流式細(xì)胞儀的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開總地涉及流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域，并且更具體地，涉及改進(jìn)的流式細(xì)胞儀 連同包括在其中的各個(gè)獨(dú)立的組件的結(jié)構(gòu)和操作。
【背景技術(shù)】
[0002] 流式細(xì)胞術(shù)是在細(xì)胞計(jì)數(shù)、分選、生物標(biāo)志物檢測和蛋白質(zhì)工程中采用的生物物 理學(xué)技術(shù)。在流式細(xì)胞術(shù)中，懸浮于液流中的細(xì)胞通過電子檢測設(shè)備。流式細(xì)胞術(shù)允許每 秒對高達(dá)數(shù)千個(gè)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行物理和/或化學(xué)特性的多參數(shù)分析。
[0003] 流式細(xì)胞術(shù)具有包括在分子生物學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、植物生物學(xué)和海洋生物學(xué)領(lǐng) 域中的多項(xiàng)應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)中（尤其是在移植、血液學(xué)、腫瘤免疫學(xué)和化療、產(chǎn)前 診斷、遺傳學(xué)和用于性別預(yù)選的精子分選中）也具有廣泛的應(yīng)用。在海洋生物學(xué)中，光合作 用浮游生物的自體熒光特性可被流式細(xì)胞術(shù)用于表征個(gè)體密度和群落組成。在蛋白質(zhì)工程 學(xué)中，流式細(xì)胞術(shù)與酵母展示和細(xì)菌展示結(jié)合使用，以便識別具有所需性質(zhì)的在細(xì)胞表面 展示的蛋白質(zhì)變異體。流式細(xì)胞術(shù)的一種常見變型是基于粒子的性質(zhì)對粒子進(jìn)行的物理分 選，從而純化所關(guān)注的群體。
[0004] 整個(gè)流式細(xì)胞儀系統(tǒng)包括下列主要部件。
[0005] 1.流通池，通常稱為鞘流、鞘液體或鞘流體的液流通過流通池，攜載細(xì)胞或粒子并 將細(xì)胞或粒子流體動(dòng)力學(xué)地對準(zhǔn)，使得細(xì)胞或粒子單行通過流通池。
[0006] 2.測量子系統(tǒng)，其耦連到流通池，檢測通過流通池的細(xì)胞或粒子，且通常是下述之
[0007] a.阻抗或電導(dǎo)率測量子系統(tǒng)；或
[0008] b.光學(xué)照射子系統(tǒng)連同光學(xué)感測子系統(tǒng)。
[0009] 3.轉(zhuǎn)換子系統(tǒng)，其用于將來自測量子系統(tǒng)的輸出信號轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)可處理的數(shù) 據(jù)。
[0010] 4.計(jì)算機(jī)，其用于分析由轉(zhuǎn)換子系統(tǒng)所生成的數(shù)據(jù)。
[0011] 光學(xué)照射子系統(tǒng)提供準(zhǔn)直而后聚焦的光束，通常為單一波長的激光，其入射到通 過流通池的被流體動(dòng)力學(xué)地聚焦的液流上。因此，流式細(xì)胞儀系統(tǒng)可具有一個(gè)或多個(gè)光源， 其可以包括：
[0012] 1. 一個(gè)或多個(gè)燈，例如汞燈或氙燈；
[0013] 2. -個(gè)或多個(gè)高功率水冷式激光器，例如氬、氪或染料激光器；
[0014] 3. -個(gè)或多個(gè)低功率風(fēng)冷式激光器，例如氬（488納米）、HeNe (紅-633納米）、 HeNe (綠）和 HeCd (UV);和 / 或
[0015] 4. 一個(gè)或多個(gè)二極管激光器（藍(lán)、綠、紅和紫）。
[0016] 光學(xué)感測子系統(tǒng)包括一個(gè)或多個(gè)檢測器，其瞄準(zhǔn)聚焦的流液通過所述光速的地 方。這種檢測器可包括：
[0017] 1.與光束方向一致的檢測器（前向散射器或FSC);
[0018] 2.垂直于光束的檢測器（側(cè)向散射器或SSC);和
[0019] 3.熒光檢測器。
[0020] 通過光束的各懸浮粒子對該光進(jìn)行散射，并且由入射光激發(fā)的存在于粒子中或附 著于粒子的熒光材料發(fā)射比入射光波長更長波長的光。在每個(gè)檢測器（針對每個(gè)熒光發(fā)射 峰各有一個(gè)）處檢測和分析散射光和熒光的組合的亮度變化允許推導(dǎo)出有關(guān)每個(gè)獨(dú)立粒 子的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的各類信息。FSC與細(xì)胞容積有關(guān)。由于光被散射離開細(xì)胞的內(nèi)部部 件，SSC取決于粒子的內(nèi)部復(fù)雜度（即，細(xì)胞核的形狀、胞質(zhì)顆粒的數(shù)量和類型或細(xì)胞膜的 粗糙度）。有些流式細(xì)胞儀省去熒光檢測器而只檢測散射光。其它流式細(xì)胞儀形成每個(gè)細(xì) 胞的熒光、散射光、以及透射光的圖像。
[0021] 流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換子系統(tǒng)通常包括一個(gè)或多個(gè)模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器（"ADC"） 用于將測量子系統(tǒng)的輸出信號轉(zhuǎn)換成隨后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理的數(shù)據(jù)，所述轉(zhuǎn)換子系統(tǒng)可包 括可為線性或?qū)?shù)的一個(gè)或多個(gè)放大器。
[0022] 現(xiàn)代流式細(xì)胞儀通常包括多達(dá)四（4)個(gè)激光器和數(shù)個(gè)熒光檢測器。增加激光器和 檢測器的數(shù)量允許以若干不同的抗體來標(biāo)記細(xì)胞，并且可以通過其表型標(biāo)志物來更精確地 識別目標(biāo)群體。某些儀器甚至可以捕獲獨(dú)立細(xì)胞的數(shù)字圖像，從而允許對細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表 面上的熒光信號的位置進(jìn)行分析。
[0023] 試樣照射
[0024] 在大多數(shù)的儀器中，諸如血細(xì)胞或微球的受關(guān)注的粒子由利用流體動(dòng)力學(xué)聚焦 的鞘流攜載到小杯或噴射流內(nèi)部的觀察區(qū)內(nèi)，并于該處由聚焦的激光束進(jìn)行照射。該技 術(shù)提供了準(zhǔn)確地識別受關(guān)注的粒子并對所述粒子計(jì)數(shù)的一種手段，而不會(huì)被在注冊時(shí)間 窗之外出現(xiàn)的背景噪音所淹沒（實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)，Howard M. Shapiro,威利（2003) ISBN 0471411256)。為了提高檢測靈敏度，聚焦激光束的橫截面通常是橢圓形的，其中短軸沿著 流動(dòng)方向。為了保持閾值完整性，激光輪廓必須具有沿著流動(dòng)方向的平滑或鐘形輪廓。用 于產(chǎn)生這種光束的一種常見方法是，利用由棱鏡或柱面透鏡對所制成的擴(kuò)束器沿著流動(dòng)方 向?qū)缀鯗?zhǔn)直的圓形高斯光束細(xì)長化，然后用球面透鏡對光束進(jìn)行聚焦。因?yàn)楣馐诮裹c(diǎn) 處的形狀是光束在遠(yuǎn)場處的空間傅立葉變換，這產(chǎn)生高斯形橢圓光斑，其中短軸沿著流動(dòng) 方向。
[0025] 傳統(tǒng)激光器價(jià)格昂貴、體積大且耗電。最近，激光二極管（"LD"）已經(jīng)可以使用。 與傳統(tǒng)激光器不同，新一代LD具有成本效益、結(jié)構(gòu)緊湊且節(jié)能，并為新一代緊湊型生物醫(yī) 學(xué)儀器展現(xiàn)了巨大前景。LD發(fā)射具有橢圓形橫截面的光，其中經(jīng)常被稱為快軸的橢圓長軸 垂直于LD的接頭，而經(jīng)常被稱為慢軸的橢圓短軸平行于LD的接頭。遺憾的是，典型LD的 特別是沿其快軸的光束質(zhì)量可謂非常不理想，從而使其無法在流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用中被廣為 接受。
[0026] 原則上，LD光束的質(zhì)量可通過空間濾波顯著改善。如果小型針孔或單模光纖位于 透鏡的焦點(diǎn)處，使得其只能接受最低階的空間模式，則通過針孔或單模光纖的光束將是近 似完美的高斯形狀。序號為5, 788, 927的美國專利公開這樣的光束可在流動(dòng)通過細(xì)胞儀的 方向上被準(zhǔn)直并擴(kuò)展，并最終聚焦成橢圓形高斯光束，其中短軸沿著流動(dòng)方向。遺憾的是， 臺(tái)式儀器的尺寸將針孔的直徑限制到小于5微米?？梢姽獠ㄩL單模光纖的纖芯大小也具有 類似的尺寸。制備精密空間濾波器及其維持它的長期穩(wěn)定性的挑戰(zhàn)不僅增加了基于LD的 激光系統(tǒng)的成本，而且還降低了其可靠性。
[0027] 最近，在致力于減少因準(zhǔn)直透鏡的有限數(shù)值孔徑的邊緣效應(yīng)所導(dǎo)致的可能的旁 波瓣的過程中，序號為6, 713, 019的美國專利（"'019專利"）公開了將LD旋轉(zhuǎn)過90度 (90° )，使得其慢軸平行于流動(dòng)方向。然后將諸如凹面柱面透鏡的光束漫射區(qū)段引入，以 便在垂直于流動(dòng)的方向上漫射該準(zhǔn)直光束，隨后引入諸如球面聚焦透鏡的光束光斑形成區(qū) 段，以便在細(xì)胞儀的粒子觀察區(qū)內(nèi)形成橢圓形光斑。如在' 019專利中詳細(xì)描述的那樣，在 光斑形成區(qū)段之后的激光束是非常像散性的。具體地，在垂直于流動(dòng)方向上的在觀察區(qū)處 的光束寬度可與流量通道的寬度相當(dāng)或大于所述流量通道的寬度。這不僅降低了入射到粒 子上的激光能量的量并因此降低信號強(qiáng)度，同時(shí)也增加了來自液流細(xì)胞界面的非預(yù)期的背 景散射。取代旋轉(zhuǎn)LD，序號為7, 385, 682和7, 561，267的美國專利公開了使用大數(shù)值孔徑 非球面透鏡來用于LD準(zhǔn)直。但是這樣的設(shè)計(jì)不能校正LD光束輪廓中固有的邊緣效應(yīng)。因 此，目前對適于在流式細(xì)胞儀中使用的基于LD的簡單光學(xué)系統(tǒng)存在需求，其能夠可靠地產(chǎn) 生沿其短軸具有近高斯形狀并且沿其長軸具有一定寬度的聚焦橢圓形光束。
[0028] 觀察區(qū)
[0029] 顯微鏡物鏡
[0030] 現(xiàn)代的流式細(xì)胞儀包括空間濾波器，其通常為機(jī)械針孔或大纖芯光纖，位于物鏡 的圖像位置處以防止非預(yù)期的背景光進(jìn)入到細(xì)胞儀的檢測器內(nèi)。由于粒子停留在細(xì)胞儀的 觀察區(qū)內(nèi)幾微秒，因此必須使用具有大數(shù)值孔徑的顯微鏡物鏡以最大化集光效率。為了支 持在流式細(xì)胞儀中的多個(gè)空間上分離的激發(fā)用激光束，如在序號為4, 727, 020的美國專利 中所公開的那樣，也希望使用具有較大視野的物鏡。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，序號為6, 510, 007 和7, 110, 192的美國專利公開了一種物鏡設(shè)計(jì)，作為最靠近試樣的光學(xué)元件，其利用了具 有凝膠耦連或環(huán)氧樹脂粘結(jié)的接近半球透鏡的修正的復(fù)消色差透鏡，，接著為多個(gè)凹凸透 鏡。雖然這種顯微鏡物鏡提供令人滿意的數(shù)值孔徑和視野，但它們顯著犧牲了圖像質(zhì)量，由 此：
[0031] 1.限制了空間濾波器的有效使用；以及
[0032] 2.表現(xiàn)出欠佳的背景光識別力。
[0033] 此外，這種折射型顯微鏡物鏡體積大，制備成本昂貴，并通常表現(xiàn)出嚴(yán)重的色差。 為了克服這些限制，公布的序號為WO 01/27590的專利合作條約（"PCT"）專利申請公開了 基于球形凹面鏡的替代性物鏡設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)提供了大數(shù)值孔徑以及沿著光軸的良好圖像質(zhì) 量。然而，由于其較差的離軸特性，這樣的設(shè)計(jì)并不適用于具有多個(gè)空間上分離的激光束的 流式細(xì)胞儀。
[0034] 鞘液體供應(yīng)
[0035] 流式細(xì)胞儀的性能關(guān)鍵取決于穩(wěn)定的液體鞘流。具體地，具有多個(gè)空間上分離的 激發(fā)用激光束或執(zhí)行液滴分選的流式細(xì)胞儀依賴于液體鞘流的恒定速度以便定時(shí)同步。如 序號為5, 245, 318的美國專利中所公開，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀通過使用氣密式的流體系統(tǒng)提 供穩(wěn)定的液體鞘流，該系統(tǒng)：
[0036] 1.在鞘液體儲(chǔ)槽內(nèi)施加恒定的空氣壓力以將流體推動(dòng)通過所述流通池；或
[0037] 2.使用真空泵通過流通池從鞘液體儲(chǔ)槽抽取流體。
[0038] 這些系統(tǒng)體積大，制備成本昂貴，并容易出現(xiàn)故障。最近，序號為8, 187,888的美 國專利公開了包括鞘液體子系統(tǒng)和廢鞘液體泵，所述鞘液體子系統(tǒng)將液體鞘流從鞘液體儲(chǔ) 槽泵入到觀察區(qū)內(nèi)，所述廢鞘液體泵將廢鞘液體從觀察區(qū)泵入到廢液槽內(nèi)。雖然看起來所 公開的鞘液體子系統(tǒng)從未在速度關(guān)鍵流式細(xì)胞儀中使用，但是該專利報(bào)告，所公開的鞘液 體子系統(tǒng)通過下述來克服傳統(tǒng)鞘液體流穩(wěn)定性的大多數(shù)缺陷：
[0039] 1.通過定位下述裝置來阻尼泵脈動(dòng)：
[0040] a.鞘液體泵和流通池之間的一個(gè)流體電容器；以及
[0041] b.流通池和廢液泵之間的另一個(gè)流體電容器；以及
[0042] 2.泵控制器，其操作對壓力傳感器作出響應(yīng)，所述壓力傳感器測量所述流通池的 入口和出口之間的壓力差。
[0043] 所公開的鞘液體子系統(tǒng)具有其它限制。例如，位于所述流通池出口附近的壓力傳 感器可能是潛在的污染源。
[0044] 蠕動(dòng)泵
[0045] 試樣液體供應(yīng)
[0046] 蠕動(dòng)泵是容積泵，其中一組線性地或圓形地移動(dòng)的輥逐步壓縮可壓縮管以將流體 推壓通過管。蠕動(dòng)泵尤其被廣泛用于泵送潔凈的/無菌性或腐蝕性流體，以避免外露的泵 組件的交叉污染。
[0047] 傳統(tǒng)的蠕動(dòng)泵在輥每次滾離泵出口附近的管時(shí)呈現(xiàn)脈動(dòng)，其由壓縮管膨脹回其原 始形狀時(shí)管容積的暫時(shí)性增加所導(dǎo)致。脈動(dòng)在需要平穩(wěn)流動(dòng)的應(yīng)用中是非預(yù)期的。在過去 已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來減少脈動(dòng)。例如，序號為3, 726, 613和3, 826, 593的美國專利介紹 了凸輪操作的推桿，其將外部壓力同步地施加到管上以補(bǔ)償管的擴(kuò)張。在序號為4, 834, 630 的美國專利中，安裝在分段輥上的多根管通過T形聯(lián)接器在泵入口和出口處接合在一起， 從而來自各個(gè)管的脈動(dòng)會(huì)通過平均而被減少。序號為7, 645, 127的美國專利提出了一種泵 送管，其在入口附近具有稍大的內(nèi)徑，使得泵出口附近的管的減壓由入口附近的較大容積 的管的壓縮來補(bǔ)償。各種方法或顯著地增加蠕動(dòng)泵的復(fù)雜性，或在降低脈動(dòng)效應(yīng)上的效用 有限。
[0048] 多色熒光檢測
[0049] 在多種多色熒光檢測儀器諸如流式細(xì)胞儀（實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)，Howard M. Shapiro， 威利（2003) ISBN 0471411256)中，從受關(guān)注的對象發(fā)出的熒光：
[0050] 1.由顯微鏡物鏡收集；
[0051] 2.通過小型針孔或多模光纖而重新成像；
[0052] 3.隨后準(zhǔn)直化并分離成多個(gè)有色帶；并且
[0053] 4.最后由諸如光電倍增管（PMT)、PIN光電二極管或雪崩光電二極
[0054] 管（APD)的光檢測器檢測。
[0055] PMT實(shí)質(zhì)上是一種特殊類型的電子管。這種"前-半導(dǎo)體年代"的裝置體積大且 昂貴。此外，其具有較差的量子效率和比基于硅系半導(dǎo)體檢測器更少的可再現(xiàn)性的頻譜響 應(yīng)，特別是在生物學(xué)上重要的紅光至近紅外光頻譜區(qū)尤其如此。盡管有缺陷，PMT仍具有優(yōu) 異的噪聲特性。例如，典型的13毫米PMT (例如，來自日本Hamamatsu公司的R9305)的暗 電流僅約InA。相比而言，即使其有源區(qū)減少到PMT有源區(qū)的二十分之一，APD的暗電流將 為PMT暗電流的10倍以上。因此，PMT已經(jīng)成為實(shí)際上在許多商業(yè)熒光檢測流式細(xì)胞儀中 的低水平光檢測器。只有在事件發(fā)生率較低以及暗電流可通過昂貴的光子計(jì)數(shù)技術(shù)區(qū)別的 某些科學(xué)應(yīng)用中，PMT才由APD檢測器替代。（參考，高通量流式細(xì)胞術(shù)DNA片段的尺寸制 訂，A. V. Orden，R. A. Keller,和 W. P. Ambrose, Anal. Chem.，2000, 72 (I)，p37-41)。最近，也 提出用蓋革模型AH)陣列作為PMT的替代品。（例如，日本Hamamatsu Photonics的多像素 光子計(jì)數(shù)器以及愛爾蘭SensL Inc.的固態(tài)光電倍增管）。但是這些檢測器也有高的暗電流 和在高事件率下為非線性的缺陷。
[0056] APD被廣泛接受的唯一行業(yè)是在光通信中。已知的是，如果APD的有源區(qū)減小到 小于1_2,則相應(yīng)的暗電流會(huì)降低到與PMT相同的水平。在光通信中，光是出自單模光纖 的激光束。這種光束可被容易地準(zhǔn)直然后聚焦到比1_2小得多的區(qū)域。應(yīng)當(dāng)指出的是，在 熒光檢測儀器中使用的分色裝置（如在序號為6, 683, 314的美國專利和其中的參考文獻(xiàn)所 描述的那樣）在功能和結(jié)構(gòu)上幾乎與廣泛應(yīng)用于光通信中的波分多路復(fù)用器（WDM)相同， 如在序號4, 482, 994和5, 786, 915的美國專利中所述的那樣。阻止在熒光檢測儀器中使用 小面積AH)的基本理由是公知的光學(xué)擴(kuò)展量守恒定理：通過針孔或多模光纖的熒光是擴(kuò)展 光源，其具有的光學(xué)擴(kuò)展量比出自單模光纖的激光束的光學(xué)擴(kuò)展量大數(shù)百倍。因此，如圖 26中所示，除非光束直徑被顯著擴(kuò)展，否則其就不能在延長的距離下準(zhǔn)直。遺憾的是，光束 直徑越大，則將光束聚焦到一個(gè)小光斑的技術(shù)挑戰(zhàn)越大。由于只能以經(jīng)準(zhǔn)直光束經(jīng)濟(jì)地完 成有效分色，因此小面積的Aro對多色熒光檢測應(yīng)用被認(rèn)為是不可行的。顯然，能夠在延長 的距離下準(zhǔn)直較大光學(xué)擴(kuò)展量的光束而不顯著地?cái)U(kuò)展光束直徑的技術(shù)將是非常理想的。這 種技術(shù)將使得類似WDM的裝置能夠用于熒光檢測，具有與低噪聲半導(dǎo)體檢測器相媲美的特 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0057] 本公開提供了改進(jìn)的流式細(xì)胞儀連同包括在其中的各種改進(jìn)的組件。
[0058] 本公開的目的是提供一種簡單而可靠的基于二極管激光器的光學(xué)系統(tǒng)，其能夠傳 送橢圓形截面的