專利名稱：細(xì)胞外超氧化物歧化酶的新用途及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD， extracellular superoxide dismutase)的新用途及其制備方法。更具體而言，本發(fā)明涉及 用于預(yù)防或治療血管發(fā)生Ungiogenesis)介導(dǎo)的疾病或變應(yīng)性疾病的組 合物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白或具有編碼所述 EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)通過清除活性氧簇和激活其他抗氧化酶來起 起到保護(hù)細(xì)胞的作用，目前為止已知的SOD包括含銅原子和鋅原子的 Cu/Zn SOD(SOD 1)、含錳原子的Mn SOD(SOD 2)及存在于細(xì)胞表面或細(xì) 胞外液的EC-SOD。尤其，EC-SOD和Cu/Zn SOD —樣具有銅原子和鋅原子，但以C-端具有肝素結(jié)合域?yàn)樘卣?。由于EC-SOD具有肝素結(jié)合域，因此預(yù)測它 可能通過與細(xì)胞膜結(jié)合對細(xì)胞^保護(hù)作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EC-SOD在 血漿及細(xì)胞外基質(zhì)等擔(dān)當(dāng)機(jī)體防御作用(Marklund et al， Biochem. J. 266， 213-219， 19卯；Su et al" Am J Respir Cell Mol Biol" Feb 16(2)， 162-70， 1997; Luoma et al" Thromb. Vase Bio. 18， 157-167,1998 )。此外，有報(bào)道 稱EC-SOD的肝素結(jié)合域起核定位信號(hào)作用，因?yàn)樗挥谛叵俸筒G丸細(xì) 胞的細(xì)胞核中，從而使基因組DNA免受氧化應(yīng)激并調(diào)節(jié)對氧化還原反應(yīng) 敏感的DNA轉(zhuǎn)錄作用(Ookawara T et al" BBRC， 296， 54-61， 2002)。本發(fā) 明的發(fā)明人通過韓國專利第10-0676502號(hào)公開過EC-SOD通過清除皮膚 細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇和抑制表皮細(xì)胞的過度增殖，從而對銀屑病等皮膚病的 治療具有一定效果。同時(shí)，血管發(fā)生是指從已有的血管產(chǎn)生新的毛細(xì)血管的過程。通常血 管發(fā)生只在包括胚胎發(fā)育期、傷口愈合期和女性生殖周期在內(nèi)的 一些特定 情形下才出現(xiàn)，而在正常情形下幾乎不會(huì)出現(xiàn)。但是血管發(fā)生不能正確調(diào) 節(jié)時(shí)，可引發(fā)諸如癌癥等疾病。5說明書第2/29頁上#管發(fā)生過程由以下幾個(gè)步驟組成肺瘤細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生 長因子(VEGF);^堿性成纖維生長因子(bFGF)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長；通過基 質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)；內(nèi)皮細(xì)胞遷移，所述遷移 由細(xì)胞膜黏附分子介導(dǎo)；內(nèi)皮細(xì)胞分化及管形成(Bussolino， F.et ai.， Trends Biochem. Sci. 22:251-256， 1997; K鼎ano, M. et al" Intern. Med. 40:565-572， 2001; Risau， W. Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44:416-417， 1994)。因此，已經(jīng)提出將對上述這些 過程的抑制作為治療血管發(fā)生介導(dǎo)疾病(包括癌癥及其他人類疾病)的新 的治療戰(zhàn)略。為此，已開發(fā)出多種多樣的血管發(fā)生抑制劑。上述抑制劑為 天然或合成的物質(zhì)，包括蛋白酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑，趨化因子、 白細(xì)胞介素^S^質(zhì)蛋白質(zhì)的蛋白分解片段(Abedi， H. et. al.， J. BioL Chem. 272:15442-15451， 1997; Cao， Y" Int.丄Bioehem. Cell Bioi. 33:357-369， 2001; Fong， T. A et al" Cancer Re& 59:99-106, 1999; Kwon， H. J. et al" Acalycigorgia inermis. J.Microbiol. BioteclmoL 11:656-662， 2001.)。 上述 抗血管發(fā)生分子影響到多個(gè)過程，包括抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、蛋白 酶活性及管形成，以及對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(Folkman， J. et. al.， Semin. Cancer BioL 3:89-96， 1992; Kishi， K. et al" Nippon Rinsho 58:1747-1762， 2000; Marme， D.， Onkologie 1:1-5， 2001)。上述許多分子的抗血管發(fā)生功 能在體內(nèi)外都有較好的研究，并且有幾種抗血管生成藥物目前正在臨床試 驗(yàn)中測試(Deplanque， (i et. al"五欣/ Omce/* 36:1713-1724， 2000; Liekens, et. al" Biochem. Pharmacol 61:253-270， 2001; Mross， K.， Drug Resist. Updat 3: 223-235， 2000)。雖然活性氧簇被報(bào)道對血管發(fā)生起主要調(diào)節(jié)作用(Jolanta Grzenkowicz-Wydra, et.al" Mol Cell Bioche肌，264(1-2): 169-81， 2004)，但 是關(guān)于清除活性氧簇的SOD和血管發(fā)生之間的關(guān)系并未得到充分研究。 最近有報(bào)道指出，具有SOD以及銅原子和鋅原子的Cu/Zn SOD(SOD 1) 的過表達(dá)會(huì)刺激血管發(fā)生，因此抑制SOD1則可抑制血管發(fā)生(Jolanta Grzenkowicz國Wydra， et.al.， Mol Cell Biochem" 264(1-2): 169-81， 2004)。此 外，還有報(bào)道指出，SOD1的抑制劑ATN-224抑制血管發(fā)生，因此可作 為抗癌劑使用，并且目前正在進(jìn)行2期臨床試驗(yàn)(Juarez et al. Clin Cancer Res.， 12: 4974-4982, 2006)。但是對于EC-SOD和血管發(fā)生之間的關(guān)系并 未見纟艮道。同時(shí)，隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染、新合成物質(zhì)的增加以及居住環(huán)境 的變化所引起的致變應(yīng)性因素隨之增加，因此受到哞喘、過敏等疾病困擾 的人數(shù)逐漸增加。機(jī)體對于^機(jī)體的異物產(chǎn)生特異的抵抗的功能稱為免 疫。變應(yīng)反應(yīng)是一種超敏免M應(yīng)，典型的變應(yīng)性疾病包括特應(yīng)性皮炎、 支氣管哮喘及花粉癥。變應(yīng)反應(yīng)引起的臨床癥狀大致分為初期的特異性免 疫反應(yīng)和后期的炎癥反應(yīng)。上述免^應(yīng)主要由肥大細(xì)胞介導(dǎo)，已知肥大 細(xì)胞廣泛分布于身體的各器官，包括皮膚、呼吸器官、胃腸粘膜、腦、淋 巴管周圍和血管周圍，并且已知會(huì)引起變應(yīng)反應(yīng)。以活化肥大細(xì)胞著稱的介體(mediator)包括與位于細(xì)胞膜中的高親和力免疫球蛋白E (IgE) 受體(FcsRI)結(jié)合的IgE抗體、化合物48/80等。IgE抗體引起的肥大 細(xì)胞的活4t機(jī)制如下。結(jié)合于IgE受體的IgE抗體與抗原形成橋聯(lián)時(shí)，通過磷脂酶C、蛋 白磷酸酶C和鈣離子的作用，儲(chǔ)藏在肥大細(xì)胞顆粒的物質(zhì)如組胺、硫酸 軟骨素、肝素及蛋白酶等得以釋放，由此介導(dǎo)上述初期反應(yīng)。在引起出現(xiàn) 在變應(yīng)反應(yīng)初期的臨床癥狀的化學(xué)物質(zhì)(包括組胺)中，組胺的影響最大。 即，在變應(yīng)反應(yīng)初期，主要表達(dá)組胺，其所引起的臨床癥狀為血管舒張、 浮腫等。目前，多使用抗組胺藥物或類固醇類藥物來治療變應(yīng)性疾病。但是這 些藥物的效果只是一時(shí)的，而且副作用嚴(yán)重的情況也頗為多見。因此，迫 切地需要開發(fā)出 一種新的物質(zhì)，該物質(zhì)既對激增的變應(yīng)性疾病具有預(yù)防及 治療作用，且副作用又小且效果持久。但EC-SOD是否對變應(yīng)性疾病具 有治療效果還不為人知。同時(shí)，即使EC-SOD具有多樣的活性，如果開發(fā)不出大量生產(chǎn) ES-SOD的方法，其也不能在工業(yè)中得到有效利用。但是，到目前為止已 開發(fā)的蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)方法包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如大腸桿 菌細(xì)胞，并誘導(dǎo)蛋白在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)，蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)往往導(dǎo)致包 含體的形成，因而存在蛋白質(zhì)原來的活性消失或者減少的問題。本發(fā)明的發(fā)明人已對EC-SOD蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC-SOD 表現(xiàn)出抑制血管生成所致疾病或者變應(yīng)性疾病的活性。基于這一發(fā)現(xiàn)，本 發(fā)明人開發(fā)出一種制備具有上述活性的EC-SOD蛋白的方法，從而完成 了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
因此，為了實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療血管
發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合物，所述組合物含有作為活性成分的EOSOD蛋 白。
另 一方面，本發(fā)明還提供了 一種用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾 病的組合物，所述組合物含有作，活性成分的具有編碼EC-SOD蛋白的 多核苷酸的栽體。
又一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白。
又一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物含有作為活性成分的具有編碼EC-SOD蛋白的多核普酸 的載體。
又另一方面，本發(fā)明提供了一種制備EC-SOD蛋白的方法。 技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的， 一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療血 管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD 蛋白。
另 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病 的組合物，所述組合物含有作為活性成分的具有編碼EC-SOD蛋白的多 核苷酸的載體。
又一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白。
又一方面，本發(fā)明提供了 一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物^^有作為活性成分的具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核 苷酸的載體。
又另一方面，本發(fā)明提供了一種制備EC-SOD蛋白的方法，所述方 法包括以下步驟(a)將編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表達(dá) 栽體中；(b )將上述表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中以轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞；(c) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化得到的宿主細(xì)胞以在所述細(xì)胞中表達(dá)EC-SOD蛋白；(d)收集表達(dá)的EC-SOD的包含體；并(e)溶解所述包含體并誘導(dǎo)所述包含體重 新折疊(refold )。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明中所使用術(shù)語"表達(dá)載體"描述的是能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中 表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)或目標(biāo)RNA的載體，并指含有與基因插入物有效連接的 必需調(diào)節(jié)元件的遺傳構(gòu)建體。
本發(fā)明所用術(shù)語"有效連接"是指核苷酸表達(dá)調(diào)控序列和編碼目標(biāo)蛋 白的核苷酸序列實(shí)現(xiàn)總體功能方式的功能性連接。例如，啟動(dòng)子和編碼蛋 白或RNA的核苷酸序列連接在一起，從而使其能影響所述編碼的核普酸 序列的表達(dá)。與重組載體的有效連接可利用本領(lǐng)域熟知的基因重組技術(shù)制 備，并且位點(diǎn)特異性DNA剪切及連接可利用廣為本技術(shù)領(lǐng)域熟知的酶進(jìn) 行。
本發(fā)明提供了 一種用于預(yù)防或者治療血管生成疾病的組合物，所述組 合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白。
上述EC-SOD蛋白優(yōu)選為天然或重組EC-SOD蛋白，但并不限于此。 上述天然EC-SOD蛋白優(yōu)選來源于小鼠或人，更優(yōu)選來源于人，但并不 限于此。上述天然EC-SOD蛋白優(yōu)選具有選自SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:5的M酸序列，最優(yōu)選具有SEQIDNO:3的M酸序列，但并不 限于此。同時(shí)，對上述重組EC-SOD蛋白沒有特別限制，只要它是由上 述天然EC-SOD制備從而維持了其活性即可。優(yōu)選地，所迷重組EC-SOD 蛋白具有M^列。
另 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病 的組合物，所述組合物含有作為活性成分的具有編碼上述EC-SOD蛋白 的多核苷酸的載體。
編碼上述EC-SOD蛋白的多核苷^A指能夠編碼上述天然EC-SOD 蛋白或重組EC-SOD蛋白的多核苷酸，優(yōu)選具有選自SEQ ID NO: 2、 SEQ 101^0:4及8￡()10]\0:6的>^序列，但是并不限于此。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過公知方法來制備it^達(dá)小鼠EC-SOD 的小鼠(參見測試實(shí)施例l),并將該小鼠用UVB照射，然后將其與野生 型小鼠進(jìn)行組織形態(tài)變化的比較。結(jié)果觀察到，野生型小鼠由于UVB照
9射誘導(dǎo)了血管發(fā)生，但是EC-SOD過表達(dá)小鼠中由于UVB照射引起的血 管發(fā)生明顯受到抑制(參見實(shí)施例2-1 )。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，上述EC-SOD過表達(dá)小鼠中由于UV光 照射引起的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及MMP-9的表達(dá)水平通過蛋白質(zhì) 印跡(實(shí)施例2-2 )、免疫組織化學(xué)法(實(shí)施例2-3 )及酶鐠法(zymography) (實(shí)施例2-4)來檢測。結(jié)果觀察到，由于紫外線照射野生型小鼠中VEGF 及MMP-9的表達(dá)增加，但是在EC-SOD過表達(dá)小鼠中VEGF及 MMP-9的表達(dá)受到顯著地抑制。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，EC-SOD能夠抑 制誘導(dǎo)血管發(fā)生的VEGF的表達(dá)，且抑制調(diào)節(jié)血管發(fā)生的MMP-9的表 達(dá)，從而抑制血管發(fā)生。
在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，將去除肝素結(jié)合域的重組EC- SOD在大 腸桿菌中表達(dá)，然后將其從此大腸桿菌抹中分離出來，從而生產(chǎn)出經(jīng)過重 新折疊和純化的EC-SOD蛋白(參照實(shí)施例l)，并檢測所得蛋白質(zhì)是否 會(huì)抑制血管發(fā)生(參照實(shí)施例3 )。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV光照射誘發(fā)VEGF表 達(dá)，但是用上述重組EC-SOD蛋白處理導(dǎo)致VEGF的表達(dá)受到抑制。因 此上述EC-SOD蛋白或其中插入有編碼該EC-SOD蛋白的多核苷酸的栽
體可有效用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病。上i^J&L管發(fā)生介導(dǎo)的疾
病包括所有由VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)表iiJL MMP-9 (基質(zhì)金屬蛋 白酶9)表達(dá)誘發(fā)的疾病，其優(yōu)選實(shí)例包括例如癌癥、糖尿病、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、動(dòng)l^化、血管瘤、血管纖維瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟兒視 網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、血管生成引起的角膜疾病、退化斑 (degenerative spot )、黃斑變性(macular degenerative )、翼狀箭肉、視 網(wǎng)膜變性、晶狀體后纖維增生癥(retrolentalfioplasia)、顆粒性結(jié)膜炎、 毛細(xì)血管擴(kuò)張、化膿性肉芽胂及痤掩等，但不限于此(Ophthalmol 102， 1261-1262， 1995; J Am Acad Derm 34(3):486-497， 1996; Circultion 93(4):632國682， 1996; Cell 86: 353-364， 1996 )。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白。
如上所述，EC-SOD蛋白是指天然或重組EC-SOD蛋白，但并不限 于此。上述天然EC-SOD蛋白優(yōu)選來源于小鼠或人，更優(yōu)選來源于人， 但并不限于此。上述天然EC-SOD蛋白優(yōu)選選自具有SEQ ID NO: 3及 SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，最優(yōu)選具有SEQ ID NO: 3氨基酸序列，但并不限于此。同時(shí)，對上述重組EC-SOD蛋白沒有特別限制，只要它 是由上述天然EC-SOD蛋白經(jīng)重組技術(shù)制備從而維持了其活性即可。優(yōu) 選地，所述重組EC-SOD蛋白具有SEQ ID NO: 1的^酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合 物，所述組合物含有作為活性成分的其中插入有編碼所述EC-SOD蛋白 的多核苷酸的載體。
如上所述，編碼上述EC-SOD蛋白的多核苷酸是指編碼上述天然 EC-SOD蛋白或重組EC-SOD蛋白的多核苷酸，優(yōu)選具有選自SEQ ID NO: 2、 8虹010]>{0:4及8￡010]^0:6的>^序列，但并不限于此。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，分析了重組EC-SOD蛋白對T細(xì)胞的增 殖及分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述重組EC-SOD誘導(dǎo)了 T細(xì)胞中Thl細(xì) 胞因子IFN々的形成，并抑制了 Th2細(xì)胞因子IL-4的形成。這表明重組 EC-SOD蛋白對T細(xì)胞的分化具有影響，并表明它可阻斷誘發(fā)變應(yīng)性疾 病的Th2細(xì)胞的過分化并誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化為Thl細(xì)胞，因而可有利地 用于變應(yīng)性疾病的治療或預(yù)防(參照實(shí)施例4)。
在本發(fā)明的另 一個(gè)實(shí)施例中，檢測了人天然蛋白EC-SOD對T細(xì)胞 分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述EC-SOD蛋白也能夠阻斷誘發(fā)變應(yīng)性疾病 的Th2細(xì)胞的過分化并誘導(dǎo)分化為Thl細(xì)胞(參照實(shí)施例5 )。
在本發(fā)明另一實(shí)施例中，檢測了重組EC-SOD蛋白是否具有抑制轉(zhuǎn) 錄因子活性的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組EC-SOD蛋白能夠抑制NF-KB的異 ?；钚?參照實(shí)施例6)，并具有減少人肥大細(xì)胞的脫顆粒的效果。因此， 考慮到以下事實(shí)，本發(fā)明重組EC-SOD蛋白可有利地用于變應(yīng)性疾病的 預(yù)防或治療(參照實(shí)施例7):儲(chǔ)藏在肥大細(xì)胞內(nèi)的介體如組胺，因肥大 細(xì)胞的脫顆粒而得以釋放，從而引起炎癥反應(yīng)如變應(yīng)。
因此，上述EC-SOD蛋白或其中插入有編碼所述蛋白的多核普酸的 栽體可用于變應(yīng)性疾病的預(yù)防或者治療用組合物中。上述變應(yīng)性疾病選自 變應(yīng)性哞喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性中耳炎、變應(yīng)性休克、變應(yīng)性皮膚病、 特應(yīng)性皮炎、銀屑病、接觸性變應(yīng)性皮膚炎及蕁麻滲。
所述本發(fā)明組合物中所包含的EC-SOD蛋白還包括與之具有同等生 理活性的蛋白質(zhì)。所述具有等同生理活性的蛋白質(zhì)包括EC-SOD蛋白的 功能等同物及功能衍生物。
本發(fā)明的術(shù)語"功能等同物"是指與SEQ ID NO: 3的EC-SOD具有等
ii同生理活性的多肽。
術(shù)語"等同生理活性，，是指抑制血管發(fā)生或變應(yīng)的活性。上述功能等同
物可以為與^J^酸序列SEQ ID NO: 3具有至少70%、優(yōu)選至少80%、 更優(yōu)選至少卯％的氨基酸序列同源性的多肽。術(shù)語功能等同物是指這樣 的肽，即所述肽與通過對SEQIDNO:3的添加、置換或缺失處理所得的 肽具有至少70%、優(yōu)選具有至少80%，更優(yōu)選具有90%例如70%、 71%、 72%、 73%、 74%、 75%、 76%、 77%、 78%、 79%、 80%、 81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和100%的^11^酸序列同源性(即 同一性)，且展現(xiàn)出與多肽SEQ ID NO: 3基本上相同的生理活性。本i兌 明書中序列同源性及同 一性被定義為在比對候選序列和氨基酸序列 SEQ ID NO: 3并引入空位后，所述候選序列中與M酸序列SEQ ID NO: 3相同的^酸殘基百分比。必要時(shí)，為了獲得最大百分比的序列同一性， 不考慮將任何保守置換作為序列同一性的一部分。#^酸序列SEQ ID NO: 3的N-端、C-端或內(nèi)部的延Zf申、缺失或插入，由于影響序列的同一 性或同源性，因而沒有哪一個(gè)應(yīng)被構(gòu)建。因而，序列同一性可通過通常用 于比較兩個(gè)多肽的氨基酸位置的相似度的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)來確定。使用諸如 BLAST或FASTA的計(jì)算機(jī)軟件，可比對兩個(gè)多JlU^而將其各自的JL^ 酸進(jìn)行最佳匹配(沿著一個(gè)或兩個(gè)序列的全長或沿著一個(gè)或兩個(gè)序列的預(yù) 定部分)。上述程序提供了默認(rèn)開放罰分(default opening penalty)和默認(rèn) 空位罰分(default gap penalty),以及得分矩陣如PAM 250(標(biāo)準(zhǔn)得分矩陣； Dayhoff et al" in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5， supp. 3， 1978)。例如，同一性百分比可計(jì)算為相同匹配物的總數(shù)乘以100，再 除以匹配范圍內(nèi)較長序列的長度與為比對這兩段序列而引入較長序列中 的空位數(shù)目之和。本發(fā)明功能等同物的范圍包括通過以下方式所獲得的多 肽衍生物對所述多肽的一部分化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行^務(wù)飾并維持該多肽的基本構(gòu) 架及生理活性。例如，這包括為改變本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏性、揮 發(fā)性或溶解度的結(jié)構(gòu)修飾。
另外，本發(fā)明組合物的多核苷酸序列包括DNA、 cDNA及RNA序列。 優(yōu)選地，上述多核香酸可包括選自SEQ ID NO: 2、 4及6的序列。本發(fā)
表達(dá)載體二如病毒載體。本發(fā)明表、達(dá)載;可含有表t調(diào)控序列:藉:;斤述EC-SOD的EC-SOD蛋白和cDNA可被表達(dá)。上述多核苷酸可分離自自 然界或者根據(jù)本領(lǐng)域^^知的方法制備。
上ii^達(dá)調(diào)控序列(expression control sequence)是指某些宿主細(xì)胞 中與編碼序列有效連接的該編碼序列的表達(dá)必需的DNA序列。上述的表 達(dá)調(diào)控序列包括為實(shí)施轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、為調(diào)控上述轉(zhuǎn)錄的某些操縱子序 列、編碼相關(guān)mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。 例如，適合原核生物的調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、操縱子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。 調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、多腺苷化信號(hào)序列及增強(qiáng)子。
插入上述表達(dá)載體之后，通過感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)等本領(lǐng)域公知的方法， 可將其以表型形式引入把細(xì)胞。
利用質(zhì)粒表達(dá)載體的基因引入方法是直接將質(zhì)粒DNA引入哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的方法，該方法是受FDA認(rèn)可的可用于人類的方法(Nabel，E.G，et al.，Sde""， 249:1285-1288， 1990)。與病毒載體不同，質(zhì)粒DNA具有均質(zhì) 純化(even purification)方面的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中能夠使用的表達(dá)質(zhì)粒包 括本領(lǐng)域所使用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒。例如，pRK5(歐洲專利第307,247 號(hào))、 pSV16B(國際專利公開號(hào)第 WO 91/08291 號(hào))及 pVL1392(PharMingen),但并不限于此。通過以下方法(但不限于此)， 包含上述核酸的質(zhì)粒表達(dá)載體能夠被引入把細(xì)胞中例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、顯微 注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、磷酸鈞沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚 糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍及其他本領(lǐng)域熟知的 方法(Wu et al.， J. Bio. Chem.， 267:963-967， 1992; Wu and Wu， J. Bio. Chem.， 263:14621-14624， 1988).
另外，包含上述多核苷酸的病毒載體可包括逆轉(zhuǎn)^病毒、腺病毒、皰 瘆病毒、禽痘病毒及慢病毒等，但并不限于此。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的所 有病毒基因均被去除或修飾，因而所述載體的非病毒蛋白可由被感染細(xì)胞 產(chǎn)生。用于基因療法的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)是將大量基因轉(zhuǎn)移到克 隆細(xì)胞內(nèi)、專門整合轉(zhuǎn)移到細(xì)胞DNA的基因以及預(yù)防基因轉(zhuǎn)化后的額外 感染(MUler，A.D.，7Va似re, 357:455-460， 1992)。通過FDA ^人證的逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體利用PA317兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞制備得到(Miller， A.D. and Buttimore， C.， Molec. Cell Biol" 6:2895國2卯2， 1986)。非逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有 如上所述的腺病毒(Rosenfeld et al.， Cell, 68:143-155， 1992; Jaffe et al.， Nature Genetics, 1:372-378， 1992; Lemarchand et al" Proc. Natl. Acad.Sci. USA， 89:6482-6486， 1992)。腺病毒的主要優(yōu)點(diǎn)是可搬運(yùn)大分子DNA 片段(36kb),并可以非常高的滴度轉(zhuǎn)染非克隆細(xì)胞。此外，皰滲病毒也 可用于人類基因療法(Wolfe， J.H.， et al.， Nature Genetics, 1:379-384， 1992)。慢病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，它是從二十世紀(jì)后期通過對HIV骨 架進(jìn)行修飾開發(fā)得到的。與已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同，慢病毒不僅在分 裂細(xì)胞中更為有效，在非分裂細(xì)胞中也更為有效，這是由于其活性不受細(xì) 胞周期的影響。另外，即使是在分裂緩慢的細(xì)胞例如造血干細(xì)胞中，慢病 毒也比其他病毒栽體更為有效，因而在基因治療領(lǐng)域，人們正在利用造血 肝細(xì)胞和角化細(xì)胞進(jìn)行著將慢病毒作為基因轉(zhuǎn)移栽體的研究。此外，本領(lǐng) 域公知的相關(guān)病毒載體也可用于本發(fā)明。
本文所用術(shù)語"可藥用"是指生理學(xué)上所允許，并在給予人體時(shí)通常不 會(huì)引起胃腸障礙和眩暈或其相似反應(yīng)。
可包含可藥用載體例如胃腸外或口服制劑用栽體。胃腸外制劑用載體 可包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸。此外，胃腸外制
劑用栽體可包括水、油、鹽水、水性葡萄糖和乙二醇，以;s^穩(wěn)定劑及防腐
劑。穩(wěn)定劑的實(shí)例有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉和抗壞血酸等抗氧化劑。防腐 劑的實(shí)例有勤L氯銨、對羥基苯曱酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯及氯丁醇。 可藥用載體的列表公開于Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed.， Mack Publishing Company, Easton， PA， 1995。
本發(fā)明的蛋白或其中插入有編碼所述蛋白的多核苷酸的載體可通過 任何本領(lǐng)域公知的方法與所述可藥用載體混合，制成各口服或胃腸外制 劑。同時(shí)，本發(fā)明的肽可通過任何本領(lǐng)域/〉知的方法通過各種途徑給藥。 即，它可通過口服或者胃腸外途徑給藥。等張溶液或懸液等注射制劑及軟 骨劑是理想的胃腸外制劑。注射制劑可使用相關(guān)的^劑、濕潤劑或助懸 劑通過任何本領(lǐng)域公知的方法來制備。例如，可通過將組合物的各組分溶 解于鹽水或緩沖液中，從而將其制為注射制劑。此外，對于口服給藥，可 將本發(fā)明的組合物制成粉劑、顆粒劑、片劑、丸劑皿嚢劑等形式，但并 不限于此，除了活性成分之外，這些制劑還可以含有稀釋劑(例如乳糖、 葡萄糖、蔗糖、甘露醇、纖維素^/或甘氨酸)、潤滑劑(例如二氧化硅、 滑石、硬脂酸及其鎂鹽或者鈣鹽^/或乙二醇)。在各種制劑中，片劑還可 以包含諸如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、西黃蓍膠、甲基 纖維素、羧曱基纖
維素鈉;sj或聚乙烯吡咯烷酮等結(jié)合劑，根據(jù)情況還可包含如淀粉、瓊脂或海藻酸或其鈉鹽等崩解劑、非均勻混合物;sj或吸收劑、著色劑、香味 劑及"f^未劑等。上述組合物可通過混合、顆粒化或包衣等方法制備。
本發(fā)明的藥物組合物可通過各種途徑，根據(jù)任何生物技術(shù)、任何本領(lǐng) 域公知的方法給藥，但不限于此。也就是說，它可通過口服、靜脈內(nèi)、肌 內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、硬膜巧、心內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皿內(nèi)、鼻內(nèi)、胃腸 道、胃腸外、舌下或直腸給藥。
優(yōu)選地，可通過皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑嚢內(nèi)、胸骨內(nèi)、硬 膜下、病灶內(nèi)及頭蓋骨內(nèi)注射或輸注胃腸外給藥。例如，注射制劑形式的
本發(fā)明組合物可通過用4-6 mm注射器注入到皮膚下層或用30號(hào)注射針 輕微穿刺該皮膚即中胚層療法(Messo therapy)給藥，從而給予一定量 的制劑。另外，軟膏劑形式的本發(fā)明藥物組合物可通過直接涂在皮膚上的 方法來給藥。上述"經(jīng)皮給藥"是指將組合物在局部皮膚給藥，使組合物中 含有的活性成分轉(zhuǎn)移到皮膚內(nèi)。尤其，優(yōu)選地，以本發(fā)明的EC-SOD蛋 白為活性成分的組合物應(yīng)直接給予皮膚。此外，本發(fā)明還可以通過與蛋白 質(zhì)轉(zhuǎn)移有關(guān)的生物技術(shù)的方法給藥。
上述本發(fā)明的組合物可以有效預(yù)防疾病的量給予患者。通常一天的有 效量可以為約0.0001至100 mg/kg體重。優(yōu)選為0.01至1 mg/kg體重。本 發(fā)明的組合物的給藥量可根據(jù)各種因素作出合適的決定，例如除了給藥時(shí) 間和給藥途徑外，還有有待治療受試者的年齡、體重、健康狀況、性別、 疾病嚴(yán)重程度、飲食和排泄情況。
此外，本發(fā)明還提供用于制備EC-SOD蛋白的方法，所述方法包括 以下步驟
(a) 將編碼EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表達(dá)載體；
(b) 將上^達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
(c) 培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而表達(dá)EC-SOD蛋白；
(d) 收集表達(dá)的EC-SOD蛋白的包含體；及
(e) 溶解上述包含體，并誘導(dǎo)所述EC-SOD蛋白重新折疊。 將編碼EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表達(dá)載體的步驟(a)可通過
利用本領(lǐng)域公知的常規(guī)重組DNA技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。上述編碼EC-SOD的多核 苷^A指能夠編碼天然EC-SOD蛋白或重組EC-SOD蛋白的多核苷酸， 優(yōu)選為具有選自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6的^J^ 序列，但并不限于此。上述多核苷酸可使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子通過PCR擴(kuò)增來制備?；蛘?，也可通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用自動(dòng)DNA合 成儀(Biosearch或Applied Biosystems所銷售的)來合成DNA序列。 表達(dá)栽體可使用本領(lǐng)域中通常使用的表達(dá)載體，并可根據(jù)宿主細(xì)胞來作出 適當(dāng)?shù)倪x擇。例如宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞時(shí)，可使用pET28a載體 (Novagene，美國)。本發(fā)明的制備方法旨在大量表達(dá)和生產(chǎn)EC-SOD,因 此可對任何表達(dá)栽體進(jìn)行適當(dāng)選擇和使用，只要它可以實(shí)現(xiàn)這一 目的。
本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體及病毒載體等， 但并不限于此。
適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體除包含啟動(dòng)子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、 多腺苷化信號(hào)及增強(qiáng)子(刺激基因)等表達(dá)調(diào)控序列之外，還包含膜打靶 序列、分泌信號(hào)序列、前導(dǎo)序列，并可4艮據(jù)目的制備。本發(fā)明的啟動(dòng)子可 以是組成型(constitutive)或誘導(dǎo)型(inducible),另外，表達(dá)載體還包含 篩選含有載體的宿主細(xì)胞的篩選標(biāo)記，并且表達(dá)栽體可復(fù)制時(shí)可包含復(fù)制 起點(diǎn)。
將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中從而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的步驟(b)包括將 核酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的任何方法，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的轉(zhuǎn)化技 術(shù)來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述技術(shù)包括微彈轟擊(microprojectile bombardment)、電穿孔、磷酸鉀沉淀、氯化鉀沉淀、PEG介導(dǎo)的融合、 顯微注射法及脂質(zhì)體介導(dǎo)法等，但并不限于此。
此時(shí)，宿主細(xì)胞可為原核或真核細(xì)胞。但是，優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞 可包括如大腸桿菌(Esc/reWc/ifVi co/i)、枯草桿菌(5acf7/"ssn6說fe)、鏈霉 菌(5^印to附y(tǒng)ces )、假單胞菌(戶wwfo附o/ias)、奇異變形桿菌(iVote"s 柳'ra6戰(zhàn)s)或葡萄球菌OSto/ /^/0COCc附)等原核宿主細(xì)胞，真菌(例如曲霉菌 04s/wg肌"s)、酵母(例如巴斯德畢赤酵母(P/cA/tf/wwtor/"、釀酒酵母 (5ViccAfl/v考ces cem^w'fle)、裂殖酵母(5^AfeftSflccAflro考ces)、粗糙鏈孢菌 (iVeww/wni c/Yma))等低等真核細(xì)胞，來源于昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺 乳動(dòng)物細(xì)胞等高等真核細(xì)胞，但并不限于此。更優(yōu)選地，本發(fā)明可使用大 腸桿菌作為宿主細(xì)胞。
培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而表達(dá)EC-SOD蛋白的步驟(c)包括在 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)EC-SOD蛋白所需的適合的培養(yǎng)基中和條件下培 養(yǎng)所述細(xì)胞。培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞從而在該細(xì)胞中表達(dá)蛋白的方法是本領(lǐng) 域公知的，例如，可通過下述方法誘導(dǎo)蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種到適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)所述細(xì)胞，將此預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)基中， 然后在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
上述(d)步驟中的收集包含體可使用分離和收集不溶性包含體的公知 的方法進(jìn)行，例如，通過離心從細(xì)胞沉淀物中收集包含體。
上述(e)步驟中的溶解包含體并誘導(dǎo)該包含體重新折疊可通過本領(lǐng)域 公知的任何常規(guī)方法進(jìn)行。例如，可通過下述方法來進(jìn)行將該包含體溶 解于含有蛋白變性劑的緩沖溶液中，將該溶液吸附于金屬親和樹脂柱，并 在降低變性劑的濃度下誘導(dǎo)所述包含體重新折疊。
例如，溶解上述包含體并誘導(dǎo)所述包含體重新折疊可通過如下方法進(jìn) 行將所述包含體溶解于含作為變性劑的8M脲(urea)的Tris緩沖溶液(8M 脲，50mM Tris-Cl， 100mM NaCl)，將所述溶液吸附到填充金屬親和性樹 脂的柱，并用含lM脲的Tris緩沖溶液給予柱以濃度梯度，逐漸去除脲， 從而誘導(dǎo)所述包含體重新折疊。然后，可通過如下方法獲得純的重新折疊 的蛋白將與上述柱吸附性強(qiáng)的洗脫緩沖溶液或PH值低(一般為4以下) 的洗脫緩沖溶液從上至下流過該柱，從而從柱的下部流出。例如，純的重 新折疊的蛋白可通過如下方法獲得將含有咪唑(一般為1M)的與金屬 親和性層析柱的吸附性強(qiáng)的洗脫緩沖溶液從上至下流過上述柱，從而從柱 的下部流出。為了提高蛋白產(chǎn)量，優(yōu)選以這樣一種方式來將洗脫緩沖溶液 投入到柱內(nèi)，即其濃度隨著流過時(shí)間逐漸增加，即所述溶液具有一個(gè)濃度 梯度。
本發(fā)明的EC-SOD蛋白的制備方法還可以包括步驟(f):利用凝膠過 濾柱分離、純化。之后可才艮據(jù)指定用途進(jìn)行各種分離和純化方法，包括另 外的純化、濃縮和溶劑交換。例如，可對所得到的EC-SOD蛋白單獨(dú)或 者聯(lián)合進(jìn)行諸如鹽析(硫酸銨沉淀及磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(使用丙酮、 乙醇等的蛋白級分沉淀法)、透析、凝膠過濾、離子交換、離子交換層析、 反相柱層析及親和層析等技術(shù)的處理。
步驟(f):利用^過濾分離和純化EC-SOD
本發(fā)明使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，記載 在下述文獻(xiàn)(Sambrook， J.， Fritsch， E. F. and Maniatis， T" Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy， T. J.， Bennan, M. L. and Enquist， L. W" Experiments with Gene Fusions, Cold Spring HarborLaboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al" Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987))。
如上所述，其中插入有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體以 有效的量給予有需要的個(gè)體，從而預(yù)防或者治療血管發(fā)生引起的疾病或變 應(yīng)性疾病。此外，所述載體也可用于制^4f對血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或變應(yīng) 性疾病的治療劑。
發(fā)明效果
如上所述，EC-SOD蛋白或具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸 的載體可有效抑制誘導(dǎo)血管發(fā)生的VEGF及MMP-9的表ii^而抑制血 管發(fā)生。因此，所述EC-SOD蛋白或所述栽體可用于預(yù)防或者治療血管 發(fā)生介導(dǎo)的疾病。同時(shí)所述EC-SOD蛋白或所述具有編碼所述EC-SOD 蛋白的多核苷酸的載體還可有效抑制誘發(fā)變應(yīng)性疾病的Th2細(xì)胞的過分 化、抑制轉(zhuǎn)錄因子(NF-KB)并減少人肥大細(xì)胞的脫顆粒化。因而，所述 EC-SOD蛋白或所述載體可用于變應(yīng)性疾病的預(yù)防或者治療。且本發(fā)明的 EC-SOD蛋白制備方法可用于大,制備具有上述活性的EC-SOD蛋白。 因此，本發(fā)明的方法可在工業(yè)上得到利用。


圖1是表示對本發(fā)明的重組EC-SOD蛋白進(jìn)行快速蛋白純化液相色 譜的結(jié)杲的語圖((A:線性平衡區(qū)間，B:上樣區(qū)間，C:柱洗滌區(qū)間，D:重新折 疊區(qū)間，E:重新折疊平衡區(qū)間，F(xiàn):洗脫區(qū)間，G:柱洗滌區(qū)間，X軸:時(shí)間及 體積(小時(shí):分鐘:秒，mL)， Y軸:UV密度(單位))。
圖2是考馬斯藍(lán)蛋白染色的照片，示出本發(fā)明重新折疊及純化的重組 EC-SOD蛋白的SDS-PAGE結(jié)果((M:分子量大小標(biāo)記物，A:用8MJi^ 沖溶液洗脫的包含體(重新折疊純化之前)，B:沒有吸附到柱而被洗脫的 包含體雜質(zhì)，C:重新折疊純化后的洗脫的EC-SOD， D:脫鹽純化后超濾濃 縮的EC-SOD)。
圖3是利用抗-EC-SOD蛋白抗體將重組EC-SOD蛋白進(jìn)行蛋白印跡 的結(jié)果(SM:大小標(biāo)記物，1:對照組(HaCaT人類EC-SOD)， 2:本發(fā)明 的重組EC-SOD蛋白)。圖4是純化步驟過程中EC-SOD活性的圖(209 FT:純化過程中被洗 脫而沒有被吸附的樣本，209 El:通過金屬親和層析重新折疊的初次純化 的重組蛋白EC-SOD蛋白，209 E2:凝膠-過濾柱分離、純化的重組 EC-SOD蛋白)。
圖5是示出HaCaT細(xì)胞中的重組EC-SOD蛋白的活性被
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UVB照射和EC-SOD處理)。
圖6是示出紫外線照射致使小鼠皮fel生形態(tài)變化的照片(A:野生 型小鼠，B: EC-SOD it^達(dá)小鼠，C:UVB照射的野生型小鼠，D: UV照射 的EC-SOD過表達(dá)小鼠)。
圖7是UV照射小鼠組織中的VEGF表達(dá)的蛋白印跡結(jié)果。肌動(dòng)蛋 白作為內(nèi)參(WT:野生型小鼠，TG: EC-SOD it^達(dá)小鼠)。
圖8是示出通過使用免疫組織化學(xué)法分析UV照射的小鼠的 VEGF表達(dá)情況的照片(A:野生型小鼠，B: EC-SOD #達(dá)小鼠，C:UV 照射的野生型小鼠，D: UV照射的EC-SOD過表達(dá)小鼠)。
圖9是UV照射的小鼠的MMP-9的表達(dá)情況的酶譜圖(泳道l:野生 型小鼠，泳道2: EC-SOD it^達(dá)小鼠，泳道3: UV照射的野生型小鼠， 泳道4: UV照射的EC-SOD it^達(dá)小鼠)。
圖10是UV照射的角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明重組EC-SOD處理后，通 過免疫組織化學(xué)法所示其VEGF表達(dá)情況的照片(A:對照組，B: UVB照 射，C:重組EC-SOD處理+UVB照射，D:重組EC-SOD處理)。
圖11是確定經(jīng)過重組EC-SOD蛋白處理是否對T細(xì)胞的增殖有影響 的結(jié)果(Neg:陰性對照)。
圖12是通過鑒定IL-4的分泌水平來確定經(jīng)過重組EC-SOD蛋白處理 是否對T細(xì)胞的分化有影響的結(jié)果(neg.:陰性對照，-:只用抗原(Ova肽) 處理，p:同時(shí)用抗原(Ova肽)和含有EC-SOD的PBS處理，NB:同時(shí)用 抗原(Ova肽)和含有EC-SOD的硼酸鈉處理)。
圖13是通過鑒定EL-4和IFN- Y的分泌水平來確定經(jīng)重組EC-SOD 蛋白處理是否對T細(xì)胞的分化有影響的結(jié)果(neg.:陰性對照，-:只用抗原 (Ova肽)處理)。
圖14是將Ova蛋白和免疫輔助劑CFA(完全弗氏佐劑)給予it^" 類EC-SOD蛋白的小鼠時(shí)，EC-SOD對細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的生成的影響的結(jié)果。
圖15是將Ova蛋白和免疫輔助劑Alum(氫氧化鋁)給予it^ii^類 EC-SOD蛋白的小鼠時(shí)，EC-SOD對細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的生成的影響的 結(jié)果。
圖16是重組EC-SOD蛋白對NF-KB抑制的影響結(jié)果(對照EC-SOD 轉(zhuǎn)化但未經(jīng)UV照射的HaCaT細(xì)胞，UVB: UVB照射(100 J/m2)的 HaCaT細(xì)胞，EC-SOD/UVB :經(jīng)EC-SOD蛋白和UVB照射(100J/m2) 處理的HaCaT細(xì)胞)。
圖17是示出重組EC-SOD蛋白對肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制效果圖(A) 及其顯微照片(B )(對照未經(jīng)處理的人類肥大細(xì)胞組，EC-SOD: EC-SOD 處理的組，A+P:細(xì)胞內(nèi)鈞濃度高的組，A+P+EC-SOD :事先用EC-SOD 處理且細(xì)胞內(nèi)鉀濃度高的組)。
具體實(shí)施例方式
以下，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。然而，應(yīng)理解，提供這些實(shí)施例僅 為說明，并且不能將其理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
試驗(yàn)例1:制備過表達(dá)EC-SOD的小鼠
首先，按照如下方法制備it^達(dá)小鼠EC-SOD的小鼠。同時(shí)，上述小 鼠EC-SOD的>^序列和#^酸序列分別記載于SEQ ID NO: 5以及 SEQ ID NO: 6'
使用8-10周齡的BDF1小鼠(韓國中央實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)作為野生型BDF1 小鼠。EC-SOD狄達(dá)小鼠是使用8-10周齡的BDF1小鼠按照公知的方 法而制備(H. Y. Ha. et.al" Biochem Biophys Res Commun, 348: 450-458， 2006)。在本實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的使用得到了韓國加圖立大學(xué)加圖立學(xué)院(the Catholic Institute, The Catholic University of Korea)的批準(zhǔn)。
具體而言，從韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)學(xué)院購入雜交小鼠(C57BL/6 XCBAF1)。為誘發(fā)超數(shù)排卵，間隔48小時(shí)將各5IU的孕馬血清促性腺 激素(PMSG， pregnant mare's serum gonadotropin)和人類絨毛膜促性 腺激素(hCG， human chrionic gonadotropin)J^內(nèi)注射給雌性小鼠， 之后與同一品系的雄性小鼠以1: l合籠。第二天早晨觀察是否有陰栓，
20隨后將有陰栓的個(gè)體處死，切取輸卵管，從輸卵管膨大部獲取受精卵。培
養(yǎng)基使用含有0.4%牛血清白蛋白(BSA)的M16培養(yǎng)基。
為了獲得已經(jīng)在皮膚組織中誘導(dǎo)EC-SOD過表達(dá)的小鼠，將包含小 鼠EC-SOD的cDNA ( SEQ ID NO: 6)的pCRII TOPO載體(由翰林大 學(xué)醫(yī)學(xué)院的Suh Jim-Gyo教授提供)用限制性內(nèi)切酶消化，并將小鼠 EC-SOD的eDNA部分插入到包含人類角蛋白K14啟動(dòng)子的pBS KS栽 體。同時(shí)，在此載體中插入雞卵清蛋白(ovalbumin)多聚腺苷(A),幫助 在體外表達(dá)。為了在受精卵里注入DNA，將表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶 Hind和Xhol剪切。用限制性內(nèi)切酶剪切的DNA在1%瓊脂糖^H上 電泳，通過透析回收，然后用苯酚氯仿純化。并將其在10 mM Tris (pH 7.4/ 0.2mM EDTA)中透析使最終濃度為4 ng/l。將包含外源基因的DNA溶液 注入單細(xì)胞期胚胎的原核。將注入有外源基因的胚胎培養(yǎng)到二細(xì)胞期后， 從所培養(yǎng)的胚胎中篩選健康的胚胎。將發(fā)情的雌性ICR小鼠與雄性小鼠 合籠，第二天確認(rèn)是否存在陰栓，并將具有陰栓的小鼠用作代孕母親。收 集很好地發(fā)育到二細(xì)胞期的大約15-20個(gè)胚胎，并將其移植到假孕受者的 輸卵管膨大部，隨后將肌肉層和表皮層各自縫合。將移植后產(chǎn)下的動(dòng)物養(yǎng) 到3周左右。接下來，將它們的尾巴切下lcm左右，并用裂解緩沖液在 55。C下處理，將苯酚加入其中來萃取基因組DNA。將上述基因組DNA 利用下述的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而確定其是否已被轉(zhuǎn)化。進(jìn) 行PCR擴(kuò)增的條件是在941C下事先變性，然后進(jìn)行如下30個(gè)循環(huán) 94t:下30秒、51"下30秒和72.5°(3下45秒，最后在72.5。C下進(jìn)行最后 一次為期5分鐘的延伸。
正義引物(SEQIDNO:7)
5，- TTG TCT CTA ATA GAG GGT C-3'
反義引物(SEQIDNO:8)
5'-TCA AGC CTG TCT ATC TTC T-3'
同時(shí)，過表達(dá)人類EC-SOD的小鼠是從美國科羅拉多 Jewish國立醫(yī)療研究中心(National Jewish Medical & Research Center) (Oury et al. JBC 268 (21): 15394， 1993)。
實(shí)施例l具有生物學(xué)活性的重組EC-SOD蛋白盾的制備 <1-1>克隆融合的EC-SOD基因用于表達(dá)重組EC-SOD蛋白為了制備具有生物學(xué)活性的重組EC-SOD蛋白，通過以下方式克隆 重組EC-SOD,其由209個(gè)M酸組成，包括N端缺失信號(hào)肽的人類 EC-SOD,并且C端缺失13個(gè)氨基酸。上述重組EC-SOD的>5^序列和 氨基酸序列分別記栽于SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 1，上itA類 EC-SOD的4^序列和^J^酸序列分別記載于SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO; 3。
將包含人類EC-SOD cDNA(SEQ ID NO: 4)的pUC 18-hEC-SOD(瑞 典臨床化學(xué)中心的Marklund教授提供)的載體作為模板，利用下述引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由此制備人類EC-SOD的cDNA。
正義引物(SEQ ID NO: 9)
5' - tagattctggacgggcgagga畫3,
反義引物(SEQ ID NO: 10)
5' -tactcgagtcactctgagtgct-3 ，
使用p/"J聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件是在95'C下事先變性5分 鐘，然后進(jìn)行以下30個(gè)循環(huán)95。C下30秒、55。C下30秒和72。C下1 分鐘，最后在72'C下進(jìn)行最后一次為期5分鐘的延伸。擴(kuò)增的基因產(chǎn)物 以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol消化，然后使用T4連接酶在4X:連接12 小時(shí)，從而將其連接到由相同限制性內(nèi)切酶酶消化的pET28a載體 (NovaGene，美國)中。
將上述載體轉(zhuǎn)染于大腸桿菌DH5a，然后將上述轉(zhuǎn)化體在含有 25mg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并對培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn) 行篩選。通過實(shí)施基因序列分析來確認(rèn)篩選出的轉(zhuǎn)化體中是否正確地插入 有EC-SOD基因。從被確認(rèn)其中插入有重組EC-SOD基因的轉(zhuǎn)化體中分 離載體。將該載體插入到it^達(dá)用宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(NovaGene，美 國)中，并在含25mg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)篩 選it^達(dá)EC-SOD蛋白的菌株。
<1-2>重組EC-SOD蛋白質(zhì)的表達(dá)
將在上述實(shí)施例1-1中篩選的菌林在37。C下于含有25 mg/mL卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在該細(xì)胞的OD(光密度)在600 nm下達(dá)到 0.6時(shí)，向其中添加IPTG(lmM)，從而誘導(dǎo)EC-SOD蛋白質(zhì)的表達(dá)，并在37。C下中將該細(xì)胞培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)，從而在該細(xì)胞中表達(dá)重組EC-SOD 蛋白質(zhì)。
<1-3>重組EC-SOD蛋白的重新折疊的誘導(dǎo)及純化
表達(dá)結(jié)束后，通過離心從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞，并將收集到的細(xì)胞懸浮 于含100 mM氯化釣的50 mM Tris緩沖液(pH 7.5),之后用超聲粉碎機(jī) 破壞細(xì)胞。將細(xì)胞懸液離心，分離沉淀層后用含100mM氯化鉀的50 mM Tris緩沖液洗滌3次。被洗滌的細(xì)胞沉淀物里含有不溶性蛋白質(zhì)包含體。 10 mg被洗滌的包含體(融合蛋白質(zhì)含量50% ) Tris緩沖液(50 mM Tris-Cl， 100 mM NaCl， pH 7.5)后添加8M脲進(jìn)行溶解。在使包含體在常 溫完全混懸2個(gè)小時(shí)后，使其通過離心進(jìn)行相分離，因上層的水溶液層含 有被溶解的重組EC-SOD蛋白質(zhì)包含體，因此收集此溶液(包含體溶液)。
利用'fe速蛋白純化液相色諉(FPLC， Fast Protein Purification Liquid Chromatography),按照以下方式進(jìn)行重組EC-SOD蛋白的重新折疊和純 化。將緩沖溶液(8 M脲、50 mM Tris-Cl、 100 mM NaCl， pH 7.5)以lml/min 的流速引入到填充有金屬親和樹脂的色鐠柱(HisTrap FF crude 5mL， GE Healthcare,美國)中，以平衡該柱，然后將上面獲得的包含體溶液5 ml 以1 ml/min的流速自上而下注入填充有金屬親和樹脂的色譜柱(3ml)中， 從而使得折疊的蛋白被吸附到柱子中的固體基質(zhì)上。
注射結(jié)束^^后，將上述緩沖溶液50 ml以1 ml/min的流速自上而下 注入到柱子中，從而除去未被吸附的固體。如上述方法將柱內(nèi)細(xì)胞殘?jiān)?全去除后，將Tris緩沖液(50 mM Tris緩沖溶液、1M脲、100 mM NaCl、 100 mM ZnCl2、 50 mM CuS04， pH 7.5)以0.5 ml/min的流速自上而下 注入到柱子中，所述Tris緩沖液含有影響EC-SOD活性的1 M脲并包含 Zn和Cii,同時(shí)給予線性濃度梯度，由此逐漸減少柱內(nèi)的變性劑濃度。因 此，金屬離子(Zn和Cu)被全部替換為具有天然三維結(jié)構(gòu)的目標(biāo)蛋白， 因而被吸附到該固體基質(zhì)上的折疊蛋白被重新折疊，從而具有活性。
之后將含2 M咪唑和1 M脲的具有濃度梯度的TRIS緩沖液自上而 下上柱。在將咪唑濃度為0.5M的洗脫緩沖液提供給柱子時(shí)，就會(huì)洗脫掉 重新折疊的融合蛋白(參照圖l)。
<1-4>重組EC-SOD蛋白質(zhì)的分離和純化為從上述實(shí)施例1-3中所獲得的洗脫蛋白質(zhì)中除去大量的咪唑，使 所述蛋白徹底折疊并按照大小分離所述蛋白，利用了快速蛋白純化 液相色譜(FPLC)和凝膠過濾色譜柱(Sepharose 12柱)。在此方法中，將 Tris緩沖溶液(50 mM Tris-Cl、 100 mM NaCl, pH 7.5)或磷酸鹽緩沖鹽 水(pH 7.5)以0.5 mL/min的流速自上而下注入該柱子中，從而 分離及純化。分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)以超濾法濃縮。
結(jié)果，獲得了本發(fā)明的重組EC-SOD蛋白質(zhì)。同時(shí)每個(gè)純化步驟中 的樣本均用SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，重組EC-SOD蛋白被4艮 好地分離出來。
<1-5>通過蛋白印跡鑒定重組EC-SOD蛋白質(zhì)
為了檢測實(shí)施例1-4中分離和純化的重組EC-SOD蛋白是否大體為 EC-SOD,實(shí)施了蛋白印跡。使用由人角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)HaCaT 細(xì)胞(由德國癌癥研究所(Cancer Resaerch)的N. Fusenig教授提供)表 達(dá)的人類EC-SOD作為EC-SOD的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。將由HaCaT表達(dá)的人 類EC-SOD和實(shí)施例1-4中分離和純化的EC-SOD蛋白質(zhì)用10%的聚丙 烯酰胺凝膠電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移到偏氟乙烯膜(GelmanLaboratory, MI，美國)。然后，將偏氟乙烯膜以5%的脫脂奶粉封閉，并與抗-EC-SOD 多克隆抗體(l: 500，圣克魯茲，美國)一起孵育。將膜用水洗滌，并與 綴合有過氧化物酶的二抗IgG(圣克魯茲，美國)一起孵育，再次水洗后， 利用ECL試劑盒(GEHealthcare,美國)按照制造商的說明書來顯色。
結(jié)果如圖3所示，人EC-SOD (泳道l)表現(xiàn)出陽性應(yīng)答，分離和純 化的重組EC-SOD蛋白(泳道2)中也檢測出陽性應(yīng)答。U明，純化的 蛋白為人類EC-SOD。
<1-6>重組EC-SOD蛋白的活性檢測
為了檢驗(yàn)上述分離和純化的重組EC-SOD蛋白是否具有SOD的生 物學(xué)活性，利用SOD Assay Kit-WST(Dojindo Molecular Technology,美 國)按照制造商的說明書對重組EC-SOD蛋白的活性進(jìn)行了測試。
結(jié)果如圖4所示，純化過程中被洗脫但未被吸附的樣本(209FT)不顯 示活性，通過金屬親和色譜柱重新折疊的初次純化的重組EC-SOD蛋白 (209 El)所表現(xiàn)出的活性為250單位/mg蛋白質(zhì)，通過凝膠過濾柱分離和
24純化的重組EC-SOD蛋白(209 E2)所表現(xiàn)出的活性為360單位/mg蛋白 質(zhì)。
<1-7>分離和純化的重組EC-SOD蛋白的ROS去除效果的檢驗(yàn)
為了檢測重組EC-SOD蛋白在HaCaT細(xì)胞中的ROS(活性M)去除
效果，將實(shí)施例1-4中分離純化的重組EC-SOD蛋白按如下方式進(jìn)行處理。
將皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞以1X104個(gè)細(xì)胞/蓋玻片的濃度接 種于18 mm蓋玻片上，然后在含有10。/o胎牛血清(FBS， GIBCO)及100 單位青霉素和100 g鏈霉素/mL的培養(yǎng)基各1%的IMDM (Isocove，s modified Dulbecco's medium, GIBCO)培養(yǎng)基中于5% C02、 37匸下培養(yǎng)。 粘附的細(xì)胞匯合達(dá)到約30-40%時(shí)，去除胎牛血清，然后培養(yǎng)該細(xì)胞。當(dāng) 細(xì)胞匯合達(dá)到50-60%時(shí)，將該細(xì)胞用10照EC-SOD蛋白預(yù)處理。在將 細(xì)胞用劑量為100 J/m2的UVB照射3小時(shí)后，使該細(xì)胞與10 mM DCFH-DA在37'C下反應(yīng)30分鐘，并用熒光顯微鏡觀察。熒光顯微照片 用Zeiss數(shù)碼相機(jī)拍攝。
其結(jié)果如圖5中所示，在細(xì)胞僅由UVB照射的UBV組，ROS未能 被去除，但在細(xì)胞由UVB照射并由本發(fā)明的EC-SOD蛋白處理的 EC-SOD + UVB組，ROS被有效地去除。
實(shí)施例2天然EC-SOD蛋白盾對血管發(fā)生的抑制效杲 <2-1> EC-SOD表達(dá)小鼠和野生型小鼠的形態(tài)學(xué)比較 將試驗(yàn)例1中制備的EC-SOD W達(dá)小鼠和野生型BDF1小鼠每一 只的背部皮膚用劑量為2kJ/n^UVB照射四次，每次間隔24小時(shí)。具體 而言，在進(jìn)行UVB照射前的兩天，將每只小鼠的背部皮膚進(jìn)行剃毛作業(yè)， 并使用六盞UVB燈(FS24T12/UVB/HO， 2卯-320 nm， Voltare公司 Fairfeild， CT，美國)對8周齡的24只小鼠進(jìn)行劑量為200 mJ/cm2的UVB 照射，這六盞燈的波長范圍介于280nm-340nm之間，并在305 nm處具 有最高能量。UVB照射期間，控制燈的高度，從而以0.3mW/cii^的劑量 照射每只^醉的小鼠的背部皮膚表面。各組(每組6只小鼠)小鼠每隔 24小時(shí)用UVB照射四次，并在第四次UVB照射后1小時(shí)，將小鼠處死 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。切開每只被處死小鼠的背部皮膚并進(jìn)行肉目(見察，并將觀察結(jié)果記錄在圖6。
如圖6所示，與沒有用UVB照射的小鼠的情況(圖6A)相比，在
用UVB照射的野生型小鼠的情況(圖6C)下，血管發(fā)生---種皮膚
炎癥反應(yīng)和紅斑凈皮顯著誘導(dǎo)。但是在EC-SOD過表達(dá)小鼠中，在UVB照射前(圖6B)和UVB照射后(圖6D)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的差異。即，能夠觀察到，在野生型小鼠中由UV光(UVB)照射誘導(dǎo)的血管發(fā)生，在EC-SOD過表達(dá)小鼠(圖6D)中被顯著地抑制。這些結(jié)果表明，EC-SOD蛋白起到抑制血管發(fā)生的作用。
<2-2>蛋白印跡
利用蛋白印跡分析了試驗(yàn)例1中所制備的EC-SOD it^達(dá)小鼠中，誘導(dǎo)血管發(fā)生的血管內(nèi)細(xì)胞生長因子(VEGF)的表達(dá)水平。
將實(shí)施例<2-1>中處死的EC-SOD it^達(dá)小鼠和野生小鼠每一只的背部皮膚組織或細(xì)胞用萃取溶液(50 mM的Tris HC1 pH 8.0， 5 mM的EDTA， 150 mM的NaCl， 0.5%的脫氧膽酸鈉，1%的Nonidet P國40，0.1%的SDS，lmM的PMSF，lmM的NaF， 1 mM的NaV04和蛋白酶抑制劑混合物(德國羅氏)勻漿并萃取。為了確定蛋白質(zhì)濃度，采用 Bio-Rad 蛋白質(zhì)試劑(Bio-Rad， CA，USA)，并將牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。將上述蛋白質(zhì)萃取物在10%的聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Gelman Laboratory, MI，
美國)。然后，以5%的脫脂奶粉封閉上述聚偏二氟乙烯膜，然后與抗-VEGF 多克隆抗體(l: 500， 圣克魯茲，
美國)和抗P-肌動(dòng)蛋白抗體中的每一種一起孵育。將膜用水洗滌，并與綴合有過氧化物酶的二抗IgG (圣克魯茲，美國)一起孵育，再次水洗后，利用ECL檢測試劑顯色。
結(jié)果如圖7所示，由于UYB照射，野生型小鼠中的VEGF的表達(dá)水平增加，而在UVB照射的EC-SOD it^達(dá)小鼠中的VEGF的表達(dá)明顯減少。這些結(jié)果再次確定，EC-SOD具有抑制血管發(fā)生的效果。
<2-3>免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)
通過免疫組織化學(xué)方法再次檢測了 EC-SOD是否抑制VEGF的表達(dá)。將<實(shí)施例2-1>中處死的EC-SOD it^達(dá)小鼠和野生型小鼠每一只的背部皮膚組織用0.5M的磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)制成的4%的多聚曱醛固定。然后以自來水沖洗固定組織，用乙醇脫水、用石蠟包埋，以5mm厚度切片，并貼到載玻片上。將上述切片用二曱苯溶,蠟，用乙醇水化，然后用蘇木精和伊紅染色。對脫蠟的組織切片用3%的過氧化氫溶液進(jìn)行處理從而進(jìn)行封閉。為了減少非特異性結(jié)合和背景染色，以10%的山羊血清處理上述切片。對各組織切片以抗-VEGF多克隆抗體(l: 500，圣克魯茲，美國)處理后，利用鏈親和素-生物素試劑盒(LSAB，Dako，CA，美國)，通過卵白素-生物素-免疫過氧化物酶復(fù)合物方法進(jìn)行可視化。將染色的組織用水洗滌，然后以3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑顯色，而后以0.2。A的邁爾蘇木精(sigma，MO，美國)進(jìn)行襯染。染色結(jié)果示于圖8。
如圖8所示，野生型小鼠經(jīng)UVB照射后高度表達(dá)VEGF，而EC-SODit^達(dá)小鼠與野生型小鼠相比，VEGF的表達(dá)凈皮顯著抑制。這些結(jié)果與實(shí)施例1-2的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，天然EC-SOD具有在體內(nèi)抑制誘導(dǎo)血管發(fā)生的VEGF表M而抑制血管發(fā)生的效果。
<2-4>EC-SOD it^達(dá)小鼠中的MMP-9的表達(dá)水平的檢測降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的MMP蛋白質(zhì)與VEGF同樣是血管發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。特別是MMP9作為通過VEGF-VEGFR系統(tǒng)調(diào)節(jié)腫瘤血管發(fā)生過程的因子已是公知的(Bergers et al.， Nat. Cell Biol.， 2: 737-744，2000)。
因此，發(fā)明人檢測了 UVB照射的EC-SOD it^達(dá)小鼠中的MMP-9的表達(dá)水平.
將實(shí)施例2-1中處死的EC-SOD it^達(dá)小鼠和野生型小鼠的背部皮膚組織與1 mg/ml明膠(100 mg/ml)混合，并進(jìn)行SDS-PAGE。然后將凝膠用2.5%曲拉通X-100 ( TRITON X-100 )處理20分鐘，并用水洗滌。將M^用酶語反應(yīng)溶液(l M Tris (pH7.5)， 1 M CaC12， 5 M NaCl， 0.2mM ZnCl2， 25% TX-IOO， 0.2%
NaNO在37 。C下孵育16個(gè)小時(shí)，染色1小時(shí)，脫色1小時(shí)，然后在烤箱中干燥l小時(shí)。分析干燥的皿，其分析結(jié)果如圖9所示。
如上述圖9所示，紫外線照射前的野生型小鼠和EC-SOD it^達(dá)小鼠的MMP-9表達(dá)水平并無顯著差別。但是，由于UVB照射，野生型小鼠的MMP-9的表達(dá)增加，但EC-SOD it^達(dá)小鼠相比野生型小鼠，其 MMP-9的表達(dá)被顯著地抑制。
從上述結(jié)果得知，天然EC-SOD蛋白在體內(nèi)抑制VEGF的表達(dá)，而 且還抑制MMP-9——其通過VEGF-VEGFR系統(tǒng)參與血管發(fā)生相關(guān)信號(hào) 傳遞一一的表達(dá)，從而有效地抑制血管發(fā)生。
實(shí)施例3重組EC-SOD蛋白質(zhì)對血管發(fā)生的抑制效應(yīng) 檢測了實(shí)施例1中分離和純化的重組EC-SOD蛋白質(zhì)是否有抑制血 管發(fā)生的效果。將角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞以lX10"個(gè)細(xì)胞/蓋玻片的濃 度接種于18 mm蓋玻片。然后在含有10%胎牛血清(FBS， GIBCO)以及 100單位青霉素和100 g鏈霉素/mL的培養(yǎng)基各1%的DME (Dulbecco，s minimum essential medium, GIBCO)培養(yǎng)基中于5% C02、 37。C下培養(yǎng)。 粘附細(xì)胞的匯合達(dá)到30-40%時(shí)，去除胎牛血清，然后將該細(xì)胞培養(yǎng)24 小時(shí)。細(xì)胞匯合(confluent)達(dá)到50-60%時(shí)，用10將EC-SOD預(yù)處理該細(xì) 胞。在將細(xì)胞用純化的重組EC-SOD蛋白處理30分鐘后，用劑量為100 J 的UV光處理該細(xì)胞，并在24小時(shí)后，用多聚曱醛固定該皮膚角質(zhì)形成 細(xì)胞，并且實(shí)施免疫染色。將固定的細(xì)胞利用10%正常山羊血清封閉， 并用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗3 次。 為了對 VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)進(jìn)行免疫染色，將細(xì)胞用兔 抗 -VEGF 抗體(圣克魯茲，美國)處理，然后在 4°C 孵育至少 16個(gè)小時(shí)。然后，將細(xì)胞用FITC綴合的抗-小鼠-IgG 二抗(zymed， 美國)進(jìn)行熒光染色，隨后用熒光顯微鏡(CarlZeiss,德國)觀察。
結(jié)果如圖10所示，與沒有照射UVB的對照組相比，在細(xì)胞 照射UVB的UVB組中，細(xì)胞中VEGF的表達(dá)顯著增加。而且，在細(xì)胞 進(jìn)行UVB照射的EC-SOD/UVB組中，VEGF的表達(dá)被顯著抑制，i1^ 明血管發(fā)生被重組EC-SOD蛋白質(zhì)抑制。
實(shí)施例4:重組EC-SOD蛋白對T細(xì)胞的增殖及分化的影響 <4-1>重組EC-SOD對T細(xì)胞的增殖的影響的檢測 EC-SOD是否對免疫T細(xì)胞產(chǎn)生影響，使用特異性抗原(卵清蛋白) 反應(yīng)性TCR(T細(xì)胞受體)轉(zhuǎn)染的小鼠(DO.ll.lO，浦航工業(yè)大學(xué) Young-Chul Sung教授捐贈(zèng))，按照如下方式進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。為了檢測EC-SOD是否對T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，將從上述轉(zhuǎn)染的 小鼠脾臟分離的細(xì)胞同抗原OVA肽一起孵育72小時(shí)，然后與3H孵育 16小時(shí)。隨后測量被培養(yǎng)細(xì)胞的照射劑量從而檢測增殖情況。
結(jié)果如圖11所示，在沒有用EC-SOD處理的組和分別用1 pg/ml和 10 fig/ml EC-SOD處理的組之間，照射劑量僅有一點(diǎn)或者沒有差別，這表 明EC-SOD對T細(xì)胞的增殖僅有一點(diǎn)或者沒有影響。
<4-2>重組EC-SOD對T細(xì)胞的分化的影響的檢測
即使重組EC-SOD對T細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響，它也會(huì)對其分化有 影響。因此測定T細(xì)胞的細(xì)胞因子以檢測T細(xì)胞的分化情況。
脾細(xì)胞與抗原OVA肽一起培養(yǎng)48小時(shí)后，測量培養(yǎng)基內(nèi)生成的 正畫4(白細(xì)胞介素-4)。測定利用ELISA試劑盒(Becton， Dickinson and Company,美國)，按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。
其結(jié)果如圖12所示，EC-SOD減少IL-4的形成。從這一結(jié)果可知 EC-SOD對T細(xì)胞的分化有影響。在圖12中，neg.表示沒有用抗原處理 的試驗(yàn)組，-表示只用抗原(Ova肽)處理的試驗(yàn)組，p表示同時(shí)用溶于PBS 中的抗原(Ova肽)和EC-SOD處理的試驗(yàn)組，NB :同時(shí)用溶于硼酸鈉中 的抗原(Ova肽)和EC-SOD處理的試驗(yàn)組。所有的試驗(yàn)組均在培養(yǎng)基中 處理了 48小時(shí)。
同時(shí)，為了專門檢測本發(fā)曰力的重組EC-SOD對T細(xì)胞分化的影響， 將上述重組EC-SOD蛋白給予到小鼠的T細(xì)胞中，并比較IL-4及IFNi 等細(xì)胞因子的產(chǎn)量。
具體地，使用MACS ( Miltenyi Biotech)，從DO 11.10小鼠(由浦 航工業(yè)大學(xué)Young-Chul Sung教授提供)的脾臟分離CD4T細(xì)胞，該小 鼠it^達(dá)識(shí)別特異性抗原Ova肽的TCR ( T細(xì)胞受體)基因。將作為抗 原呈遞細(xì)胞的正常Balb/c小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行y省線照射后，與Ova肽(l Hg/ml, Ova323-339， peptron公司)和使用MACS分離的CD4 T細(xì)胞一起 在添加有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，將在實(shí)施 例1中分離和純化的重組EC-SOD蛋白添加到上述培養(yǎng)基中。72小時(shí)后， 收集培養(yǎng)基，并通過ELISA(抗體Becton Dickinson)測量培養(yǎng)基中的IL-4 和IFN-y的量。其結(jié)果如圖13所示，實(shí)施例1中分離和純化的重組EC-SOD在T細(xì) 胞中誘導(dǎo)Thl細(xì)胞因子IFN-y的形成，并抑制Th2細(xì)胞因子IL-4的形成。 這表明重組EC-SOD蛋白對免疫細(xì)胞產(chǎn)生影響，尤其對T細(xì)胞的分化產(chǎn) 生影響。
由此可知，本發(fā)明的重組EC-SOD蛋白阻斷誘發(fā)變應(yīng)性疾病的Th2 細(xì)胞的過分化，誘導(dǎo)向Thl細(xì)胞的分化，因而可有利地用于變應(yīng)性疾病 的治療或預(yù)防。
實(shí)施例5:天然EC-SOD蛋白對T細(xì)胞的分化的影響 將Ova蛋白和誘導(dǎo)Thl免疫性的免疫佐劑CFA(完全弗氏佐劑， Sigma公司)與誘導(dǎo)Th2免疫性的Alum(氳氧化鋁，Pierce公司)混合，并 將25照此混合物免疫接種到試驗(yàn)例1中制備的人EC-SOD過表達(dá)小鼠 的足底和尾部。11日后，從產(chǎn)生炎癥的淋巴細(xì)胞中分離細(xì)胞，并觀察 EC-SOD是否對細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的生成產(chǎn)生影響。
在對細(xì)胞增殖的觀察中，在96孔板中培養(yǎng)5xl()S個(gè)淋巴細(xì)胞，培養(yǎng) 3天后，將同位素311放入到培養(yǎng)基中。16小時(shí)后，利用p-計(jì)數(shù)器測定細(xì) 胞中的同位素含量來觀察細(xì)胞增殖。且，為了檢測所述反應(yīng)是否為抗原特 異性反應(yīng)，使用不同量的Ova蛋白觀察細(xì)胞增殖。為了觀察細(xì)胞因子的 表達(dá)，在46孔板中培養(yǎng)5xl(^個(gè)淋巴細(xì)胞，72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基，通 過ELISA測量培養(yǎng)基中的IL-4和IFNi的量。測量結(jié)果記載在圖14和 圖15。
如圖14和圖15所示，觀察到在將誘導(dǎo)Thl分化的CFA作為免疫 佐劑時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖比正常小鼠中的淋巴細(xì)胞的增殖稍微增加，IFlSk/ 的表達(dá)也增加。3E^見察到，在將誘導(dǎo)Th2分化的Alum作為免疫佐劑時(shí)， 淋巴細(xì)胞增殖相對正常小鼠的淋巴細(xì)胞的增殖減少，IL-4的表達(dá)也減少。 從這些結(jié)果可知，EC-SOD對T細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，即它刺激分化為 Thl，抑制分化為Th2。
由此可知，天然EC-SOD阻斷誘發(fā)變應(yīng)性疾病的Th2細(xì)胞的過分化， 誘導(dǎo)向Thl細(xì)胞分化，因而可有利地用于變應(yīng)性疾病的治療或預(yù)防。
實(shí)施例6:重組EC-SOD蛋白對轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制的效果的檢測為了檢測EC-SOD對UV光引起的NF-kB的活性的效果，將HaCaT 細(xì)胞接種到14 mm培養(yǎng)玻片中，然后在包含10。/。胎牛血清的 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。培 養(yǎng)24小時(shí)后，在含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24小時(shí)。 饑餓處理后，將該細(xì)胞用10嗎的EC-SOD預(yù)處理30分鐘，然后，利用 磷酸緩沖鹽水(PBS)將細(xì)胞洗滌3次。為了誘導(dǎo)NF-kb的活化，將該細(xì)胞 用劑量為100J/n^的UV光照射。UV光照射后，將該細(xì)胞立即用磷酸緩 沖鹽水再次洗滌，用10 ng EC-SOD處理，然后再在含1%胎牛血清的 DMEM中培養(yǎng)4小時(shí)。之后，細(xì)胞用甲醇固定并進(jìn)行免疫染色。將固定 的細(xì)胞用10%的正常山羊血清封閉，并用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次。 為了對EC-SOD和NF-kB進(jìn)行免疫染色，將這些細(xì)胞用小鼠抗-EC-SOD 抗體(Labfrontier，韓國)和兔抗-NF-kb抗體(santacuz，美國)于4"C處理至 少16小時(shí)。然后將該細(xì)胞用TRITC(四甲基羅丹明異硫氰酸酯)綴合的抗 -兔-IgG 二抗(serotec，英國)和FITC融合的抗-小鼠-IgG 二抗(zymed，美 國)進(jìn)行熒光染色，然后用Hoechst(Sigma，美國)進(jìn)行襯染。
結(jié)果如圖16 (放大倍數(shù)200 x )所示，可以觀察到，在由EC-SOD 轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞且沒有用UV光照射的對照組，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 沒有被免疫染色的NF-kB, ii^明NF-kB未被活化(圖16A、 D、 G和j)。 還觀察到，在UVB組(其中HaCaT細(xì)胞被劑量為100 J/m2的UVB照射) 中，在細(xì)胞核部位及核周部位，NF-kB被快速活化(圉16B、 E、 H和K)。 與^M目比，還觀察到，在EC-SOD/UVB組(其中HaCaT細(xì)胞由本發(fā)明的 重組EC-SOD蛋白處理并由100 J/ii^的UVB照射)中，細(xì)胞核部位的 NF-kB活化與UVB組相比受到顯著抑制(圖16C、 F、 I和L)。從上述結(jié) 果可知，本發(fā)明的重組EC-SOD蛋白可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kb的活化。
由此可知，本發(fā)明的重組EC-SOD蛋白可抑制NF-kB的異?；钚?， 因而可有利地用于自身免疫疾病例如變應(yīng)性疾病的預(yù)防及治療。
實(shí)施例7: EC-SOD蛋白對減少人肥大細(xì)胞脫顆粒的效果的檢測 為了檢測EC-SOD對人肥大細(xì)胞的脫顆粒是否產(chǎn)生影響，將肥大細(xì)
胞用甲苯胺藍(lán)染色，然后對100個(gè)被染色細(xì)胞中脫顆粒細(xì)胞的數(shù)目。
將人肥大細(xì)胞(由韓國慶熙大學(xué)Kim Hyeong-min教授提供的半粘附
人肥大細(xì)胞-l(HMC-l))以1乂104個(gè)細(xì)胞/蓋玻片的濃度接種于18 X18 mm的蓋玻片。在添加10。/o胎牛血清(FBS， GIBCO)及100單位青霉素和100 g 鏈霉素/ml的培養(yǎng)基各1%的IMDM (Isocove，s modified Dulbecco，s medium，GIBCO)中于5。/。 CO2、 37。C培養(yǎng)該細(xì)胞。由于這種細(xì)胞為半粘 附細(xì)胞，因此粘附細(xì)胞和非粘附細(xì)胞的比例為大約4: 6。粘附的細(xì)胞匯 合30-40%左右時(shí)，將該細(xì)胞用5將EC-SOD預(yù)處理1小時(shí)，然后用1 jiM 的鈣通道 A23187和 50 nM 的 豆蔻酰佛波醇乙酯 (Phorbol-12誦myristate國13-acetate， PMA)來提高細(xì)胞內(nèi)的鉤濃度。
12小時(shí)后，人肥大細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，然后用多聚 甲醛固定10分鐘，在細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水洗滌后，將其用溶解于1%酸 性鹽水(PH 2.3)中的0.1%甲苯胺藍(lán)染色2-3分鐘。將該細(xì)胞再次用水 洗滌，然后用95%和100%乙醇脫水，用二甲苯固定，并計(jì)算100個(gè)被染 色細(xì)胞中的脫顆粒細(xì)胞的數(shù)目。
結(jié)果如圖17所示，未經(jīng)任何處理的人肥大細(xì)胞組(對照組)中的脫 顆粒細(xì)胞的數(shù)目為10, EC-SOD處理的組(EC-SOD)中的脫顆粒細(xì)胞的數(shù) 目為16。與此相比，為了誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的活化和脫顆粒而提高細(xì)胞內(nèi)鉤 濃度的組(A+P)中，脫顆粒細(xì)胞的數(shù)目增加五倍達(dá)55個(gè)，但在用EC-SOD 預(yù)處理并被處理來提高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的組(A+P+EC-SOD)中，脫顆粒細(xì)胞 的數(shù)目又減少到25個(gè)。il^明由于EC-SOD的作用抑制了活性^減少 了肥大細(xì)胞脫顆粒的發(fā)生。有關(guān)肥大細(xì)胞脫顆粒的顯微照片如圖17B所 示。
因此，考慮到儲(chǔ)藏在肥大細(xì)胞中的介體如組胺，由于肥大細(xì)胞的脫顆 粒而得以釋放，從而引起炎癥反應(yīng)如變應(yīng)反應(yīng)，可想到本發(fā)明的重組 EC-SOD蛋白可有利地用于預(yù)防或治療變應(yīng)性疾病。
工業(yè)上的利用
EC-SOD蛋白或具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體可通 過抑制誘導(dǎo)血管發(fā)生的VEGF及MMP-9的表達(dá)從而抑制血管發(fā)生的效 杲。因此，所述EC-SOD蛋白或所述載體可用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生 介導(dǎo)的疾病。同時(shí)，所述EC-SOD蛋白或所述具有編碼所述EC-SOD蛋 白的多核苷酸的載體還具有以下作用抑制引起變應(yīng)性疾病的Th2細(xì)胞 的過分化，抑制轉(zhuǎn)錄因子(NF-KB)活性并減少人肥大細(xì)胞的脫顆粒化。因 此，所述EC-SOD蛋白或所述載體可有利地用于變應(yīng)性疾病的預(yù)防或者治療。且本發(fā)明的EC-SOD蛋白制備方法可用于大規(guī)模制備具有上述活性的EC-SOD蛋白。因此，本發(fā)明的方法可在工業(yè)上得到利用。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合 物，其中所述EC-SOD蛋白具有選自SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3及 SEQ ID NO: 5的M^列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合 物，其中所述疾病選自癌癥、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈硬化、血管 瘤、血管纖維瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟兒視網(wǎng)膜病、新生血管性青光 眼、血管生成引起的角膜疾病、退化斑、黃斑變性、翼狀胬肉、視網(wǎng)膜變 性、晶狀體后纖維增生癥、顆粒性結(jié)膜炎、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、化膿性肉芽 腫A痤掩。
4. 一種用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合物，所述組合物含有
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)^I疾病的組合 物，其中所述多核苷酸具有選自SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的組合 物，其中所述疾病選自癌癥、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)l^化、血管 瘤、血管纖維瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟兒視網(wǎng)膜病、新生血管性青光 眼、血管生成引起的角膜疾病、退化斑、黃斑變性、翼狀胬肉、視網(wǎng)膜變 性、晶狀體后纖維增生癥、顆粒性結(jié)膜炎、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、化膿性肉芽 肺及痤齊。
7. —種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，所迷組合物含有作為活 性成分的EC-SOD蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，其中所 述EC-SOD蛋白具有選自SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO:
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，其中所 述變應(yīng)性疾病選自變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性中耳炎、變應(yīng)性休克、 變應(yīng)性皮膚病、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、接觸性變應(yīng)性皮膚炎及蕁麻滲。
10. —種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，所述組合物含有作為活 性成分的具有編碼權(quán)利要求7的EC-SOD蛋白的核苷酸的載體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，其中 所述多核苷酸具有選自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的組合物，其中 所述變應(yīng)性疾病選自變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性中耳炎、變應(yīng)性休 克、變應(yīng)性皮膚病、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、接觸性變應(yīng)性皮膚炎及蕁麻滲。
13. —種制備EC-SOD蛋白的方法，包括以下步驟U)將編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表達(dá)載體中；(b) 將上i4^達(dá)栽體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中以轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞；(c) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化得到的宿主細(xì)胞以在所述細(xì)胞中表達(dá)EC-SOD蛋白；(d) 收集表達(dá)的EC-SOD蛋白的包含體；并(e) 溶解所述包含體并誘導(dǎo)所述包含體重新折疊。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備EC-SOD蛋白的方法，其中所述多核苷酸 具有選自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6的核苷酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備EC-SOD蛋白的方法，其中進(jìn)一步包括步 驟(f):利用凝膠過濾柱分離及純化所述EC-SOD。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備EC-SOD蛋白的方法，其中所述宿主細(xì)胞 為^J^桿菌(^sc&m'cA/fl co//)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備EC-SOD蛋白的方法，其中所述(e)步驟 是通過以下方法進(jìn)行的將所述包含體溶解于含有蛋白變形劑的緩沖液 中，將所述溶液吸附到金屬親和樹脂柱上，并在降低所述變性劑濃度的同 時(shí)誘導(dǎo)所述EC-SOD的重新折疊。
18. —種EC-SOD蛋白，通過根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法制備。
19. 一種預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法，包括給予有此需要的 受試者有效量的EC-SOD蛋白。
20. EC-SOD蛋白用于制備針對血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的治療劑的用途。
21. —種預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法，包括給予有此所需的 受試者有效量的具有編碼EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體。
22. 具有編碼EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體用于制備針對血管發(fā)生介 導(dǎo)的疾病的治療劑的用途。
23. —種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的方法，包括給予有此需要的受試 者有效量的EC-SOD蛋白。
24. EC-SOD蛋白用于制備計(jì)對變應(yīng)性疾病的治療劑的用途。
25. —種用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病的方法，包括給予有此需要的受試 者有效量的具有編碼EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體。^治療劑的用途。
26.
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或者變應(yīng)性疾病的組合物，所述組合物含有作為活性成分的EC-SOD蛋白或者具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體。所述EC-SOD蛋白或者所述具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體具有通過抑制誘導(dǎo)血管發(fā)生的VEGF和MMP-9的表達(dá)從而抑制血管發(fā)生的效果。因此，所述EC-SOD蛋白或者所述載體可用于預(yù)防或者治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病。同時(shí)，所述EC-SOD蛋白或者所述具有編碼所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的載體還具有以下作用抑制引起變應(yīng)性疾病的Th2細(xì)胞的過分化，抑制轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)并減少人肥大細(xì)胞的脫顆?；Ｒ虼?，所述EC-SOD蛋白或所述載體可用于預(yù)防或者治療變應(yīng)性疾病。另外，本發(fā)明的制備EC-SOD蛋白的方法可用于大規(guī)模制備具有所述活性的EC-SOD蛋白。因此，本發(fā)明的方法可在工業(yè)上得到利用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101678074SQ200880016911
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者D·H·申, T·Y·金 申請人:韓國加圖立大學(xué)產(chǎn)學(xué)合作基金會(huì)