專利名稱：非胚胎干細胞及其用途的制作方法
非胚胎干細胞及其用途相關申請的交叉引用
本申請要求2009年1月13日遞交的美國第61/144，206號專利申請的優(yōu)先權。該申請的全部內(nèi)容納入本發(fā)明作為參考。
背景技術：
全能性干細胞，諸如胚胎干細胞(ES cells)，可在活體中分化成所有細胞系，而且，當被引進試管中時，可分化成大部分細胞類型。ES細胞衍生自早期哺乳動物胚胎。由于其全能性，咸信其在治療退化性或遺傳疾病上具有大的潛力。不過，在倫理及供給方面的考量阻礙人類ES細胞在研究及治療上的使用。非胚胎來源的全能性或多能性干細胞(例如來自成年或年輕動物的組織)將可回避此阻礙。雖然一些干細胞已從這些非胚胎來源得到，這些細胞中的一些具有有限的發(fā)育潛能。又，在供給方面，這些細胞難以獲得且這些細胞的量太有限以致不符有意義的臨床或研究用途需要。再者，這些細胞的一些在活體中會發(fā)育成畸胎瘤，所以不適合活體使用。因此需要較安全、容易獲得且具有豐富來源的非胚胎全能性或多能性干細胞。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分是基于非可預期地發(fā)現(xiàn)從非胚胎來源制備的干細胞群為全能性或多能性，可以極高產(chǎn)率得到，且在活體中不會發(fā)育成畸胎瘤。所以，本發(fā)明的一方面的特征為制造多能性或全能性干細胞群的方法。該方法包括取得復數(shù)個胚葉細胞-類似性干細胞(BLSCs，blastomere-like stem cells)，在含有維生素A酸(RA，retinoic acid)或轉形生長因子 β (TGF- β , transforming growth factor beta)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)BLSCs，以及鑒定及富化經(jīng)培養(yǎng)細胞中的多能性或全能性細胞。該等多能性或全能性細胞表現(xiàn)GADPH或β -肌動蛋白的mRNA。換而言之，GADPH或β -肌動蛋白的mRNA的量是以下節(jié)實施例所述的方式通過RT-PCR測定法檢測。該多能性或全能性干細胞在尺寸上通常為1至15微米，較佳在尺寸上為1至10 微米，且更佳在尺寸上為1至5微米。這些尺寸為在懸浮液中或附接的細胞的尺寸(亦即， 懸浮的細胞或附接的細胞)。該術語“干細胞”是指能分化成許多最終、經(jīng)分化細胞類型的細胞。干細胞可為全能性或多能性。全能性干細胞典型地具有發(fā)育成任何細胞類型的能力。全能性干細胞在來源上可為胚胎及非胚胎二者。多能性細胞典型地為能分化成數(shù)種不同的最終分化細胞類型的細胞。單能干細胞只能產(chǎn)生一種細胞類型，但具有自我更新的性質(zhì)而使其能與非干細胞區(qū)分。這些干細胞源自各種組織或器官系統(tǒng)，其包括，但非限于，血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸道、骨骼、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺等。根據(jù)本發(fā)明，干細胞衍生自成人或新生兒組織或器官。 BLSC(將于下文中詳述)為在成年或年輕動物中的一群非胚胎干細胞。這些細胞為全能性且具有與胚胎干細胞相似的分化能力。參見W02007/100845。將通過在含RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)BLSCs所得到的細胞中命名為SBR。在一具體實施例中，該培養(yǎng)基含有0.1至20μΜ RA且可培養(yǎng)該BLSCs共計2至8星期。在另一具體實施例中，該培養(yǎng)基含有1至15μΜ RA且培養(yǎng)該等BLSCs 2至8星期。在又一具體實施例中， 該培養(yǎng)基含有5至12 μ M RA且培養(yǎng)該等BLSCs 3至4星期。如此制備的多能性或全能性 SBR細胞在尺寸上為1至15微米(諸如1至10、1至5、2至5、或3至5微米)且在懸浮液中可形成片狀結構。將通過在含有TGF- β的培養(yǎng)基中培養(yǎng)BLSCs所得到的細胞命名為SBT。在一具體實施例中，該培養(yǎng)基含有1至40nM TGF-β且培養(yǎng)該等BLSCs 2至8星期。在另一具體實施例中，該培養(yǎng)基含有2至20nM TGF-β且培養(yǎng)該等BLSCs 2至8星期。在又一具體實施例中，該培養(yǎng)基含有5至12nM TGF-β且培養(yǎng)該等BLSCs 4至6星期。該等多能性或全能性SBT細胞在尺寸上為1至15微米(諸如1至10、1至5、2至5、或3至5微米)、具有圓形形狀且可形成凝聚物。本發(fā)明的另一方面的特征為組合物，其含有復數(shù)個上文提及的經(jīng)培養(yǎng)細胞，其(1) 為多能性或全能性，(2)在尺寸上為1至15微米，(3)且表現(xiàn)GADPH或β-肌動蛋白的mRNA。 該細胞可通過上述方法制備。該組合物可進一步含有RA或TGF-β。在一具體實施例中， 該等細胞為⑶10+、⑶90+、⑶105+及CXCR4+。在另一具體實施例中，該等細胞為臺盼藍染色陰性。亦即這些細胞展現(xiàn)臺盼藍排除。在再一具體實施例中，該等經(jīng)培養(yǎng)的細胞含有為 ⑶66e+的第一群細胞以及為⑶66e_的第二群細胞。該等細胞實質(zhì)上為純。術語“實質(zhì)上為純”，當用于描述干細胞或衍生自干細胞的細胞(例如經(jīng)分化的細胞)時，意指特定細胞構成制劑中的大部分細胞(亦即，超過20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )。一般而言，經(jīng)實質(zhì)純化的細胞群構成制劑中的至少約70%的細胞，通常制劑中的約80%的細胞，尤其是制劑中至少約90%的細胞 (例如95^^97^^99%或100% )。如此，本發(fā)明的方法提供下述優(yōu)點在未被其他細胞類型污染下可得到實質(zhì)純的特定類型細胞群(例如SBR或SBT細胞)。上述經(jīng)培養(yǎng)細胞可用于表現(xiàn)外源性重組多肽。因此，這些經(jīng)培養(yǎng)的細胞在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其各包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽且該細胞可含有編碼多肽的mRNA。上述經(jīng)培養(yǎng)的細胞可以遺傳方法處理以致其不會表現(xiàn)β 2-微球蛋白基因或不會表現(xiàn)一種或以上由第I類主要組織相容性復合體(MHC，major histocompatibility complex)基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)會激發(fā)T淋巴球所媒介的抗細胞反應。既然這些細胞不會導致移植片的宿主排斥，因此可作為全適型供給細胞。一方面，本發(fā)明的特征為治療患者退化性疾病的方法。該方法包括將有效量的上述組合物投予至需要該治療的患者，該組合物含有一種或以上的上述多能性或全能性細胞。在一具體實施例中，這些細胞的至少一個包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽且該細胞可含有編碼多肽的mRNA。退化性疾病的例子包括糖尿病、神經(jīng)變性疾病、關節(jié)炎及癌癥。神經(jīng)變性疾病的例子包括帕金森氏癥。另一方面，本發(fā)明的特征為治療患者自體免疫性疾病的方法。該方法包括將有效量的上述組合物投予至需要該治療的患者。待治療上述失調(diào)之一的患者可由針對特定失調(diào)的標準診斷技術鑒定?！爸委煛笔侵笇⒔M合物(例如細胞組合物)投予至罹患該失調(diào)或有發(fā)展成該失調(diào)的危險的患者，其目的為對于該失調(diào)、該失調(diào)的癥狀、繼發(fā)于該失調(diào)的疾病狀態(tài)或傾向損傷/失調(diào)的體質(zhì)加以治愈、減輕、解除、治療，延遲其發(fā)生，預防或緩解?！坝行Я俊笔侵改茉诒恢委熁颊咧挟a(chǎn)生醫(yī)療上期望結果的組合物的量。該治療方法可單獨進行或與其他藥物或療法并行。又一方面，本發(fā)明的特征為鑒定用于治療退化性疾病的候選藥。該方法包括使受試化合物與上述組合物或細胞接觸以及測定在退化性疾病中被下調(diào)的多肽的表現(xiàn)量的步驟。于存在受試化合物下的表現(xiàn)量若高于未存在受試化合物下的表現(xiàn)量，則表示該化合物為治療該疾病的候選者。退化性疾病的例子包括糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、關節(jié)炎、癌癥或自體免疫性疾病。表現(xiàn)量可由mRNA量及蛋白質(zhì)量的任何一個測定。再一方面，本發(fā)明的特征為在患者中引進異源性核酸的方法。該方法包括下述步驟取得上述組合物或細胞，其中這些細胞的至少一個包括異源性核酸；以及將該細胞投予至需要該異源性核酸的患者。該異源性核酸可編碼多肽。該細胞一旦被投予，將在患者中表現(xiàn)多肽。術語“異源性”為一相對用語，當其用于描述核酸的部分時表示該核酸包含二個或以上亞序列，這些亞序列在天然中未發(fā)現(xiàn)彼此有相同關系。舉例言之，經(jīng)由重組產(chǎn)生的核酸典型地具有二個或以上來自不相關基因的序列，這些序列以合成方法被排列成具有新功能的核酸，例如啟動子來自一來源以及編碼區(qū)來自另一來源。該二核酸因此在其背景上彼此為異源性。該重組核酸，當加入細胞中時，該重組核酸相對于細胞的內(nèi)源性基因為異源性。因此，在染色體中，異源核酸引進被整合入染色體的非原生性(非天然產(chǎn))核酸，或非原生性(非天然產(chǎn))染色體外核酸。相對照地，在本專利申請案的內(nèi)容中，染色體的天然位置改變片，當其包含原生的內(nèi)源性核酸序列時，對于突變細胞而言不被認為系屬異源。相似地，異源蛋白質(zhì)表示該蛋白質(zhì)包含二個或以上在天然中未被發(fā)現(xiàn)彼此有相同關系的亞序列 (例如，“融合蛋白質(zhì)”，其中二亞序列由單一核酸序列編碼)。該蛋白質(zhì)可通過重組技術產(chǎn)生。術語“重組(recombinant)”當被提及時，如于一細胞、或核酸、蛋白質(zhì)、或載體， 是指該細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過引入一異源性核酸或蛋白或一經(jīng)改變的天然核酸或蛋白而修飾者，或指該細胞是源自于一細胞經(jīng)該等修飾者。因此，例如，重組細胞表現(xiàn)的基因，其無法于該原生性(天然產(chǎn))細胞中被發(fā)現(xiàn)的，或表現(xiàn)一第二套的原生性基因，該基因可正?；虍惓５谋磉_、不足量的表達或完全不表達。于本發(fā)明的范疇內(nèi)包括一細胞銀行(cell bank)或庫(library)，其具復數(shù)個前述組合物，每一組成包含一多能性或全能性的培養(yǎng)細胞群。該細胞可為人類細胞或非人類細胞。該銀行可通過；從復數(shù)個患者收獲細胞以分別得到復數(shù)個胚葉細胞_類似性干細胞群；鑒定該等細胞群，對于各細胞群得到至少一種預定的特征；以及按照該至少一種預定的特征將該等細胞群分類以制備。于制備該庫時，可進一步擴增細胞群。該特征的例子包含一患者的姓名、性別、身體狀況(包含遺傳疾病及MHC資訊)。一患者是指一人類或非人類的動物。非人類的動物的例子包含所有脊椎動物，如 哺乳動物，像是非人類的靈長類(特別是指高等靈長類)、狗、嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、 天竺鼠、貓、農(nóng)場動物(如馬、牛、羊、或豬)、以及非哺乳類動物，像是鳥類、兩棲動物、爬蟲類等。于一較佳具體實施例中，該患者為一人類。于另一具體實施例中，該患者為一試驗動物或適用于一疾病模式的動物。本發(fā)明之一或多個具體實施例的細節(jié)闡述于后文中。本發(fā)明的其他特征、目的、以及優(yōu)點可通過說明書、圖式及申請專利范圍得以清晰明了。
圖IA至圖IC顯示經(jīng)溶血(hemolysis)以取得胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs) 的流式細胞分析直方圖(flow cytometry histograms)的結果；圖2A至圖2C顯示自血漿區(qū)段(plasma fractions)中取得胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)流式細胞分析直方圖的結果；圖3A至圖3C圖為一照片，其顯示培養(yǎng)的胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)形成多層、網(wǎng)孔狀(mesh net)結構；圖4為一照片，其顯示培養(yǎng)的胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)形成凝聚物；圖5為一照片，其顯示培養(yǎng)的胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)形成球狀細胞凝聚物；圖6至圖8為顯示從含有維生素A酸(retinoic acid)的胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)培養(yǎng)中制備出SBR細胞的照片；圖9至圖12為顯示從含有轉形生長因子β (TGF-β)的胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)培養(yǎng)中制備出SBT細胞的照片；以及圖13為RT-PCR結果的照片，顯示GADPH或β -肌動蛋白于SBR及SBT細胞的表現(xiàn)情形，以及不表現(xiàn)于BLSC中。
具體實施例方式一般認為，ES細胞可用于再生各種不同的細胞類型(諸如腦中的神經(jīng)元的或神經(jīng)膠質(zhì)細胞)并從而治療各種不同的退化性疾病或組織損傷。然而，在倫理及供給方面的考量已阻礙ES細胞的用途。而非胚胎來源的干細胞，諸如分娩后的干細胞(如骨髓衍生的間葉干細胞(MSCs，mesenchymal stem cells))，為另一具前景的替代方案。雖然如此，由于供給方面的考量以及增生/分化能力的限制，該替代方法并不總是被接受。本發(fā)明關于從非胚胎來源中制各的干細胞群、SBR細胞、或SBT細胞。就如同ES 細胞一般，該些細胞亦為全能性或多能性。更重要者，該等細胞可以極高產(chǎn)率得到，且在活體中(in vivo)不會發(fā)育成畸胎瘤。該等細胞因而可被用于再生分化出具功能的細胞，以治療各種不同退化性疾病或組織損傷。如下節(jié)實施例所示，SBR及SBT細胞可于活體外(in vitro)被輕易的制造、維持及增殖，以及使用常規(guī)技術方法以誘導其分化。此外，將該細胞移植入一動物患者(如一老鼠)后，并無有絲分裂活化的細胞、畸胎瘤、或惡性生長等現(xiàn)象?；谶@些優(yōu)點，相對于其他干細胞，該等細胞呈現(xiàn)另一可供選擇的方案。于本發(fā)明的一較佳具體實施例，該些SBR及SBT細胞是從胚葉細胞-類似性干細胞群(BLSCs)中所制備者。BLSCs為在成年或年輕動物中的一群非胚胎干細胞。這些細胞為全能性且具有與胚胎干細胞相似的分化能力。參見W02007/100845。BLSCs包含正常的整套染色體，且BLSCs為細胞譜系未定(lineage-uncommitted)，且可形成身體的所有體 (非生殖)細胞。該等細胞亦可形成生殖配子精子及/或卵子，以及細胞，以及胚胎組織以及胎盤的胎兒部分。該細胞易對于譜系誘導劑、增生劑及分化抑制劑產(chǎn)生反應。另一方面，該等細胞對于發(fā)展劑(progression agents)較無反應。相似于外胚層_類似性干細胞 (epiblast-like stem cells)，BLSCs于細胞培養(yǎng)至長滿時并無接觸抑制作用，但當其于一合乎需要的營養(yǎng)供給時，則會形成多層長滿的細胞層。BLSCs沒有表現(xiàn)代表前驅或分化細胞、胚層譜系干細胞、或外胚層-類似性干細胞的表型表現(xiàn)標記。相反地，BLSCs表現(xiàn)一般及特定的胚胎性譜系標記，例如胚胎性干細胞標記CD66e、HCEA、CEA,以及CEA-CAM-I。 BLSCs于成熟組織中常為靜態(tài)。然而，當上述組織受到傷害，BLSCs便會活化及分化以修復該受損的組織。相較于其他干細胞，BLSCs可從一分娩后的組織中取得相當高的產(chǎn)率。例如，BLSCs 可從血液中被取得，其產(chǎn)率超過2x108/每毫升血液。另一方面，由于BLSCs為靜態(tài)且不會表現(xiàn)基因，故該等細胞于研究及治療目的的用途亦受侷限。出乎預期的，以某種化學物質(zhì)培養(yǎng)BLSCs可產(chǎn)生全能性或多能性干細胞，其可表現(xiàn)內(nèi)生性基因及異源性基因。該兩種全能性或多能性干細胞群為SBR細胞群及SBT細胞群。 將BLSCs分別培養(yǎng)于含RA及TGF- β的培養(yǎng)基，以取得SBR細胞群及SBT細胞群。BLSCs可通過下節(jié)實施例所述的方法、或于W02007/100845所述的方法以制備。 一般而言，該細胞可自成年或年輕動物的多種組織中分離出，包含血液、骨髓及骨骼肌。為了確認所分離的細胞確實為BLSCs，可供檢驗的一些特征，包含(1)于懸浮液中的細胞尺寸少于1微米；(2)細胞表面標記，如CD66e+ ；以及(3)臺盼藍染色呈陽性。細胞表面標記的抗體，如⑶66e可被使用。其可以適用標記結合，如螢光異硫氰酸鹽(FITC，fluorescein isothiocyanate)、藻紅蛋白(PE, phycoerythrin)、或量子,點(quantum dots)。 BLSC，其為 ⑶66e+，可進一步以流式細胞儀富化(圖1至圖2)。該富化后細胞群接著以標準技術測試。為了確認該等細胞的分化潛力，該等細胞可通過現(xiàn)有技術的方法被誘導以形成，例如神經(jīng)元_神經(jīng)膠質(zhì)細胞、骨細胞、以及脂肪細胞。例如該等細胞可被繼代及培養(yǎng)至長滿(confluence)，移轉至一骨生成培養(yǎng)基或一脂肪生成培養(yǎng)基，并培養(yǎng)一段適當時間(如三周)。骨生成分化能力可通過鈣累積的礦化作用以評估，該礦化作用可通過von Kossa染色法觀察。通過油紅0將細胞內(nèi)油滴染色，并于顯微鏡下觀察以檢測脂肪生成分化情形。對于神經(jīng)分化方面，該等細胞可于一神經(jīng)生成培養(yǎng)基中培養(yǎng)一適當時間(如七天)，接著將其以缺乏血清(serum depletion)進行處理，并以β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)進行培養(yǎng)。經(jīng)分化后，該等細胞呈現(xiàn)具延伸的似軸突結構的折光細胞體形態(tài)(refractile cell body)以構成一網(wǎng)絡。以譜系特異性標記進行免疫細胞化學染色，即可進一步導引確認神經(jīng)的分化情形。該等標記的例子包含神經(jīng)元特異性第三類β-微管蛋白(Tuj-I)、神經(jīng)絲狀結構蛋白(neurofilament)、以及GFAP。另外，可通過BLSC不具接觸抑制作用的特點，以確認該等分離細胞的身份。為此， 可將該分離細胞培養(yǎng)至長滿。于此條件下，BLSCs可形成球形的細胞凝聚物、細胞均布的多層結構(multiple confluent layers)、或網(wǎng)孔(mesh-net)結構。相反的，CD42+細胞無法形成前述結構，如細胞凝聚物。經(jīng)該等確認后的BLSCs可進一步于一非分化性的培養(yǎng)基中以超過10、20、50、或 100代以上的細胞倍增率(population doubling)培養(yǎng)增殖，且其中無自發(fā)性分化、老化、 形態(tài)變化、生長速度增加、或改變?yōu)榫吣芰Ψ只癁樯窠?jīng)元的跡象。該等細胞可于使用前以標準方法保存。為了制備SBR細胞，可將該BLSCs于含有0. 1至20 μ M RA的環(huán)境中培養(yǎng)2至8周。 于一較佳具體實施例中，該BLSCs于含有1至15 μ M RA的環(huán)境中培養(yǎng)2至8周，或更佳者為，于含有5至12 μ M RA的環(huán)境中培養(yǎng)3至4周。由此制備的多能性或全能性細胞群的尺寸為1至15微米，且可于懸浮液中形成片狀結構。任何市售可得的適用于細胞培養(yǎng)的RA 皆可被使用。為了制備SBT細胞，可將該BLSCs于含有1至40nM TGF-β的環(huán)境中培養(yǎng)2至8 周。于一較佳具體實施例中，該BLSCs于含有2至20nM TGF-β的環(huán)境中培養(yǎng)2至8周，或更佳者為，于含有5至12nM TGF-β的環(huán)境中培養(yǎng)4至6周。該多能性或全能性細胞群的尺寸為1至15微米，具一圓形的形狀，且可形成凝聚物。雖然任何類型的TGF-β皆可使用， 高純度的TGF-β仍為優(yōu)選。TGF-β的例子包含哺乳動物的TGF-β (如人類TGF-β)、或與哺乳動物的TGF-β具實質(zhì)上相同生物活性的TGF-β。天然產(chǎn)的TGF-β及基因工程改造的TGF-β皆可被使用。通過DNA重組技術所取得的TGF-β可能與天然產(chǎn)的TGF-β具有相同的胺基酸序列、或一與其功能等同者。一“功能等同者”是指一天然產(chǎn)的TGF-β的多肽衍生物，如一蛋白具有一或多個點突變、插入、刪除、截斷(truncation)、融合蛋白、或其組合。術語“ TGF-β”亦涵蓋化學修飾后的TGF-β?；瘜W修飾后的TGF-β的例子包含結構改變的TGF-β、增加或刪除其糖鏈、以及被一化合物，如聚乙二醇(polyethylene glycol), 所結合的TGF-β。該SBR細胞及SBT細胞可基于其尺寸、接觸抑制作用、臺盼藍染色排斥(如臺盼藍染色陰性)以與BLSCs區(qū)別及確認。BLSCs較SBR細胞及SBT細胞小(小于1微米)，且缺乏接觸抑制作用、或為盼藍染色排斥。該SBR細胞及SBT細胞亦可根據(jù)相關的細胞標記， 如⑶10+、⑶90+、以及CXCR4+以流式細胞分析，或其他標準分析方法，如RT-PCR，以確認。如此制備的SBR細胞及SBT細胞可進一步與前述測試BLSCs的相同方式、或其他現(xiàn)有技術的標準技術，以測試其全能性及多能性。于適當?shù)恼T導條件下，該等細胞可于活體外分化為，如脂肪細胞、軟骨細胞、以及骨生成譜系的細胞群。此外，于前述誘導條件下，該等細胞具有能力去分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞。全能性及多能性可于活體測試。例如，當腦部缺血的大鼠接受大腦內(nèi)SBR細胞或SBT細胞的腦內(nèi)移植后，相較于以安慰劑(vehicle)處理的對照組大鼠，其神經(jīng)功能明顯被改善。此結果指出，于腦內(nèi)投予的SBR細胞或SBT細胞可進入腦部、存活、遷移、以及改善中風后的功能恢復率。事實上，該些移植細胞于缺血性腦部中可分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞 (GFAP+)、神經(jīng)元(Nestin+、MAP-2+、以及Neu-N+)、以及血管內(nèi)皮細胞(vWF+)，以增強神經(jīng)可塑性(neuroplastic)的效用。大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元活性可通過氫質(zhì)子磁振頻譜(1H-MRS, Proton MR spectroscopy)評估，相較于對照組，于移植組的大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元活性亦較大幅地增加。此外，于移植組的缺血性大腦半球中亦可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)滋養(yǎng)因子(neurotrophic factor)的調(diào)控表現(xiàn)顯著性地增加。經(jīng)此確認后的SBR細胞及SBT細胞可進一步于一非分化性培養(yǎng)基中以10、20、50、 或100代以上的細胞倍增率(population doubling)培養(yǎng)繁殖，且其中無自發(fā)性分化、老化、形態(tài)變化、生長速度增加、或改變?yōu)榫吣芰Ψ只癁樯窠?jīng)元的跡象。該等細胞可于使用前以標準方法保存。術語“增生”及“擴增”于此可交替用于與細胞相關，是指通過分裂以使同種類的細胞數(shù)增加。術語“分化”是指于細胞發(fā)育過程中為一特定功能轉變特化，例如，細胞獲得一或多個與初始細胞類型不同的形態(tài)特征及/或功能。術語“分化”包含譜系決定(lineagecommitment)及終末分化過禾呈(terminal differentiation processes)。分化是可被評估的，例如通過使用免疫組織化學法或本領域的技術人員所知的其他步驟，以監(jiān)測譜系標記的出現(xiàn)與否。自先驅細胞衍生的后代分化細胞可能，但非必然，與該干細胞來源組織為相同胚層或組織。例如，神經(jīng)先驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血的細胞譜系。術語“譜系決定”及“特化”于此交替使用，是指一干細胞發(fā)展為一前驅細胞的過程，該前驅細胞決定所形成特定限制范圍的細胞分化類型。已定向的前驅細胞通常具有自我更新或細胞分裂的能力。術語“終末分化”是指一細胞最終分化為一成熟、完全分化的細胞。例如，神經(jīng)前驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血細胞譜系，其終末分化為一屬于特定細胞類型的成熟血球。通常，終末分化與中斷細胞周期及停止增生有關。術語“前驅細胞(progenitor cell)，， 于此提及，是指一細胞已決定成為一特定細胞譜系，且其通過一連串細胞分裂以發(fā)展成該譜系的細胞群。一前驅細胞的例子可為一肌母細胞，其僅可分化為單一類型的細胞，但其本身并不完全成熟或完全分化。1. 一般的用途本發(fā)明的SBR細胞及SBT細胞可應用于許多層面?？捎糜谥委熗嘶曰蜻z傳性疾病且能免除操作人類胚胎的道德考量?；诖四康?，可自病患(如缺乏組織或器官正常發(fā)育所需重要的功能性基因)體內(nèi)分離BLSCs。自BLSC中生產(chǎn)出SBR細胞和SBT細胞之后，可將一能夠編碼一功能性基因的核酸載體轉入細胞內(nèi)。該載體可通過許多方式轉入細胞內(nèi)，包含磷酸鈣共沈淀法、DEAE葡聚糖媒介轉染法、脂小體轉染法、電穿孔法、顯微注射法、或病毒媒介的技術。以不影響該細胞多能性的方法為較佳。該等技術的詳述可見于美國專利號7，422，736及5，591，625，及美國專利申請?zhí)?0020127715。于將功能性基因遞送入細胞內(nèi)后，隨后以現(xiàn)有技術的方法將該等細胞移植至該病患體內(nèi)。由于該細胞生產(chǎn)自該病人，因此，此治療方法并不會引起免疫排斥現(xiàn)象。另外，可利用來自一健康個體所制備的SBR細胞和SBT細胞制造通用捐贈者細胞。 用以制備通用捐贈者細胞的方法為現(xiàn)有技術，該等制備通用SBR細胞及SBT細胞的方法將于下詳述。于適當?shù)臈l件下，該等移植的SBR細胞及SBT細胞可發(fā)育成一功能性組織或器官。 為促進其發(fā)育，可投予該病患誘導細胞發(fā)育的因子。該等因子可為小分子化合物、勝肽、及核酸。其例包含，但不限于，轉型生長因子β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及神經(jīng)生長因子。該等SBR細胞及SBT細胞對于譜系發(fā)育及分化的發(fā)育或分化機制的研究亦具其助益。使用該等細胞為一模式系統(tǒng)以鑒定誘導全能性多能性干細胞成為一特定組織或器官的條件。此外，可使用已知的差異性cDNA基因篩檢方法以分離于發(fā)育過程中有參與的基因。 參閱，如Shen Μ. et al.，Development，124 :429_42，1997?？衫迷摰燃毎?，其已被誘導發(fā)育為一特定譜系，如前述的神經(jīng)膠質(zhì)細胞系，以制備一 cDNA庫。此庫可用于分離及研究具差異性表現(xiàn)的基因。該等分離的基因可進一步用于研究其于各自階段的角色。相關的技術皆為現(xiàn)有技術。參閱，如美國專利號7，422，736及美國專利申請?zhí)?0060035373。該等 SBR細胞及SBT細胞亦可使用已知方法用于發(fā)欲為一器官或復制動物。參閱，如Campbell K. et al. ,Nature, 380 =64-66,1996。因此，該等細胞對于寵物及畜牧產(chǎn)業(yè)極具價值，且可用于保存瀕臨絕種的動物。2.篩檢方法前述的干細胞可被應用于篩檢試驗中，可鑒定以特定方法影響一特定細胞類型的藥物，亦即該藥物即可用于治療與該細胞類型相關的疾病。因此，本發(fā)明一方面是關于一鑒定一制劑的方法，可通過將測試試劑與細胞進行接觸，以找出可改變未分化SBR細胞及SBT細胞的功能的試劑。相較于未存在該測試制劑時的功能；若于存在該測試試劑時，該等細胞的功能或基因表現(xiàn)改變時，則該測試制劑為可改變該等細胞的功能或基因表現(xiàn)的試劑。術語“測試制劑”是指被用于檢測其具有改變細胞功能或基因表現(xiàn)能力的任何分子。雖然該方法做為一篩檢方方法，一般被用以鑒定出一先前未知但具有一預期活性的分子，然而，本發(fā)明的篩檢方法亦可用于確認某已知擁有特定活性的制劑。該功能可為基因的表現(xiàn)，其一般是指于細胞中表現(xiàn)(或不表現(xiàn))，以及該制劑可通過增加或減少一表現(xiàn)基因(如降低⑶66e的表現(xiàn)量)的表現(xiàn)量、或通過開啟一未表現(xiàn)基因 (如誘導特定譜系的抗原的表現(xiàn))于細胞中的表現(xiàn)，以改變該功能。于一具體實施例中，此能影響細胞功能的制劑為一能誘導細胞分化且產(chǎn)生出已分化細胞的制劑。這些已分化的細胞可為多能性人類干細胞(如造血干細胞)、或可為最終分化的細胞(如肌肉細胞、神經(jīng)細胞、血球細胞、結締組織、或上皮細胞)。此方法就其本身而言，可用于鑒定一制劑，其可誘導分化SBR細胞及SBT細胞成為最終分化的細胞，如 胰島β細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞或任何其他細胞類型。該此法所鑒定的制劑或化合物可被用于治療退化性疾病、癌癥或是免疫疾病。該表現(xiàn)量可通過mRNA表現(xiàn)量或是蛋白質(zhì)表現(xiàn)量來決定。量測一樣本的mRNA表現(xiàn)量的方法為現(xiàn)有技術。為量測mRNA表現(xiàn)量，細胞可被溶解，且存在于細胞溶解物中的mRNA 量，無論純化與否，皆可通過，如雜交試驗(使用可探測的標定特定基因的DNA或RNA探針)，以及量化或半量化RT-PCR(使用適合的特定基因引子對)量測。另外，量化或半量化的原位雜交試驗可用于組織切片、或未溶解的細胞懸浮液，可使用一可探測(如螢光或酵素)標定DNA或RNA探針。其他mRNA定量方法包含該RNA保護試驗(RPA)方法，以及基因表現(xiàn)序列分析方法(SAGE)，以及以陣列為基礎的技術。量測一樣本中蛋白質(zhì)表現(xiàn)量的方法為現(xiàn)有技術。其中部分使用抗體(如單株抗體或多株抗體)，其可特異性地結合至一目標蛋白。于這些試驗中，該抗體本身或結合其的第二抗體皆被標記為可供探測者。另外，該抗體可以與生物素結合。其存在能通過可探測標定的卵白素(一勝肽結合于生物素)以量測。這些方法的搭配組合(包含“多層夾心結構” 試驗)可用于增強該方法的靈敏度。一些蛋白質(zhì)量測試驗(如ELISA或西方墨點法)可被應用于體液或細胞溶解物、或其他(如免疫組織方法或螢光流式細胞儀)可應用于組織切片或是未溶解的細胞懸浮液的方法。適當?shù)臉硕òǚ派湫院朔N(如嚴5碘、131碘J5硫、3 氚或％磷)、酵素(如鹼性磷酸酶、辣根過氧化氫酶、冷光酵素、或β -半乳糖苷酶)、螢光 /冷光劑(如螢光素、鹽基桃紅精、藻紅素、GFP、BFP、以及由Quantum Dot Corporation, Palo Alto，CA所供應的Qdot 奈米粒子)。其他可應用的方法包含定量免疫沈淀分析、或補體結合試驗。一測試制劑可以是任何類型的分子，例如，一聚核苷酸、一勝肽、一擬勝肽、擬肽可為乙烯化的擬肽(vinylogous ρ印toids)、一小型有機分子或其相似物，且可通過各種方式以改變SBR細胞及SBT細胞的功能。例如，該測試制劑可通過在細胞外結合至一表現(xiàn)于細胞表面的受器，由此改變一功能，該功能由一通常結合并作用于該受器的配體所媒介。另外， 該測試制劑可被動地或由主動運輸機制以穿過細胞膜，并作用于細胞內(nèi)而改變一功能。勝肽測試制劑可為任何胺基酸或胺基酸類似物的聚合物，且其可為三至四個殘基，至幾百或幾千個殘基的不同變化。勝肽測試制劑可通過化學合成、或使用蛋白質(zhì)純化、 續(xù)以蛋白水解作用的方法制備，若有需求，可進一步利用層析法或電泳法進一步純化，或可通過編碼多核苷酸以表現(xiàn)。一勝肽測試制劑可為一已知勝肽，如一天然產(chǎn)的勝肽，但亦可與該天然產(chǎn)的序列不同，例如包含一個或多個胺基酸類似物。一多核苷酸制劑可為二個或多個去氧核糖核酸或核糖核酸的序列，其通過一磷酸雙酯鍵以互相連結?？蔀镽NA或DNA，其可為一基因或其蛋白，一 cDNA、一 RNAi試劑、一合成的多去氧核糖核酸序列、或其相似物，及其亦可為單股或雙股，亦可為一 DNA/RNA雜合體?？蔀橐蛔约毎蟹蛛x的天然產(chǎn)的核酸分子，亦可為一合成分子，其通過如化學合成法或酵素法(如聚合酶鏈鎖反應(PCR，polymerase chain reaction))以制得。于多種具體實施例中，本發(fā)明的多核苷酸可包含核苷或核苷酸類似物，或一非磷酸雙酯鍵的骨架鍵結。這些核苷酸類似物為現(xiàn)有技術且市售可得，而包含此類核苷酸類似物的多核苷酸亦同 (Lin et al. ,Nucl. Acids Res. 22 :5220_5234，1994 Jellinek et al. ,Biochemistry 34: 11363-11372，1995 ；Pagratis et al.，Nature Biotechnol. 15 :68_73，1997)。一多核苷酸測試制劑可與SBR細胞及SBT細胞接觸、或通過文中所述的方法或現(xiàn)有技術，將之轉入SBR細胞及SBT細胞。一般而言，而非必然，該多核苷酸被轉入細胞內(nèi)時， 其可直接影響其功能，或影響其轉錄或轉譯、或兩者的功能。例如，該多核苷酸可編碼一勝肽測試制劑，其可于細胞內(nèi)表現(xiàn)，并影響該細胞的功能。一多核苷酸劑亦可為，或編碼出， 一反股分子、一核糖酵素、或一三股合成試劑，其可被設計來標靶一或多個特定目標核酸分子。欲篩選的候選制劑或化合物(如蛋白、勝肽、擬勝肽、擬肽、抗體、小分子、或其他藥物)可通過本技術已知的組合庫法中的多種途徑的任一種得到。這些庫包含勝肽庫、擬肽庫(具有勝肽功能，但具有可抵抗酵素降解的新穎、非勝肽骨架的分子的庫)； $fS]^#tit5F^if @(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；通過解旋法或親和性層析法篩選獲得的合成分子庫；以及該“單一珠粒單一化合物”分子庫。參閱，如Zuckermann et al. 1994，J. Med. Chem. 37 2678-2685 ；及 Lam，1997，Anticancer Drug Des. 12 :145。分子庫的合成方法范例可見于， 例如=Deffitt et al.，1993，PNAS USA 90 6909 ；Erb et al.，1994，PNAS USA 91 11422 ； Zuckermann et al. ,1994, J. Med. Chem. 37 2678 ；Cho et al. ,1993, Science 261 1303 ； Carrell et al. , 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 2059 ；Care 11 et al. , 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 :2061 ；以及 Gallop et al.，1994 J. Med. Chem. 37 :1233。分子庫的化合物可呈現(xiàn)于液體中(如:Houghten, 1992，Biotechniques 13 :412_421)，或珠粒上 (Lam, 1991，Nature 354 :82_84)、晶片(Fodor, 1993，Nature 364 :555_556)、細菌(美國專利號 5，223，409)、孢子(美國專利號 5，223，409)、質(zhì)體(Cull et al.，1992，PNAS USA 89 :1865-1869)、或噬菌體(Scott 及 Smith 1990，Science 249 386-390 ；Devlin, 1990,Science 249 :404-406 ；Cwirla et al.，1990，PNAS USA 87 :6378-6382 ；Felici 1991， J. Mol. Biol. 222 :301-310 ；以及美國專利號 5，223，409)。3.退化性疾病的治療于本發(fā)明范疇內(nèi)，為一治療退化性疾病、舒緩該疾病癥狀、或延緩該疾病于一患者中發(fā)作的方法?？赏ㄟ^標準技術診斷患者情況或疾病以鑒定出需治療者。該治療方法需投予一亟需其治療的患者一有效量的前述SBR細胞或SBT細胞。一退化性疾病是指一疾病，其中感染組織或器官的功能或結構隨著時間逐漸惡化，無論歸因于遺傳缺陷、受傷、缺乏適當細胞分化(如于細胞增生的疾病)、身體上正常磨損、或生活方式的選擇。退化性疾病的例子包含神經(jīng)性退化疾病(如阿滋海默癥、帕金森氏病、亨丁頓舞蹈癥、多發(fā)性硬化癥、以及肌萎縮性側索硬化癥(ALS，amyotrophic lateral sclerosis))、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包含橫貫性脊髓炎、腦部或脊髓神經(jīng)創(chuàng)傷后產(chǎn)生的神經(jīng)脫鞘、急性腦部受損、頭部創(chuàng)傷、脊髓受損、周邊神經(jīng)受損、缺血性腦部受損、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳性髓磷脂失調(diào)、癲癇、周產(chǎn)期窒息、窒息、缺氧癥、癲癇重積狀態(tài)、Shy-Drager氏癥、自閉癥及中風)、癌癥或相關癌癥療法產(chǎn)生的情況(如化學療法)；代謝疾病(如糖尿病、尼曼匹克癥)；自體免疫或發(fā)炎相關疾病(如紅斑、發(fā)炎性腸道疾病(IBD，!inflammatory bowel disease)、前列腺炎、骨關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、糖尿病、及氣喘)、眼疾(如青光眼、色素性視網(wǎng)膜炎、諾里氏癥、及黃斑部病變)；心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病 (如動脈粥狀硬化、心臟衰竭、心肌梗塞、及心血管疾病)；血液疾病，如=Wiscott Aldrich 氏癥候群；肌肉萎縮癥；腸胃疾病；腎臟疾病；肝臟疾病；肺臟疾病、腎臟疾病(如愛迪生氏癥)、燒燙傷或中風造成的損傷所導致的情況，包含受損組織(如肌肉損傷、老化受損細胞及老化受損組織)、和老化相關的情況(如落發(fā)、雄性禿及圓形禿)、病毒情況(如C型肝炎病毒感染、及后天性免疫缺乏癥候群)、以及其他可通過器官移植或干細胞修復、重生或改善其癥狀及/或與該疾病相關的癥狀。本發(fā)明的方法可被用以治療勃起障礙、及整形外科、或女性的乳房植入。4.治療帕金森氏癥和其他神經(jīng)退化性疾病于本發(fā)明的范疇內(nèi)，為一治療腦部或中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織受損或減輕一患者體內(nèi)疾病癥狀的方法。此方法包括鑒定出遭受或存在發(fā)展為腦部組織受損的潛在風險的患者。此患者可為人類、或非人類的哺乳類動物，如貓、狗、或馬。腦部組織受損的例子包含由大腦局部缺血(如慢性中風)、或神經(jīng)退化性疾病(如帕金森氏癥、阿茲海默癥、脊髓小腦癥、 或亨丁頓舞蹈癥)所造成的損傷?？赏ㄟ^標準技術診斷患者情況或疾病以鑒定出需治療者。該治療方法須投予一亟需其治療的患者一有效量的前述的SBR細胞或SBT細胞、或一活性成分/化合物。此細胞的療效可通過標準方法以測。例如，欲確認其促進腦血管新生的功用，可分別于治療前后通過標準腦部影像技術診察一患者，例如電腦斷層掃描(CT，computed tomography)、都卜勒超音波影像技術(DUI，Doppler ultrasound imaging)、磁振造影 (MRLmagnetic resonance imaging)、以及氫質(zhì)子磁振頻譜(1H-MRS)。例如，氫質(zhì)子磁振頻譜(1H-MRQ代表一非侵入性方法，其可獲取和腦部代謝活動相關的生化資訊(Lu et al.， 1997，Magn. Reson. Med. 37，18-23)。此技術可用于評估干細胞移植前后和大腦局部缺血有關的代謝變化。例如，可用于研究腦內(nèi)N-乙酰天門東胺酸(NAA，N-acetylasparate)的濃度，其為腦部神經(jīng)元完整性的指標。雖然神經(jīng)元碎片中的NAA重新分布和截留限制了其可作為一定量用神經(jīng)標記的用途，然而，大腦局部缺血時的腦部NAA濃度下降仍可被作為神經(jīng)元喪失或功能異常的指標(Demougeot et al. ,2004, J. Neurochem. 90，776-83)。因此， 通過氫質(zhì)子磁振頻譜(1H-MRS)測得的NAA濃度可作為一有效指標以追蹤大腦局部缺血后經(jīng)干細胞移植后的效用。5.癌癥前述的SBR細胞或SBT細胞亦可被用于治療癌癥及其他細胞增生的疾病。一細胞增生疾病其特征是指一未受控制、自發(fā)性細胞生長的疾病(包含惡性及非惡性的生長)。術語“癌癥”是指該類疾病，其特征在于無法控制的細胞生長、侵入和有時候會轉移。癌細胞具自發(fā)性生長的能力，例如一不正常的快速增生細胞生長的狀態(tài)或狀況。該術語意欲包含所有類型的癌化生長、或致癌過程、轉移組織或惡性轉型細胞、組織、或器官、無關乎其為何組織病理類型、或侵入階段。癌癥的范例包含，但不限于，癌及肉瘤，如白血病、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、嗜鉻性細胞瘤、肝癌、卵巢瘤、皮膚癌、睪丸癌、胃癌、胰臟癌、腎癌、乳癌、前列腺癌、大腸癌、頭部或頸部癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎臟皮質(zhì)癌、肺癌、支氣管癌、子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、子宮頸癌或肝癌、及其他原發(fā)部位不明的癌癥。6.基因療法前述細胞及方法可被用于各種不同的已知基因治療方法中?；虔煼ò铙w外 (ex vivo)及活體內(nèi)(in vivo)技術。尤其是，前述干細胞可于活體外以一寡核苷酸調(diào)節(jié)子或一核酸分子編碼該調(diào)節(jié)子進行基因工程改造，將該等工程改造后細胞提供給一被治療的病患。細胞培養(yǎng)物可被調(diào)配以投予一病患，例如，通過分離該細胞(如通過機械式分離)， 并將該細胞與一醫(yī)藥上可接受載劑(如磷酸鹽緩沖液)混合均勻?；蛘撸毎杀慌囵B(yǎng)于一適用的生物相容性載體(support)，并將之植入一病患。該等經(jīng)工程改造的細胞一般為自體衍生的，以便于避免同種異體或異種異體排斥。該等活體外(ex vivo)方法皆為現(xiàn)有技術。該等細胞可通過已知技術投予寡核苷酸或核酸分子以進行工程改造。例如， 寡核苷酸及其他核酸分子可通過直接注射一 “裸露(naked)”核酸分子來投予(Feigner 及 Rhodes, (1991)Nature 349 :351_352 ；U. S. Pat. No. 5，679，647)，或一核酸分子可被配制于一含有一或多個可促進核酸分子被細胞吸收的成分的組合物中，該成分可為皂苷 (saponins)(例如請參閱美國專利號5，739，118)，或陽離子聚胺(例如請參閱美國專利號 5，837，533)；或通過微粒子轟炸(例如；透過使用一“基因槍”；杜邦(Dupont)制藥的基因槍(Biolistic))；或通過將該核酸分子以脂質(zhì)、細胞表面受體、或轉染劑涂覆；或將該核酸分子包覆于一微脂體、微粒、或微膠囊中；或通過投予一與勝肽鏈結的核酸分子，該勝肽已知可進入細胞核；或通過投予一與配體鏈結的核酸分子，該配體易被受體媒介的胞飲作用所影響，其可用以標定出可專一性表現(xiàn)該類受體的細胞類型?！怂?配體復合物可被形成，其中該配體包含一融合病毒勝肽以瓦解內(nèi)體，可使得該核酸免于被溶酶體降解；或該核酸分子可作為細胞專一性吸收的目標，以及通過一特定受體為目標以于活體內(nèi)(in vivo)表現(xiàn)。此外，一引入、表現(xiàn)及累積反股寡核苷酸的有效率的方法已于美國專利號6，265，167中被描述，其可使得該反股寡核苷酸與一正股mRNA 于細胞核中雜合，亦可避免反股寡核苷酸被加工處理或運輸至細胞質(zhì)。本發(fā)明亦考量于細胞內(nèi)引入該核酸分子，以及隨之通過已知同源性重組技術于宿主細胞DNA進行嵌合以表現(xiàn)。該多核苷酸亦可被嵌入于一適用表現(xiàn)載體。一些眾所周知的適用于基因療法應用的載體(參閱，例如Viral Vectors :Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Co. (2000)) 該表現(xiàn)載體可為一質(zhì)體載體。生成及純化質(zhì)體DNA的方法快速且簡易。此外， 當發(fā)生消除分立實體的基因毒性事件(discrete entity eliminating genotoxicity issues)而可能引起染色體整合時，質(zhì)體DNA —般不會整合入宿主細胞的基因組，而是維持于游離基因位置(印isomal location)?，F(xiàn)今已有各種不同市售可得的載體，以及包含該等源自大腸桿菌及枯草桿菌的質(zhì)體，其中多被特別設計為可用于哺乳動物系統(tǒng)中。于本發(fā)明中可能被使用的質(zhì)體的例子包含，但不限于，真核表現(xiàn)載體pRc/CMV (Invitrogen)、 pCR2. 1 (Invitrogen) >pAd/CMV L^^pAd/TRS/GFPq (Massie et al. ，(1998) Cytotechnology 28 :53-64)。一示范具體實施例中，該質(zhì)體為 pRc/CMV、pRc/CMV2 (Invitrogen)、 pAdCMV5 (IRB-NRC)、pcDNA3 (Invitrogen)、pAdMLP5 (IRB-NRC)、或 PVAX(Invitrogen)。該表現(xiàn)載體可為一病毒載體。病毒載體的例子包含，但不限于，該等源自無法自我復制的反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒以及腺病毒相關病毒的病毒載體。反轉錄病毒載體，以及腺病毒相關病毒載體為目前重組基因遞送系統(tǒng)中的首選，其可供活體內(nèi)(in vivo)傳遞外源性寡核苷酸、或基因，特別是可傳入人體。該等載體使得基因可有效率地進入細胞，以及使該傳遞后的核酸可穩(wěn)定的與宿主的染色體DNA整合。一取決使用反轉錄病毒的主要先決條件為該等病毒使用時的安全性，尤其需注意野生型病毒于細胞群中蔓延的可能性。反轉錄病毒載體可源自的反轉錄病毒，包含，但不限于，莫洛尼鼠類白血病病毒、胰臟壞死病毒、反轉錄病毒(像是勞斯肉瘤病毒、哈維氏鼠類肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺乏病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒、以及乳腺腫瘤病毒。特定的反轉錄病毒包含pLJ、pZIP、pffE以及pEM，該等對于現(xiàn)有技術是眾所周知的。7.細胞庫本發(fā)明的一特征在于一干細胞銀行或庫，其可便利地及有系統(tǒng)地存取不同干細胞系。該銀行或庫中的干細胞，源自前述BLSC、SBR細胞、或SBT細胞，其可來自于健康的個體、或具有已知疾病狀態(tài)的患者或該癥狀對于使用者(如研究人員)來說是重要、珍貴的。 具有從前述干細胞分化的細胞的細胞銀行或庫亦在本發(fā)明的范疇中。該等自干細胞所分化的細胞例子包含腦細胞、神經(jīng)元細胞、星狀膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島細胞、脂肪細胞、心臟細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、肌肉細胞、以及眼細胞。該患者可為人類或非人類的脊椎動物。該干細胞可源自任何哺乳動物物種，例如人類、 老鼠、兔、牛、豬等。于銀行或庫內(nèi)的細胞是根據(jù)預定特征來分類，該特征包含表型資訊、形態(tài)特征、分化形態(tài)、血型、主要組織相容性復合體、捐贈者的疾病狀態(tài)、或基因型資訊(如單一核苷酸多型性(SNP，single nucleated polymorphisms)的一特定核酸序列與一基因、基因體或粒線體DNA相關)。該等細胞于一適當環(huán)境中(一般通過冷凍)被保存，以維持該干細胞存活并仍具功能。分類可包括建立各細胞群特征的集中紀錄，例如，但不限于，匯集的書面記錄(assembled written record)、或輸入有資訊的電腦資料庫(database)。本質(zhì)上，此具體實施例涉及一干細胞銀行的制備。該干細胞銀行可幫助使用者從許多樣本中篩選出適用于使用者需要的特定干細胞樣本。此外，于本發(fā)明的另一具體實施例涉及一干細胞銀行，其包含來自于各別來源的許多干細胞樣本，且該等樣本基于至少一預定特征以特征化及分類。于另一具體實施例涉及一建立干細胞銀行的方法，包含從許多來源收集的干樣本 (stem samples)；根據(jù)至少一預定特征以分類該等樣本，及于特定條件下保存該等細胞，使其存活。于本發(fā)明的范疇，是指包含許多干細胞群的一干細胞銀行系統(tǒng)于特定條件下置于個別容器中，使該干細胞群得以存活；一電腦資料庫包含至少一處理模組、一顯示器及一包含對于每一干細胞群的至少一特征資訊的儲存媒體；以及至少一程式碼模組，當使用者下達指令后，可通過該程式碼模組使產(chǎn)生的資訊可于該顯示器上被瀏覽。于一特定的具體實施例中，本發(fā)明其特征之一在于該干細胞銀行系統(tǒng)的干細胞群是來自于一患有疾病狀況的患者的干細胞。該疾病狀況可包含前述的退化性疾病。自患有不同疾病的患者所收集的干細胞，皆被特征化。該等特征被輸入于一電腦資料庫中。此外，亦或是，該等細胞基于一特定表現(xiàn)型但并非必然與一疾病狀況有關來特征化。例如，肝細胞可基于其可代謝某類化合物來特征化，如咖啡因、酒精、藥物制劑等化合物，以研究這些不同代謝能力的遺傳本質(zhì)，或與其相關的基礎生理機能。其他細胞類型可依據(jù)其功能性及/或形態(tài)表現(xiàn)型來特征化。于一些具體實施例中，自SBR細胞或SBT細胞分化的細胞，可通過引入一工程改造的載體、或其他遺傳物質(zhì)，而使其可能易受影響分化或排斥分化的狀況所影響。排斥分化包含操控一細胞使其具有一較不會分化細胞的特性。本發(fā)明的干細胞庫可通過前述方式以篩選出可用以治療退化性疾病、癌癥或免疫疾病的制劑或化合物。該庫可適用于高速篩選系統(tǒng)，及可幫助鑒定出對于一特定患者特別有效的制劑。對于一高速篩選系統(tǒng)，該等干細胞可被導入于一多孔盤的孔中或于一載玻片或微晶片，并與測試制劑接觸。一般而言，該等細胞于一陣列中為有組織化的，尤其是指一可尋址的陣列，這樣即可便于以機器人操作該等細胞及溶液，及監(jiān)測該等細胞，該等操作特別與被檢測的功能有關。使用一高產(chǎn)率形式的優(yōu)點在于可同時進行檢驗許多測試試劑，以及，視需要，對照組的反應可與測試條件完全相同的條件下進行反應。因此，本發(fā)明的篩選方法提供一工具從一個、一些或大量的測試制劑中篩選以鑒定出一可改變干細胞功能的制劑，例如，該制劑包含可使該細胞分化為一所欲的細胞類型、或可避免自發(fā)性分化者，例如可維持高量表現(xiàn)的調(diào)控分子。8.通用捐贈者細胞前述的干細胞可通過基因工程方法改造以產(chǎn)生組織抗原相容的捐贈者細胞或組織以作為移植之用。移植及細胞治療的目標是以具功能性的捐贈者組織或器官將衰竭的組織或器官成功地取代。然而，為求成功移植，需克服兩道屏障適合的捐贈者組織或器官的取得，以及免疫排斥現(xiàn)象。取代衰竭的組織或器官以及免疫排斥的治療，受限于可接受的捐贈者的數(shù)量有限，以及于長期免疫抑制治療方法中需同時投予具毒性的免疫抑制藥物。當前及實驗性移植的方法主要倚賴親屬捐贈者、和其他極為少量的同種異體或異種異體捐贈者。前述基因工程改造的干細胞可用來克服該等限制。更特定而言，本文所述的干細胞可利用基因工程操作改造，使其不于細胞表面表現(xiàn)第二類主要組織相容性復合體分子(class II MHC molecules)。較佳地，該等細胞通過工程改造以使其不表現(xiàn)大體上所有細胞表面上的第一類及第二類主要組織相容性復合體分子。如本文所用，術語“不表現(xiàn)”是指由于細胞表面上不足量的表現(xiàn)，故無法引起反應，或是，所表現(xiàn)的蛋白質(zhì)有所缺陷而無法引起一反應。該主要組織相容性復合體分子是指HLA分子，專指第一類HLA A、B及C，以及第二類HLA 0 、00、及01 、以及其次分類。此術語常解釋為專指人類主要組織相容性復合體，然于本文可衍生包含來自其他捐贈者物種的等效主要組織相容性復合體基因，例如若該細胞來源為豬，則術語HLA是指豬的主要組織相容性復合體分子，無論是指第一類或第二類主要組織相容性復合體。當?shù)诙愔饕M織相容性復合體分子被移除時，CD4+T細胞即無法辨認被基因工程改造的內(nèi)皮細胞；當?shù)谝活惣暗诙愔饕M織相容性復合體分子皆被移除，則無論CD4+或CD8+細胞皆無法辨認經(jīng)修飾的細胞。較佳的干細胞基因修飾包含1)破壞內(nèi)生性非變異勝肽鏈(invariant chain)基因，其作用于第二類MHC分子的組裝和運送至細胞表面，以及抗原性勝肽的裝載；以及2) 破壞內(nèi)生性β2_微球蛋白基因(β2Μ gene)，其編碼所有第一類MHC分子表現(xiàn)于細胞表面時所需的蛋白質(zhì)。另外，僅非變異勝肽鏈(invariant chain)基因被破壞。非變異勝肽鏈 (invariant chain)被認為于抗原性勝肽片段嵌入第二類MHC分子時所需?？偠灾?，抗原性勝肽和主要組織相容性復合體為T細胞所辨識。于抗原勝肽不存在時，T細胞辨識即無法正常達成，第二類MHC分子亦無法正確折疊。因此，在缺乏非變異勝肽鏈(invariant chain)的細胞中，勝肽的呈現(xiàn)將受阻礙，縱使另存在極少量的細胞表面MHC，其仍缺少勝肽因而無法引起免疫反應。該等基因的破壞可通過同源重組基因標靶技術以達成。該等技術為現(xiàn)有技術。 參閱美國專利號 6916654 及 6986887，Zijlstra et al.，1989，Nature 342 :435438 ；以及 Roller et al. ，1990 Science 248:1227-1230。9.組合物本發(fā)明提供一醫(yī)藥組合物，包含前述細胞或活性成分/化合物。醫(yī)藥組合物可通過混合一治療有效量的該等細胞或活性制劑/化合物，及視需要包含其他活性物質(zhì)，及一醫(yī)藥可接受的載劑以制備。該載劑可為不同形式，視投予的路徑?jīng)Q定。其他活性物質(zhì)的例子包含已知的活性化合物或通過前述篩選方法所鑒定者。前述醫(yī)藥組合物可通過常規(guī)的醫(yī)藥賦形劑及制備方法來制備。所有賦形劑皆可與崩解劑、溶劑、?；瘎⒈駝┘梆ず蟿┻M行混合。于本文所述的術語“有效量”或“治療有效量”是指一可使得特定疾病的至少一癥狀或參數(shù)得以顯著地改善的數(shù)量。前述細胞的治療有效量可由已知方法決定。用以治療一疾病的有效量可通過該領域具有通常技藝者以已知試驗方法來容易地決定。而用以投予一病患時的確切數(shù)量將依照該疾病的情況及嚴重度， 以及該病患的生理情況而有所不同。任何癥狀或參數(shù)的顯著地改善可由本領域的技術人員或由醫(yī)師對于該病患的報告來決定。將被明了的是，前述疾病的任何癥狀或參數(shù)具任何臨床上或統(tǒng)計上顯著減弱或改善者皆隸屬本發(fā)明的范疇內(nèi)。臨床顯著地減弱或改善意指對于該病患及/或于一醫(yī)師是顯而易見的。詞組“醫(yī)藥可接受的”是指當投予一人類時，該等組合物中的分子個體及其他成分是生理上可接受的，且一般不會產(chǎn)生不欲的反應。較佳地，術語“醫(yī)藥可接受的”意指受聯(lián)邦監(jiān)管機關、或一州政府、或列于美國藥典、或于其他一般公認藥典所公認可用于哺乳動物，特別是指人類。醫(yī)藥可接受鹽類、酯類、酰胺，以及前驅藥，是指該些鹽類(如羧酸鹽、 胺基酸添加鹽)、酯類、酰胺，以及前驅藥，于可靠的醫(yī)療判斷范疇內(nèi)，其可適合使用于與病患組織接觸，且無過渡毒性、刺激性、過敏反應等；且需考量該等用途的合理的利益/風險比及有效性。一可應用于前述醫(yī)藥組合物的載劑是指一稀釋劑、賦形劑、或一載體，其可被投予一化合物。該等醫(yī)藥載劑可為無菌的液體，例如水及油。優(yōu)選以水或水溶液、鹽液、及液態(tài)葡萄糖及甘油溶液作為一載劑，特別可作為注射溶液。適用的醫(yī)藥載劑已于由E.W.Martin 所撰的"Remington' s Pharmaceutical Sciences〃第 18 版中描述。該等前述細胞可透過注入或注射(例如靜脈注射、鞘內(nèi)注射、肌肉注射、腔內(nèi)、氣管內(nèi)、腹腔或皮下)、口服、皮膚穿透、或其他已知方法，以投予一個體。投予可能每兩周一次、一周一次、或更頻繁，但當該疾病或失調(diào)于一穩(wěn)定階段時，其投予頻率則可能會減少。異源的及自體的細胞皆可被使用。于前者情況，HLA的吻合將可避免或降低宿主的反應。于后者情況，自體的細胞從一患者中被富化及純化后，進行保存以備用。該細胞可活體外培養(yǎng)于一含有宿主、或移植T細胞的環(huán)境中，并重新被送回該宿主。此舉可使該等細胞于該宿主內(nèi)被視為自體的細胞，并較可降低T細胞活性。劑量和投予頻率將取決于臨床癥狀，其經(jīng)確認緩解階段的維持，或于急性期的至少一個或多個，較佳為多于一個的本領域技術人員所知的臨床癥狀被減少或消失。更普遍者，劑量和投予頻率部分將取決于一疾病狀況或失調(diào)的病理癥狀及臨床和亞臨床癥狀經(jīng)前述組合物治療后的削弱情形。于病患或被治療的哺乳患者、及醫(yī)師的診斷，其劑量和投予方案可根據(jù)年齡、性別、身體狀況的管理，以及共軛利益和副作用來調(diào)整，該等技藝皆為本領域技術人員所知悉。于所有前述方法中，該等細胞以每次1x104至1x1010的量投予一患者ο以下特定的實施例僅供示例說明，非用以限制未于本發(fā)明揭示者。無需進一步詳細闡述，相信該領域技術人員可基于本文的說明，將本發(fā)明發(fā)揮至淋漓盡致。SBR及SBT細胞的制備將BLSCs活化、純化及擴增的方法，已于W0/2007/100845中被描述。于此實施例中，BLSCs從人類患者的血液中以兩種方法純化。該等分離細胞以流式細胞儀分析。結果顯示于圖IA至IC及圖2A至2C。結果發(fā)現(xiàn)，該兩種方法分別可獲得200x106及230xl06BLSC/
毫升血液。該純化后的BLSCs可于StemBios-OOl中進行培養(yǎng)。為了產(chǎn)生SBR及SBT細胞， BLSCs可于StemBios-002培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。接著，該等BLSCs遂于一含有0. 1至20 μ M RA、或1至40nM TGF-β的StemBios-003培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過二至六周?？捎^察到該等培養(yǎng)細胞其形態(tài)及尺寸逐漸地變化(圖6至12圖)。該等細胞分別命名為SBR及SBT細胞。該SBR及SBT細胞以標準方法測試其發(fā)育及分化能力?？砂l(fā)現(xiàn)該等細胞可分化為源自三種胚層的細胞，例如外胚層、中胚層，及內(nèi)胚層。亦可觀察到該等所有或大部分細胞皆為 CD10+、CD90+、CD105+、及 CXCR4+。SBR、SBT 及 BLSCs 的 RT-PCR 結果SBR細胞、SBT細胞及BLSCs的基因表現(xiàn)是可被檢測的。是以一 Qiagen RNA萃取套
18組 ^!iagen，CA)、Paris kit (Ambion)、或 RNAzol kit QnvitroGen)，從 SBR 培養(yǎng)細胞或 SBT 培養(yǎng)細胞(每一種皆超過六百萬個)分離出總RNA。依操作手冊Oiiagen)可使用0. 25ng 寡-(dT) 12-18及反轉錄酶(Qiagen)將2. O μ g RNA制備為cDNA。然而，從超過1億個BLSCs 中無法取得可偵測的RNA。RT-PCR 是以 94 °C (15 秒)、55 V (15 秒)、72 V (20 秒)的條件進行 30 個循環(huán)。β -肌動蛋白的引子對為正向5’ -ACAAAACCTAACTTGCGCAG-3’ ；反向 5，-TCCTGTAACAACGCATCTCA-3，。GADPH 的引子對為正向 5，-AGCCACATCGCTCAGACACC-3，； 反向5’-GTACTCAGCGGCCAGCATCG-3’。該等結果顯示于圖13?？砂l(fā)現(xiàn)β-肌動蛋白及GADPH 可表現(xiàn)于SBR細胞及SBT細胞，而于BLSCs則無表現(xiàn)。其他具體實施例所有于本說明書所揭露的特征可以任何組合方式組合。于本說明書中所揭露的每一特征可通過另一相同、等效、或相似目的的可替換特征來置換。因此，除非明確聲明，否則每一揭露的特征僅為各種等效或相似特征的一般系列的示例。于前述說明中，該領域技術人員可輕易確認本發(fā)明的必要技術特征，在無脫離其精神及范圍下，可對本發(fā)明進行各種不同改變及修改以使其適用于各種不同的用途及情況。因此，其他的具體實施例亦在以下申請專利范圍的范疇內(nèi)。
權利要求
1.一種制造多能性或全能性細胞群體的方法，其特征在于，包含取得復數(shù)個胚葉細胞-類似性干細胞(BLSCs)，在含有維生素A酸(RA)或轉形生長因子β (TGF-β)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)BLSCs，以及鑒定及富化經(jīng)培養(yǎng)細胞中的多能性或全能性細胞；其中該多能性或全能性細胞表達GADPH或β -肌動蛋白的mRNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15 微米。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有0.1至20μ M RA且培養(yǎng)該 BLSCs 2至8星期。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1至15μΜRA且培養(yǎng)該BLSCs 2至8星期。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有5至12μΜRA且培養(yǎng)該BLSCs 3至4星期。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，該多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15 微米且在懸浮液中形成片狀構造。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1至40nMTGF-β且培養(yǎng)該 BLSCs 2至8星期。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有2至20nMTGF-β且培養(yǎng)該 BLSCs 2至8星期。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該培養(yǎng)基含有5至12nMTGF-β且培養(yǎng)該 BLSCs 4至6星期。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該多能性或全能性細胞在尺寸上為1至15 微米、具有圓形形狀且形成凝聚物。
11.一種組合物，其特征在于，包含復數(shù)個經(jīng)培養(yǎng)的細胞，該經(jīng)培養(yǎng)的細胞(1)為多能性或全能性，⑵在尺寸上為1至15微米，且(3)表達GADPH或β-肌動蛋白的mRNA。
12.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該組合物進一步包含維生素A酸(RA) 或轉形生長因子β (TGF-β)。
13.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞的第一群為⑶66e+。
14.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞包括重組核酸。
15.如權利要求14所述的組合物，其特征在于，該重組核酸編碼多肽且該細胞含有編碼多肽的mRNA。
16.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞通過如權利要求1所述的方法制備。
17.如權利要求16所述的組合物，其特征在于，該細胞的第二群為⑶66e_。
18.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞不會表達β2-微球蛋白基因。
19.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞不會表達一種或以上由第I類主要組織相容性復合體(MHC)基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)會激發(fā)T淋巴球所媒介的抗細胞反應。
20.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞為⑶10+、⑶90+、⑶105+及CXCR4+。
21.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，該細胞為臺盼藍(trypanblue)染色陰性。
22.—種治療患者退化性疾病的方法，其特征在于，該方法包含將有效量的如權利要求 11所述的組合物投予需要該治療的患者。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，在該組合物中的各細胞包括重組核酸。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，該重組核酸編碼多肽且該細胞含有編碼多肽的mRNA。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，該退化疾病為糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、 關節(jié)炎或癌癥。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，該神經(jīng)退化性疾病為帕金森氏癥。
27.一種治療患者自體免疫性疾病的方法，其特征在于，該方法包含將有效量的如權利要求11所述的組合物投予需要該治療的患者。
28.一種鑒定用于治療退化性疾病的候選藥的方法，其特征在于，該方法包含 使受試化合物與如權利要求11所述的組合物接觸以及測定在退化性疾病中被下調(diào)的多肽的表達量，其中于存在該受試化合物下的表達量若高于不存在該受試化合物下的表達量，則表示該化合物為治療該疾病的候選藥。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，該退化性疾病為糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、關節(jié)炎、癌癥或自體免疫性疾病。
30.一種在患者中引進異源性核酸的方法，其特征在于，包含取得如權利要求11所述的組合物，其中該組合物中的細胞包括異源性核酸，以及將該細胞投予至需要該異源性核酸的患者。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，該異源性核酸編碼多肽。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，該細胞在該患者中表達該多肽。
33.一種細胞銀行，其特征在于，包含復數(shù)種如權利要求11所述的組合物。
34.如權利要求33所述的細胞銀行，其特征在于，該細胞為人類細胞。
35.一種制造如權利要求33所述的細胞銀行的方法，其特征在于，包含 從復數(shù)個患者收獲細胞以分別得到復數(shù)個胚葉細胞_類似性干細胞群； 鑒定該細胞群，對于各細胞群得到至少一種預定的特征；以及按照該至少一種預定的特征將該細胞群的各個分類。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，該方法進一步包含擴增細胞群。
全文摘要
本發(fā)明揭示了非胚胎來源的新穎干細胞及其用途。
文檔編號A61P37/00GK102333863SQ201080004509
公開日2012年1月25日 申請日期2010年1月13日 優(yōu)先權日2009年1月13日
發(fā)明者詹姆斯·王, 閻云 申請人:干細胞生物科技公司