nèi)熒光強度為最大，隨著孵育時間的進(jìn)一步延長，熒光值逐漸減弱(圖7B)。為了進(jìn)一步確定hPP10-FITC在胞內(nèi)維持時間，將孵育時間延長至30h。發(fā)現(xiàn)hPP10-FITC在ECV_304、PC3和HeLa三種細(xì)胞中可以維持至至少30小時(7C );而TAT-FI TC在細(xì)胞內(nèi)熒光隨著時間推移急劇下降，于IO小時時已經(jīng)基本不能檢測到熒光存在(7D)。本研究顯示新型人源性穿膜肽hPPIO在胞內(nèi)維持時間至少可達(dá)30小時,而TAT僅能維持短短幾小時時間，顯著短于hPPIO。
3. 4血清降低hPP10-FITC穿膜效率培養(yǎng)細(xì)胞H印G2、ECV-304及B16分別在經(jīng)有血清和無血清的RPMI-1640培養(yǎng)Ih后，加入終濃度為5μΜ的hPP10-FITC繼續(xù)孵育Ih后，PBS清洗3次，裂解細(xì)胞，取其上清液用熒光酶標(biāo)儀檢測490nm/520nm波長處熒光吸光值。實驗重復(fù)3次取平均值。結(jié)果見圖8，一般情況下血清的存在會影響細(xì)胞對穿膜肽的內(nèi)吞攝取。通過熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，血清的存在對hPP10-FITC穿膜入胞有很大影響。無血清組hPPIO穿膜效率明顯高于有血清組(P < O. 05)。結(jié)果顯示血清的存在影響hPPIO的穿膜效率。3. 5DMS0預(yù)處理促進(jìn)hPPIO穿膜進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞取對數(shù)生長期貼壁培養(yǎng)細(xì)胞HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞THPl及原代培養(yǎng)纖維細(xì)胞，按照I X IO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每種細(xì)胞均分設(shè)實驗組及對照組；

至對數(shù)生長期(80%密度)時，換為無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，再培養(yǎng)I小時；每孔加入終濃度為5%的DMS0，繼續(xù)培養(yǎng)I小時。加入終濃度為5 μ M的hPP10_FITC或TAT-FITC后，孵育I小時;棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞THPl及原代培養(yǎng)纖維細(xì)胞胞內(nèi)熒光及其胞內(nèi)定位情況，或按每孔加入300μ I 0. IM NaOH，室溫裂解ECV-304，Caski或B16細(xì)胞10分鐘，IOOOrpm離心3分鐘。取細(xì)胞裂解液上清50 μ I到96孔板于熒光酶標(biāo)儀，于490nm/520nm下測定熒光吸光值。實驗重復(fù)3次取平均值。本發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)DMSO可以明顯增強TAT穿膜效率，在此，也觀察了 DMSO對新型人源性穿膜肽膜hPPIO的穿膜影響。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DMSO對hPP10-FITC穿膜具有明顯增強效果。與經(jīng)過DMSO預(yù)處理后TAT-FITC穿膜效率相比，DMSO預(yù)處理細(xì)胞后hPP10-FITC穿膜效率與TAT相當(dāng)或略強于TAT-FITC(圖9A)。經(jīng)DMSO預(yù)處理后，hPP10_FITC在胞內(nèi)顯示搞密度綠色熒光，且均勻分布于胞漿和胞核，即使是對普通轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)非常困難的懸浮細(xì)胞或原代細(xì)胞，hPP10-FITC也具有非常理想的穿膜效果。熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，5%DMS0預(yù)處理后，hPP10-FITC和TAT-FITC的胞內(nèi)熒光強度較未經(jīng)DMSO預(yù)處理細(xì)胞強(圖9B)，hPP10-FITC的胞內(nèi)熒光強度明顯強于TAT-FITC。提示5%DMS0預(yù)處理細(xì)胞明顯存進(jìn)了hPPIO和TAT的穿膜效率，DMSO能夠顯著增強CPP的穿膜效率且無細(xì)胞特異性(圖9)。3. 6DMS0預(yù)處理促進(jìn)hPPIO穿膜進(jìn)入新鮮制備的淋巴細(xì)胞新鮮采取、制備人外周血淋巴細(xì)胞，或小鼠脾淋巴哦細(xì)胞，按照IXlO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板；在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2小時后，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC，常規(guī)培養(yǎng)I小時；棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光強度及胞內(nèi)熒光定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DMSO預(yù)處理后，hPP10-FITC也可以高效穿膜進(jìn)入新鮮制備的人外周血或小鼠脾淋巴細(xì)胞，并均勻分布于胞漿和胞核，圖10A為小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)hPP10-FITC密度和分布；圖10B為人外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)hPP10-FITC密度及分布。提示hPPIO不僅可以穿膜進(jìn)入貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，還可以穿膜進(jìn)入新鮮制備的人外周血淋巴細(xì)胞、或小鼠脾淋巴細(xì)胞，顯示了極其廣泛的應(yīng)用前景。實施例2、hPP10介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法包括以下步驟(1)取對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304,以I X IO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時設(shè)置相應(yīng)的陽性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時，將培養(yǎng)液換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時；(3)與此同時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為ΙΟμΜ hPPIO加入含50μ I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的質(zhì)粒加入含50 μ I Opti-MEM的另外一個離心管中，輕輕混 勻后在室溫下孵育5min。將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min ；(4)將上述hPPIO+質(zhì)粒DNA混合溶液均勻地加入到相應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞中，輕搖混勻。以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實驗陽性對照；(5)置細(xì)胞于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育4_6h后，換成含小牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24-48h ；(6)觀察hPPIO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效果，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和陽性對照肽TAT作為轉(zhuǎn)染陽性對照。2. IhPPlO介導(dǎo)紅色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pDsRed轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染后4-6小時更換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，熒光顯微鏡下觀察ECV-304細(xì)胞經(jīng)hPPIO介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed (購自Clontech公司)的效果。由圖11可見,hPPIO能介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed，一些培養(yǎng)細(xì)胞中有紅色熒光蛋白表達(dá)。2. 2質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc的構(gòu)建及hPPIO介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染的效果2. 2. I真核重組質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc構(gòu)建和酶切鑒定(I)利用BamHI/Xball兩種酶進(jìn)行雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. I ( + )(購自invitrogen公司)和質(zhì)粒pGLuc-Basic Vector (真核表達(dá)分泌型突光素酶載體,購自NEB公司)，37°C，溫育2h ；(2)分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠回收線性化的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. I ( + )和分泌型突光素酶(Gaussia Luciferase)的cDNA片段至離心管中，離心,依切膠回收試劑盒操作說明回收DNA片段；(3)將回收到的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接用DNA比例，配鏈接反應(yīng)體系，置于16°C水浴箱中過夜連接；(4)取DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法以連接產(chǎn)物pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單個菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，37°C過夜振蕩培養(yǎng)；(5)用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽性克隆，限制性內(nèi)切酶鑒定用BamHI/Xball雙酶切重組質(zhì)粒，得到酶切產(chǎn)物，pcDNA3. Ihe理論值為590bp的插入片段DNA帶(圖12)，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期大小一致；并經(jīng)測序確認(rèn)插入片段無突變。表明成功構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc02. 2. 2hPP10 介導(dǎo)質(zhì)粒 pcDNA3. I-Gluc 轉(zhuǎn)染的效果
(I)取對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以I X IO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時設(shè)置相應(yīng)的陽性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時，將培養(yǎng)液換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時；(3)與此同時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為ΙΟμΜ證？10加入含5(^1 Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的質(zhì)粒加入含50 μ IOpti-MEM的另外一個離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min。將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置 30min ；(4)將hPPIO+質(zhì)?；旌衔锞鶆虻募尤氲较鄳?yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻。以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實驗陽性對照；(5)在5%C02培養(yǎng)箱中，37°C繼續(xù)溫育4_6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ；(6)取200 μ I培養(yǎng)液上清(含有分泌型熒光素酶)置于I. 5ml離心管中，5000rpm離心3min，依分泌型熒光素酶試劑盒使用說明，運用熒光微孔測定儀，檢測培養(yǎng)上清熒光素酶活性，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑作為轉(zhuǎn)染陽性對照，TAT和無意義肽NCO作為陽性和陰性肽對照，各處理樣品中熒光素酶活性結(jié)果見圖13。圖13可見，hPPIO成功介導(dǎo)了分泌型熒光素酶質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染，細(xì)胞表達(dá)了較高水平的熒光素酶蛋白，且其活性隨著hPPIO濃度的增高而逐步增強。本研究成功利用hPPIO介導(dǎo)了質(zhì)粒DNA (pDsRed和pcDNA3. 1-Gluc)的轉(zhuǎn)染，但是其轉(zhuǎn)染效率與商用試劑Lipofectamin 2000相比顯得較低，我們將繼續(xù)優(yōu)化hPPIO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染實驗條件條件，以期提高轉(zhuǎn)染效率。hPPIO成功介導(dǎo)DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染將為體外和體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染提供強有力工具，將來可應(yīng)用到科學(xué)研究和臨床上的基因治療。實施例3、pET15b-hPP10-GFP質(zhì)粒構(gòu)建，融合蛋白的表達(dá)及純化和其穿膜功效的研究3. lpET15b-hPP10_GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定
(I)設(shè)計編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點，交由上海生工公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補的雙鏈DNA片段(hPPIO);同時設(shè)計一對引物以pEGFP (購自Clontech公司)為模板，PCR獲得GFP蛋白基因片段，兩側(cè)分別有XhoI和BamHI酶切位點，純化PCR產(chǎn)物備用；(2)利用BamHI/Ndel兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b (購自Novagen)線性化；(3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)、以及GFP基因片段分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置于16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽性克隆pET15b-hPP10-GFP，酶切并測序驗證；利用Nde I/BamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET15b-hPP10_GFP得到酶切產(chǎn)物理論值為795bp(圖14)，片段與預(yù)期大小一致；經(jīng)測序確認(rèn)無突變。說明原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-hPP10-GFP 構(gòu)建成功。相同方法構(gòu)建得到 pET15b_GFP 和 pET15b_TAT_GFP3. 2融合蛋白的表達(dá)及純化3. 2. I融合蛋白的原核表達(dá)

(I)將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET15b_GFP和pET15b_hPP10_GFP分別轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜；(2)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(3)用15ml無菌離心管裝3. 8ml LB(+)^液體培養(yǎng)基，接種O. 2ml對數(shù)生長期的菌懸液(I: 20)。37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h ；(4)于對數(shù)生長期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM，37 °C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(5)在加入IPTG后6h取樣200 μ I菌懸液；(6)離心收集沉淀,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min。制備的菌體全蛋白上樣樣品；(7) SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況。3. 2. 2融合蛋白的純化3. 2. 2. I大量誘導(dǎo)用IL培養(yǎng)瓶中盛300ml LB (+)Amp液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)可溶性的重組蛋白(I. OmM IPTG，30°C，250rpm，9h)。4°C 6500rpmX lOmin，收集沉淀并稱重，_40°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2. 2 咪唑純化(I)超聲裂解平均 IOOml 菌液用 15ml Lysis/Binding Buffer (300mM NaCl,50mMNaH2P04, IOmM咪唑，pH 8. 0)重懸，冰浴。超聲功率30(T600W，超聲2sec，間隔2sec，工作90次。如此循環(huán)12 20次，至均勻破碎細(xì)菌于懸浮溶液；(2) 12000rpmX20min,4°C,轉(zhuǎn)移上清至 15ml 離心管中；(3)結(jié)合用3 5倍體積的Lysis/Binding Buffer在15ml離心管中平衡Ni-NTA,離心收集Ni-NTA,再用與沉淀等體積的Lysis/Binding Buffer重懸，即已平衡的50%Ni-NTA。取I 4ml 50%Ni-NTA與裂解上清混合，在分子雜交爐中37°C轉(zhuǎn)動結(jié)合I 2h ；(4)洗滌脫除雜蛋白用至少1/2菌液體積的Wash Buffer (300mMNaCl,50mMNaH2P04，2(T30mM咪唑，pH 8. 0)洗脫雜蛋白。收集前3 5ml穿柱液，取樣備做檢測；(5)洗脫靶蛋白共用 5 IOml Elution Buffer (300mM NaCl,50mM NaH2PO4, 250mM咪唑，pH 8. 0)，每次加0. 5ml，用I. 5ml離心管收集；(6)保存在96孔板中，各取5μ I樣品與195 μ I考馬斯亮藍(lán)G-250溶液混合，比較顏色深淺。留存顏色最深的數(shù)管，分別添加10(Γ200μ I無菌甘油，混勻后于_40°C保存，并取樣備做檢測。
GFP和hPP10-GFP融合蛋白相對分子質(zhì)量分別為27KD和30KD。陽性克隆在I. OmMIPTG誘導(dǎo)6小時后，經(jīng)SDS-PAGE分析所表達(dá)的融合蛋白，在35KD和27KD附近出現(xiàn)一條強表達(dá)帶，符合預(yù)期分子質(zhì)量大小(圖15)?；蚬こ瘫磉_(dá)蛋白的純化是利用6XHis標(biāo)簽，通過Ni-NTA親和層析得到有效純化，融合蛋白的純度大于80%。圖15顯示得到了純化的GFP和 hPP10-GFP 蛋白。3. 3hPP10-GFP融合蛋白穿膜功效的研究3. 3. IhPPlO-GFP融合蛋白跨膜進(jìn)入貼壁培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的能力研究(I)取對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞L929，按照I X IO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)。每種細(xì)胞均分設(shè)實驗組及對照組；(2)待細(xì)胞生長至80%融合時，換為無血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時； (3)每孔加入終濃度為5%DMS0，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)I小時；(4)實驗組加入終濃度為5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，陽性對照組加入相同濃度的蛋白TAT-GFP，同時設(shè)陰性對照。37°C培養(yǎng)箱孵育I小時；(5)棄去以上清培養(yǎng)液，PBS洗滌三次；(6)置于熒光顯微鏡下觀察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞內(nèi)定位情況。L929細(xì)胞中加入hPP10-GFP融合蛋白孵育Ih后，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)清晰明亮的綠色熒光，胞內(nèi)熒光分布均勻(圖16) j55%DMS0預(yù)處理L929細(xì)胞后胞內(nèi)hPP10-GFP熒光明顯增強。顯示hPPIO可攜帶大分子(綠色熒光蛋白)高效穿膜進(jìn)入細(xì)胞，5%DMS0預(yù)處理可顯著增強hPPIO攜帶綠色熒光蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞。3. 3. 2hPP10-GFP融合蛋白跨膜進(jìn)入人外周血淋巴細(xì)胞的穿膜能力研究(I)新鮮采取、分離制備人外周血淋巴細(xì)胞，按照I X IO5個細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板，設(shè)實驗組及對照組；(2)將12孔板在培養(yǎng)箱中靜置2小時后，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I小時；(3)每孔加入終濃度為5%DMS0，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)I小時；(4)實驗組加入終濃度為5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，陰性對照組加入相同濃度的GFP蛋白，37°C培養(yǎng)箱孵育I小時；(5)棄去以培養(yǎng)液，PBS洗滌三次；(6)置于熒光顯微鏡下觀察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞內(nèi)定位情況。新鮮采取、分離制備的人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)5%DMS0預(yù)處理后，加入hPP10-GFP融合蛋白，熒光顯微鏡下觀察到明顯的綠色熒光，胞內(nèi)熒光分布均勻(圖17);而未經(jīng)DMSO預(yù)處理細(xì)胞胞內(nèi)hPP10-GFP熒光比較微弱。本研究提示hPPIO不僅自身可以穿膜進(jìn)入細(xì)胞，也可通過融合蛋白形式攜帶大分子蛋白(GFP)跨膜進(jìn)入貼壁培養(yǎng)細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞。這一研究結(jié)果為將來開發(fā)由hPPIO作為載體向細(xì)胞內(nèi)遞送大分子蛋白藥物提供了基礎(chǔ)。實施例4、hPPIO對細(xì)胞活力影響甚微(I)取對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304和H印G2，以I X IO4個細(xì)胞/孔的接種密度接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)，每孔100 μ 1，每種細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，37°C培養(yǎng)；(2)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)液換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時；
(3)分別換成 hPPIO 濃度梯度為 1(^] 、2(^]\1、3(^]\1、4(^]\1及5(^]\1無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(4)孵育時間結(jié)束后按每孔100 μ I加入PBS洗滌，2minX 3次；(5)每孔加入80μ I含血清的正常培養(yǎng)液及20μ I MTT (母液濃度5mg/ml，即O. 5%MTT)溶液，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)后吸去培養(yǎng)液。以200 μ I/孔加入二甲基亞砜，振蕩IOmin至結(jié)晶物充分溶解后用全波長酶標(biāo)儀上檢測波長為570nm的吸光值A(chǔ)，每組取3個復(fù)孔的平均值。測定0D490。重復(fù)3次，計算細(xì)胞存活率。(6)細(xì)胞生存率的計算如下細(xì)胞生存率=(實驗孔OD值一對照孔OD值一空白孔OD值)/ (對照孔OD值一空白孔OD值)X 100%ο 為明確hPPIO處理細(xì)胞是否會影響其活力，本實驗采用MTT法測定不同濃度hPPIO處理24h后對細(xì)胞活力的影響情況。ECV-304和!fepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度hPPIO處理后MTT 分析數(shù)據(jù)顯示，濃度高于20 μ M的hPPIO長時間處理細(xì)胞后細(xì)胞依然保持在75%以上，對細(xì)胞的活力影響甚微(圖18)。提示有效濃度(小于5μΜ)范圍內(nèi)hPP10-FITC并不影響細(xì)胞活力。實施例5、hPPIO穿膜機制5. I低溫輕度抑制hPP10-FITC穿膜使用不同的培養(yǎng)細(xì)胞，如ECV_304、Caski及HeLa在經(jīng)無血清的RPMI-1640處理Ih后，加入終濃度為5 μ M的hPP10-FITC分別在4°C和37°C兩個條件下孵育Ih后，PBS清洗3次，依前述方法裂解細(xì)胞取其上清檢測490nm/520nm波長處的熒光吸光值。實驗重復(fù)3次取平均值。一般認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)吞途徑是能量依賴的，低溫時細(xì)胞的能量代謝幾乎停滯，也即低溫能夠阻斷細(xì)胞內(nèi)吞途徑。ShPPio穿膜方式是通過內(nèi)吞途徑實現(xiàn)，那么溫度的變化必然會影響胞內(nèi)熒光含量。本實驗選用在4°c和37°C兩個條件探索溫度是否影響其穿膜方式。圖19表明，低溫對hPPIO穿膜影響甚微，與迄今大多數(shù)報道結(jié)果一致。提示hPPIO短肽本身穿膜可能與內(nèi)吞機制無關(guān)。5. 2肝素顯著降低hPPIO穿膜效率觀察三種內(nèi)吞抑制劑對hPP10-FITC的穿膜影響，肝素鈉(PBS溶解，終濃度ΙΟμΜ)、氯喹(PBS溶解，終濃度ΙΟμΜ)、氯丙嗪(PBS溶解，終濃度30 μ Μ)配成母液，
0.22 um濾膜過濾滅菌。四種不同的培養(yǎng)細(xì)胞C0S7、ECV-304、PC3和HeLa在用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)Ih后，細(xì)胞中分別加入終濃度的三種內(nèi)吞抑制劑，繼續(xù)孵育30min，加入終濃度為5 μ M的hPP10-FITC孵育lh，移除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，依前述方法置于熒光酶標(biāo)儀中，檢測490nm/520nm的熒光吸光值。實驗重復(fù)3次取平均值。實驗通過培養(yǎng)細(xì)胞與不同的內(nèi)吞抑制劑孵育，考察內(nèi)吞抑制劑對hPPIO入胞情況的影響。其中肝素為細(xì)胞膜表面硫酸蛋白聚糖的競爭抑制劑；氯喹為抑制內(nèi)含體酸化的內(nèi)吞調(diào)節(jié)劑；氣丙嚷為籠型蛋白依賴的內(nèi)吞抑制劑。從圖20A中看出，在加入肝素后，細(xì)胞對hPPIO的攝取大幅度降低。提示肝素能顯著抑制hPPIO被攝取進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞膜表面的硫酸蛋白聚糖對hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。圖20B和20C顯示，氯喹和氯丙嗪對hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞的影響均不明顯。提示hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞的過程中需要與細(xì)胞膜表面硫酸蛋白聚糖等負(fù)電荷分子相互作用，可能不依賴籠型蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和內(nèi)含體酸化機制。結(jié)論我們在對現(xiàn)有CPP結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，通過對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)分析等方法，發(fā)現(xiàn)一全新的人源性細(xì)胞膜穿透肽(hCPP)，命名為hPPIO。人工合成hPPIO以及原核表達(dá)其與綠色熒光蛋白的融合蛋白(hPP10-GFP)進(jìn)行了一系列體外實驗研究。發(fā)現(xiàn)hPPIO具有很強的穿膜能力，并可攜帶大分子GFP，質(zhì)粒DNA跨膜進(jìn)入包括腫瘤細(xì)胞等貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞等多種培養(yǎng)細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞，而不影響所攜帶生物活性分子的功能，對細(xì)胞基本無毒副作用。顯示hPPIO作為一種新的人源性細(xì)胞穿膜肽，能用于體外和體內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)運送生物活性分子(如蛋白質(zhì)、多肽，基因等藥物)。hPPIO的開發(fā)將為科研(體外培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)染)、臨床治療 (向細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白或基因藥物)提供又一新型胞內(nèi)運輸工具。
權(quán)利要求
1.一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO，其特征在于hPPIO是源于人類細(xì)胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有細(xì)胞膜穿透能力。
2.如權(quán)利要求I所述的人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO，其特征在于所述穿膜肽的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-LyS-Argο
3.將權(quán)利要求I或2所述新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO用作藥物運輸載體的用途。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO可攜帶蛋白或核酸跨膜進(jìn)入多種細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述核酸是DNA質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO可攜帶大分子蛋白(GFP)進(jìn)入的細(xì)胞包括貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以及原代培養(yǎng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPP10及利用其作為細(xì)胞內(nèi)藥物運輸載體的用途。hPP10是源于人類細(xì)胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有穿透細(xì)胞膜功能，并可攜帶蛋白，核酸(DNA質(zhì)粒)跨膜進(jìn)入多種細(xì)胞，是一種極具開發(fā)前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運輸載體。
文檔編號C07K7/08GK102827254SQ201210267050
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者柳長柏, 馬節(jié)蘭, 蔡三金, 吳江鋒, 張潔, 賀曉敏, 楊英桂 申請人:三峽大學(xué)