用于聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的方法。一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器，包括：具有樣本通道的毛細(xì)管；耦合到所述毛細(xì)管的至少一個振動產(chǎn)生換能器，所述至少一個振動產(chǎn)生換能器被配置成產(chǎn)生聲信號，所述聲信號引起所述樣本通道內(nèi)的聲輻射壓力以聲學(xué)集中在所述樣本通道中的流體樣本流內(nèi)流動的顆粒；以及具有紫光激光器和藍(lán)光激光器的探詢源，所述紫光激光器和所述藍(lán)光激光器被配置成與經(jīng)聲學(xué)集中的顆粒的至少一些相互作用以產(chǎn)生輸出信號。
【專利說明】用于聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的方法
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01080061774. 5(國際申請?zhí)枺篜CT/US2010/058242)、申請日 為2010年11月29日（進(jìn)入國家階段日為2012年7月18日）、發(fā)明名稱為"用于聲學(xué)流 式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的裝置、系統(tǒng)、方法和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2009年12月4日提交的美國臨時申請第61/266, 907號、于2010 年2月12日提交的美國臨時申請第61/303, 938號以及于2010年6月28日提交的美國臨 時申請第61/359, 310號的優(yōu)先權(quán)，上述每一申請的全部內(nèi)容通過引用被合并于本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本申請一般地涉及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，尤其涉及使用聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測罕見 事件的裝置、系統(tǒng)、方法和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。

【背景技術(shù)】
[0005] 在傳統(tǒng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，通過使鞘液以極高的容積流率（大約是樣本流體的容 積流率的100-1000倍）圍繞樣本流體流動而將樣本流體聚焦到大約10-50ym的小核心直 徑。樣本流體中的顆粒以極快的線速度（以米/秒的數(shù)量級）流動并且因此僅需要極短的 時間穿過探詢點(diǎn)（通常僅1-lOus)。這具有明顯的缺點(diǎn)。首先，顆粒不能被重定向到探詢 點(diǎn)，原因是流動不能被反向。其次，顆粒不能保持在探詢點(diǎn)，原因是在沒有鞘液的情況下聚 焦丟失。再次，較短的通過時間限制了靈敏度和分辨率，這導(dǎo)致罕見事件檢測困難并且耗 時。
[0006] 解決這些缺點(diǎn)的以前嘗試不令人滿意。可以增加樣本流體中的顆粒濃度以補(bǔ)償這 些缺點(diǎn)中的一些，但是這可能不總是可行的并且可能是成本很高的。同樣地，可以增加探詢 點(diǎn)處的光子通量以提取更多的信號，但是這可能常常光漂白（即，激發(fā)到非輻射狀態(tài)）用于 生成信號的熒光團(tuán)并且可能增加背景瑞利散射、拉曼散射和熒光。因此，需要用于流式細(xì)胞 計(jì)量術(shù)的新裝置、系統(tǒng)、方法和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其在避免或最小化這些缺點(diǎn)中的一個或多 個的同時，允許顆粒的高吞吐量分析以及快速高效的罕見事件檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)在本申請中具體化的原理，提供了用于流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的新裝置、系統(tǒng)、方法 和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其在避免或最小化這些缺點(diǎn)中的一個或多個的同時，允許顆粒的高吞 吐量分析以及快速高效的罕見事件檢測。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器，其包括：（1)包括樣本通道的 毛細(xì)管；（2)耦合至所述毛細(xì)管的至少一個振動產(chǎn)生換能器，所述至少一個振動產(chǎn)生換能 器被配置成產(chǎn)生聲信號，所述聲信號引起所述樣本通道內(nèi)的聲輻射壓力以聲學(xué)地集中在所 述樣本通道中的流體樣本流內(nèi)流動的顆粒；以及（3)包括紫光激光器和藍(lán)光激光器的探詢 源，所述紫光激光器和所述藍(lán)光激光器被配置成與所述經(jīng)聲學(xué)集中的顆粒中的至少一些相 互作用以產(chǎn)生輸出信號。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施例，提供了一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器，其包括：（1)毛細(xì)管， 被配置成允許包括顆粒的樣本流體在其中流動；（2)第一聚焦機(jī)構(gòu)，被配置成將所述樣本 流體中的所述顆粒中的至少一些聲學(xué)聚焦在所述毛細(xì)管內(nèi)的第一區(qū)域中；(3)第二聚焦機(jī) 構(gòu)，被配置成將包括所述至少一些經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒的樣本流體流體動力學(xué)地聚焦在所述 毛細(xì)管內(nèi)位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域中；(4)在所述毛細(xì)管中或下游的探詢區(qū)，所 述經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦顆粒中的至少一些可以流動通過所述探詢區(qū)；以及（5)至少一 個檢測器，被配置成檢測在所述探詢區(qū)獲得的關(guān)于所述經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦的顆粒中 的至少一些的至少一個信號。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施例，提供了一種使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測罕見事件的方 法，包括：（1)使包括顆粒的樣本流體流入通道；（2)通過將聲輻射壓力施加到包含在所述 通道內(nèi)的第一區(qū)域而將所述樣本流體中的所述顆粒的至少一些聲學(xué)聚焦在所述第一區(qū)域 中；（3)通過使鞘液圍繞所述樣本流體流動而將包括所述至少一些經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒的樣 本流體流體動力學(xué)地聚焦在位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域中；(4)調(diào)節(jié)所述鞘液與所 述樣本流體的容積比以保持位于所述第二區(qū)域內(nèi)或下游的探詢區(qū)中的大致恒定的總顆粒 速度；(5)分析所述探詢區(qū)中的所述經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦的顆粒中的至少一些；以及 (6)基于在所述探詢區(qū)檢測到的至少一個信號檢測一個或多個罕見事件，所述一個或多個 罕見事件選自下列：一個或多個罕見熒光事件、一個或多個罕見細(xì)胞類型以及一個或多個 死亡細(xì)胞。
[0011] 在附圖和以下描述中闡述了本發(fā)明的這些和其它實(shí)施例的附加細(xì)節(jié)，其僅僅是示 例性的和解釋性的并且不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明的其它實(shí)施例、特征、目的和優(yōu)點(diǎn) 將從描述和附圖并且從權(quán)利要求中顯見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 包含在說明書中并且形成說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明的一個或多個實(shí) 施例，并且與描述一起用于解釋本發(fā)明的各實(shí)施例的原理。附圖僅僅是示例性的和解釋性 的并且不應(yīng)當(dāng)被理解為以任何方式限制或約束本發(fā)明。
[0013] 圖1示出了平面和線驅(qū)動毛細(xì)管聚焦的比較。
[0014] 圖2A和2B示出了線驅(qū)動聲學(xué)聚焦裝置。
[0015] 圖3示出了流動越過線驅(qū)動聲學(xué)聚焦裝置中的層流線的經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒。
[0016] 圖4A和4B示出了聲學(xué)聚焦裝置中的經(jīng)聲學(xué)再定向的層流。
[0017] 圖5A-5C示出了聲學(xué)聚焦裝置中的微米級聚苯乙烯熒光橙色/紅色顆粒與納米級 綠色顆粒的背景的分離。圖?示出了流動越過聲學(xué)聚焦裝置中的層流線的聲學(xué)聚焦顆粒。
[0018] 圖6A-6C示出了越過層流邊界的顆粒的聲學(xué)分離。
[0019] 圖7A-7C示出了若干聲學(xué)聚焦裝置。
[0020] 圖8示出了與聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器組合的聲學(xué)聚焦流動室的示意圖。
[0021] 圖9示出了聲學(xué)聚焦系統(tǒng)的流程圖。
[0022] 圖10示出了修改成包括線內(nèi)分層沖洗的圖9的示圖。
[0023] 圖11示出了分層沖洗流體的聲學(xué)聚焦。
[0024] 圖12示出了并行流體聲學(xué)切換裝置的示意圖。
[0025] 圖13A和13B示出了未溶解全血的切換的示意圖。
[0026] 圖14示出了聲學(xué)流切換顆粒計(jì)數(shù)裝置的示意圖。
[0027] 圖15示出了陰性對比載體顆粒與血液樣本核心的分離。
[0028] 圖16示出了聲學(xué)沖洗系統(tǒng)中的多路免疫測定。
[0029] 圖17示出了使用聲學(xué)聚焦的高吞吐量篩選的流程圖。
[0030] 圖18示出了使用聲學(xué)沖洗的雙室培養(yǎng)/收獲皿。
[0031] 圖19A-19C示出了來自庫的適體選擇。
[0032] 圖20示出了雙級聲學(xué)閥分揀器。
[0033] 圖21A和21B示出了經(jīng)聲學(xué)再定位的顆粒和介質(zhì)的光學(xué)分析。
[0034] 圖22示出了具有不同參數(shù)的顆粒分組的示圖。
[0035] 圖23示出了由成像器成像的經(jīng)聲學(xué)再定位的顆粒。
[0036] 圖24示出了顆粒的聲學(xué)融合。
[0037] 圖25示出了顆粒的聲學(xué)聚焦和分離。
[0038] 圖26A-26F示出了使用各種激光器和靈敏度設(shè)置在非聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上和 在聲學(xué)聚焦細(xì)胞計(jì)數(shù)器上運(yùn)行的熒光微球的比較輸出繪圖。
[0039] 圖27A和27B是直方圖繪圖，示出了與聲學(xué)細(xì)胞計(jì)量術(shù)關(guān)聯(lián)的通過時間的8倍增 加對細(xì)胞周期分析的影響。
[0040] 圖28A是細(xì)胞被聲學(xué)集中以形成在聲學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)器中流動的繩狀結(jié)構(gòu)的血液的 照片。圖28B是細(xì)胞被聲學(xué)集中在聲學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的單行線中的更為稀釋的血液的照 片。
[0041] 圖29是光譜圖，顯示了紫光激發(fā)熒光團(tuán)PacificBlue?的激發(fā)和發(fā)射光譜。
[0042] 圖30示出了將0. 07%⑶34陽性細(xì)胞的罕見事件群體檢測作為活⑶45陽性細(xì)胞 的亞群。
[0043] 圖31A和31B分別顯示了聲學(xué)聚焦系統(tǒng)中和單獨(dú)流體動力學(xué)聚焦系統(tǒng)中的溶解全 血的FSC相對于SSC的繪圖。
[0044] 圖32A和32B顯示了使用與圖31A和31B中相同的系統(tǒng)和參數(shù)獲得的Jurkat細(xì) 胞的FSC相對于SSC的繪圖。
[0045] 圖33示出了聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)量系統(tǒng)的示意圖。
[0046] 圖34示出了聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的聲學(xué)聚焦毛細(xì)管的示意圖。
[0047] 圖35示出了聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的光學(xué)收集塊的一部分。
[0048] 圖36示出了聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的光學(xué)數(shù)據(jù)收集塊的示意圖。
[0049] 圖37示出了聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的射流系統(tǒng)的示意圖。
[0050] 圖38示出了具有下游流體動力學(xué)聚焦的單換能器聲學(xué)聚焦毛細(xì)管的示意圖。
[0051] 圖39示出了可以調(diào)節(jié)聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的前向散射孔徑的阻擋桿裝置的示 意圖。
[0052] 圖40A-40F示出了將0. 050%和0. 045%⑶34陽性細(xì)胞的罕見事件群體檢測作為 活⑶45陽性細(xì)胞的亞群。
[0053] 圖41A-41D示出了在非聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上和聲學(xué)聚焦細(xì)胞計(jì)數(shù)器上運(yùn)行的 細(xì)胞檢測的比較輸出繪圖。
[0054] 圖42示出了聲學(xué)聚焦細(xì)胞計(jì)數(shù)器的各部件的示意圖。
[0055] 圖中的相似標(biāo)記指示相似元件。

【具體實(shí)施方式】
[0056] 當(dāng)在本文中使用時，"聲學(xué)對比度"表示兩對象的材料性質(zhì)在用聲輻射壓力操縱其 位置的能力方面的相對差異，并且例如可以包括密度和壓縮率的差異；"測定"表示用于探 詢一個或多個顆?；蛞粋€或多個流體的方法；"測定物"表示產(chǎn)品，例如包括測定套件、數(shù)據(jù) 和/或報告；"流動室"表示通道、室或毛細(xì)管，具有選自矩形、方形、橢圓形、扁圓形、圓形、 圈形（round)、八邊形、七邊形、六邊形五邊形和三角形的內(nèi)部形狀；并且"通道"表示至少 具有入口并且優(yōu)選地具有出口的路線、路徑或管道，其可以包含一定量的流體，并且具有選 自矩形、方形、橢圓形、扁圓形、圓形、圈形、八邊形、七邊形、六邊形五邊形和三角形的內(nèi)部 形狀。
[0057] 當(dāng)在本文中使用時，"聲學(xué)聚焦"、"經(jīng)聲學(xué)聚焦"、"經(jīng)聲學(xué)聚焦的"以及"經(jīng)聲學(xué)聚 焦地"表示借助于聲場定位流動室內(nèi)的顆粒的動作。顆粒的聲學(xué)聚焦的例子是沿著通道 的軸線對準(zhǔn)顆粒。顆粒所在的聚焦區(qū)域的空間范圍可以由流動室?guī)缀涡螤?、聲場和聲學(xué)對 比度確定。在流動室的橫截面中觀察，觀察到的聚焦區(qū)域的形狀可以類似于規(guī)則幾何形狀 (例如點(diǎn)、線、弧、橢圓等）或者它可以是任意的。用于定位對象的主要的力是聲輻射壓力。
[0058] 當(dāng)在本文中使用時，"聲學(xué)再定向的"和"聲學(xué)再定向"表示用聲輻射壓力再定位裝 置內(nèi)的流體或介質(zhì)的可混溶、部分可混溶或不可混溶層流的位置的動作。該技術(shù)利用的是 流動通道中的獨(dú)立層流的機(jī)械性質(zhì)（聲學(xué)對比度）的差異。當(dāng)使兩個流體接觸時，會由于 它們的分子組成的差異而存在大濃度梯度，導(dǎo)致界面密度和/或壓縮率梯度（各流之間的 聲學(xué)對比度）。在聲場的作用下，各個流可以基于其聲學(xué)對比度在流動室內(nèi)再定向。
[0059] 當(dāng)在本文中使用時，"顆粒"表示物質(zhì)的小單位，例如包括生物細(xì)胞（例如真核細(xì)胞 和原核細(xì)胞）、古生菌、細(xì)菌、霉菌、植物細(xì)胞、酵母菌、原生動物、變形蟲、原生生物、動物細(xì) 胞；細(xì)胞器；有機(jī)/無機(jī)元素或分子；微球；以及不可混溶流體的小滴（例如水包油）。
[0060]當(dāng)在本文中使用時，"分析物"表示待分析的物質(zhì)或材料；"探針"表示物質(zhì)，其有標(biāo) 簽或以另外方式被標(biāo)記并且用于檢測或識別流體或樣本中的另一種物質(zhì)；"靶部"表示探針 的結(jié)合部分；并且"試劑"表示已知以特定方式反應(yīng)的物質(zhì)。
[0061] 當(dāng)在本文中使用時，"微球"或"小珠"表示具有聲學(xué)對比度的顆粒，其可以與球形 一樣是對稱的、與啞鈴形一樣是不對稱的或者是不具有對稱性的大分子。微球或小珠的例 子例如包括硅石、玻璃和中空玻璃、乳膠、硅橡膠、聚合物，例如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲 酯、聚亞甲基三聚氰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚（偏二氯乙烯共丙烯腈）和聚交酯。
[0062] 當(dāng)在本文中使用時，"標(biāo)簽"表示可識別物質(zhì)，例如染料或放射性同位素，其被引入 系統(tǒng)（例如生物系統(tǒng)）中并且可以跟隨流動室或通道的路線，提供關(guān)于流動室或通道中的 顆?；虬胁康男畔?；并且"信號分子"表示可識別物質(zhì)，例如染料或放射性同位素，其被引入 系統(tǒng)（例如生物系統(tǒng)）中并且可以用作顆粒的信號。
[0063]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的平面驅(qū)動和線驅(qū)動毛細(xì)管聚焦的比較。 在平面聚焦103/105中，可能包括一個或多個罕見事件顆粒的顆粒102可被聚焦為二維片 并且具有沿著流動方向的可變速度（參見不同箭頭）。在線驅(qū)動毛細(xì)管聚焦107/109中，顆 粒102可被聚焦到毛細(xì)管的中心軸線并且具有沿流動方向的共同速度。毛細(xì)管可以具有例 如圓形、扁圓形或橢圓形橫截面。作為替換，顆粒102也可被聚焦到毛細(xì)管內(nèi)的另一軸線或 沿著毛細(xì)管的壁。
[0064]圖2A和2B示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的線驅(qū)動聲學(xué)聚焦裝置的側(cè)視圖和 軸視圖。可能包括一個或多個罕見事件顆粒的顆粒203可以使用換能器205被聲學(xué)聚焦到 管201 (例如可以是圓柱形管）的中心209中的壓力最小值。顆粒203可以形成單線軌跡 211，其可以允許具有類似尺寸和聲學(xué)對比度的顆粒的均勻停留時間，這又可以允許顆粒的 _吞吐量系列分析而不損害靈敏度和分辨率。
[0065]圖3示出了流經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的線驅(qū)動聲學(xué)聚焦裝置中的層流線 的經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒?？赡馨ㄒ粋€或多個罕見事件顆粒的顆粒305可以使用換能器303 從樣本流309被聲學(xué)聚焦到線驅(qū)動毛細(xì)管301中的流動流體/沖洗流315的中心307。顆 粒305可以越過層流線移動并且于是可以作為單行線移動并且在分析點(diǎn)311處被分析。 [0066] 圖4A和4B示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)聚焦裝置中的聲學(xué)再定向?qū)?流。在圖4A中，沒有聲場并且層流403和407彼此平行地在聲驅(qū)動毛細(xì)管401中流動。在 圖4B中，聲場由換能器405施加并且因此流403和407可以基于它們的聲學(xué)對比度被聲學(xué) 再定向。具有較大聲學(xué)對比度的流403b可以被再定向到毛細(xì)管401的中心，而具有較低聲 學(xué)對比度的流407b可被再定向?yàn)榭拷?xì)管401的壁。如果在偶極模式中啟動聲場，則流 403b與毛細(xì)管401的中心軸線重合地移動，部分地移位流407b，如圖4B中所示。流可以是 不可混溶的、部分可混溶的或可混溶的。大濃度梯度可能由于它們的不同分子組成而存在 于流之間。為了聲壓力，濃度梯度可以被視為密度和/或壓縮率梯度，并且流可以被視為可 以用聲輻射壓力作用的具有不同密度和壓縮率（聲學(xué)對比度）的孤立實(shí)體。
[0067]圖5A-5C示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)聚焦裝置中的微米級聚苯乙 烯熒光橙色/紅色顆粒與納米級綠色顆粒的背景的分離。圖?示出了流動越過根據(jù)本發(fā) 明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)聚焦裝置中的層流線的經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒。分離可以基于尺寸和 聲學(xué)對比度，原因是時間平均聲力與顆粒的體積成比例。如果中心沖洗流具有比外部樣本 流更高的特定比重和/或更低的壓縮率，則初始在具有比中心沖洗流更大的聲學(xué)對比度的 外部樣本流中的顆粒將繼續(xù)聚焦到毛細(xì)管軸線，而較小對比度的顆粒將被排除。圖5A顯示 了當(dāng)聲場關(guān)閉時與綠色200nm顆?；旌系募t色5. 7ym顆粒在落射熒光照明下流動通過毛 細(xì)管。圖5B顯示了當(dāng)聲場打開時5.7pm顆粒（其在藍(lán)光照明下發(fā)出黃色熒光）被聲學(xué)聚 焦到中心線，而200nm顆粒保持在它們的初始流中。圖5C顯示了 5. 7iim顆粒在具有紅色帶 通濾光器的綠光照明下發(fā)出紅色熒光，而200nm顆粒未被激發(fā)。圖?示出了在同軸流505 的旁邊引入的清潔核心流507，所述同軸流包含在毛細(xì)管501中流動的熒光背景流體。當(dāng)換 能器503產(chǎn)生聲駐波（未顯示）時，可能包括一個或多個罕見事件顆粒的顆粒509可以被 聲學(xué)聚焦并且從同軸流505移動到核心流507,在那里它們以單行朝著分析點(diǎn)511流動。 [0068]圖6A-6C示出了越過根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的層流邊界的顆粒的聲學(xué)分離。 介質(zhì)或流體可被聲學(xué)再定向，同時可能包括一個或多個罕見事件顆粒的介質(zhì)或流體中的顆 ?？杀宦晫W(xué)操縱或聚焦。圖6A顯示了當(dāng)聲場關(guān)閉時耦合到250ym聲學(xué)聚焦室609的端 部的光室的熒光圖像。白線601和611指示流動室的邊緣。摻有25iig/ml的藻紅蛋白 (R-Phycoerythrin)熒光蛋白（橙色熒光）的PBS緩沖液中的10%全血的混合物流動通過 流動室的下半部605(白血細(xì)胞DNA用SYTOX?綠色染色）；在上半部603的是6%碘 克沙醇（i〇dixan〇l)PBS緩沖液（暗）。圖6B顯示了當(dāng)聲場打開時，PBS緩沖液中的6%碘 克沙醇被聲學(xué)再定向到中心613,血液/PBS緩沖液/藻紅蛋白混合物朝著室側(cè)（圖中的頂 部和底部）被聲學(xué)再定向，并且白血細(xì)胞離開它們的初始介質(zhì)并且被聲學(xué)聚焦到中心，在 那里它們顯示為綠線（紅血細(xì)胞類似地被聲學(xué)聚焦，但是在熒光圖像中不可見）。圖6C示 出了比背景密度更大/壓縮率更小的顆粒的近似聲力勢（AcousticForcePotential)的 MATLAB繪圖617。密度較大、壓縮率較小的顆粒/介質(zhì)（例如細(xì)胞和碘克沙醇/PBS緩沖 液）朝著中心被聲學(xué)聚焦/聲學(xué)再定向（暗藍(lán)區(qū)域、勢最?。?，而密度較小和/或壓縮率較 大的介質(zhì)（例如血液/PBS緩沖液/藻紅蛋白混合物）朝著左側(cè)和右側(cè)被聲學(xué)聚焦/聲學(xué) 再定向（暗紅區(qū)域、勢最大）。如果密度較低（和/或壓縮率較高）的樣本流沿著大致圓柱 形毛細(xì)管的軸向中心流動并且密度較高（和/或壓縮率較低）的流鄰近它流動，則各個流 將被聲學(xué)再定向到與圖6C中所示的勢一致（尚未在平面系統(tǒng)中證明或報告的特征）。 [0069]圖7A-7C示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的若干聲學(xué)聚焦裝置。圖7A顯示了 流式細(xì)胞計(jì)量系統(tǒng)700a，其中包括顆粒712 (可能包括一個或多個罕見事件顆粒）的樣本 715a和沖洗緩沖液713a被引入毛細(xì)管703。線驅(qū)動器701 (例如，PZT驅(qū)動器或能夠產(chǎn)生 聲駐波的其它機(jī)構(gòu)）在用戶定義模式（例如偶極模式）下引入聲駐波（未顯示）。因此， 樣本715a和沖洗緩沖液713a可以被聲學(xué)再定向（如715b和713b)并且顆粒712可以基 于它們的聲學(xué)對比度被聲學(xué)聚焦（如717)。照明源709(例如激光器或一組激光器，或任 何合適的照明源，例如發(fā)光二極管）在探詢點(diǎn)716照明顆粒717。照明源可以是紫光激光 器（例如405nm激光器）、藍(lán)光激光器（例如488nm激光器）、紅光激光器（例如640nm激 光器）或它們的組合。來自被測樣本的光信號719可以由檢測器或檢測器陣列705(例如 PMT陣列、光電倍增管、雪崩光電二極管（APD)、多像素APD裝置、硅PMT等）檢測。圖7B顯 示了流式細(xì)胞計(jì)量系統(tǒng)700b，其中清潔流713a可以獨(dú)立地流動通過光室?？赡馨ㄒ粋€或 多個罕見事件顆粒的顆粒702可以被聲學(xué)聚焦以如線717流動，樣本緩沖液715b可以被丟 棄到廢物721，并且線717可以傳遞到第二聲波引起機(jī)構(gòu)714。圖7C顯示了流式細(xì)胞計(jì)量 系統(tǒng)700c，其中樣本715a可被噴射為稍偏向中心的一側(cè)并在毛細(xì)管壁703附近流動，同時 緩沖液713a貼靠相對壁流動。換能器701可以聲學(xué)再定向樣本715a(如715b)，可以聲學(xué) 聚焦可能包括一個或多個罕見事件顆粒的顆粒702 (如714/717)，并且可以聲學(xué)地再定向 緩沖液713a。
[0070]圖8示出了與根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的用于聲學(xué)定向顆粒和流的聲學(xué)流式 細(xì)胞計(jì)數(shù)器組合的聲學(xué)聚焦流動室的示意圖。包括顆粒803、807和809且可能包括一個 或多個罕見事件顆粒的樣本801被引入包含換能器811的流動室810,所述換能器將顆粒 803、807和809聲學(xué)聚焦為在收集/培育部位819收集的顆粒815。來自沖洗容器802的 沖洗或其它試劑805作為側(cè)向離開的背景流813被引入流動室810。另一沖洗流821從沖 洗容器817引入具有聲場發(fā)生器822的聚焦細(xì)胞計(jì)數(shù)器850的流動室810b中，在進(jìn)入另一 個流動室851中的入口 829之前所述聲場發(fā)生器將顆粒823聲學(xué)聚焦為顆粒825/827。在 由探詢光833在探詢點(diǎn)852進(jìn)行探詢之前換能器831還將顆粒825/827聲學(xué)聚焦為顆粒 832。在收集點(diǎn)837收集被測量顆粒之前，來自被探詢顆粒的信號854被發(fā)送到檢測器835 進(jìn)行分析。
[0071] 圖9示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)聚焦系統(tǒng)的流程圖。在步驟901中， 包括顆粒的樣本被收集并且引導(dǎo)到可控流動泵。在步驟903中，可控流動泵將樣本泵送到 聲學(xué)聚焦設(shè)備。在步驟905中，聲學(xué)聚焦設(shè)備將可能包括一個或多個罕見事件顆粒的顆粒 中的至少一些聚焦成線或平面，并且然后將顆粒引導(dǎo)到探詢區(qū)進(jìn)行光學(xué)激發(fā)和檢測。在步 驟907中，光學(xué)激發(fā)顆粒中的至少一些并且檢測來自激發(fā)顆粒的至少一些信號，并且隨后 引導(dǎo)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步分析或者引導(dǎo)到廢物或進(jìn)行某些其它處理。在步驟909中，可以由更 長通過時間數(shù)據(jù)收集和分析部分進(jìn)一步分析顆粒。在步驟911中，顆?？梢杂蓮U物或附加 處理部分提取為廢物或者受到附加處理?？煽乇每梢詾轭w粒的期望線速度而被調(diào)節(jié)到期望 顆粒流率，其可以在例如大約〇m/s至大約10m/s、大約Om/s至大約0. 3m/s或大約0. 3m/s 至大約3m/s的范圍內(nèi)。激發(fā)/檢測可以是脈動的或經(jīng)調(diào)制的，并且可以使用在模擬/數(shù)字 電子學(xué)和/或光學(xué)中已知的任何合適的激發(fā)/檢測方法進(jìn)行，包括使用瑞利散射檢測器。
[0072] 顆粒速度的控制具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，它可以通過增加由熒光/發(fā)光標(biāo)簽發(fā)出的 光子的數(shù)量來改善信號，原因是標(biāo)簽可以被照明更長時間。在〇. 3m/s的線速度下，光子的 數(shù)量可以增加大約10倍并且然后當(dāng)使用聲學(xué)聚焦時每秒可以分析大約3, 000個顆粒（假 設(shè)顆粒中心之間的平均距離為100微米）。并且在0. 03m/s的線速度下，該數(shù)量可以增加大 約100倍并且每秒可以分析300個顆粒。其次，典型地由于快速通過時間在常規(guī)流式細(xì)胞計(jì) 量術(shù)中不使用的標(biāo)記物（例如鑭系元素、鑭系元素螯合物、使用銪的納米顆粒、半導(dǎo)體納米 晶體（例如量子點(diǎn)）、諸如細(xì)胞染色劑和臺盼藍(lán)的吸收性染料等可以變得可使用。再次，其 它標(biāo)記物（例如具有長壽命和/或低量子產(chǎn)率/消光系數(shù)的熒光團(tuán)或發(fā)光團(tuán)；多數(shù)化學(xué)-生 物發(fā)光物種；壽命大于大約l〇ns、在大約10nm至大約liis之間、在大約liis至大約10iis 之間、在大約10Us至大約100iis之間和在大約100iis至大約lms之間的標(biāo)簽）可以受 益于減小光漂白的更低激光功率并且受益于通過線速度的控制成為可能的更長通過時間。 對于例如l〇ms的通過時間，在每秒一千次的速率以10ys脈沖進(jìn)行的脈沖調(diào)制允許激發(fā)和 發(fā)光收集的10個周期，其中實(shí)際上例如銪螯合物的所有發(fā)光衰減可以被監(jiān)測。在該脈沖速 率下若沒有通過本發(fā)明的實(shí)施例提供的線速度的控制而成為可能的更長通過時間的益處， 90%或以上的顆?？赡茉谖幢惶皆兊那闆r下通過。如果脈沖速率增加到100kHz并且具有 1Us脈沖，則可能仍然有將近9ys監(jiān)測鑭系元素發(fā)光（原因是多數(shù)熒光團(tuán)具有l(wèi)-2ns壽命 并且多數(shù)自發(fā)熒光在l〇ns內(nèi)衰減）。
[0073] 圖10示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的修改成包括線內(nèi)分層沖洗的圖9的示 圖。在步驟1001中，包括顆粒的樣本被收集并引導(dǎo)到可控樣本流動泵。在步驟1005中，可 控樣本流動泵將樣本泵送到聲學(xué)裝置1019的分層沖洗裝置部分中（其可以基于顆粒和流 體的聲學(xué)聚焦和/或再定向）。與此同時，在步驟1003中，沖洗流體被收集并引導(dǎo)到可控 沖洗流體泵。在步驟1007中，可控沖洗流體泵將沖洗流體泵送到分層沖洗裝置中。在步驟 1009中，分層沖洗裝置線內(nèi)沖洗樣本/顆粒。在步驟1011中，收集清潔流體，并且然后將 可能包括一個或多個罕見事件顆粒的已沖洗樣本/顆粒引導(dǎo)到探詢區(qū)以進(jìn)行光學(xué)激發(fā)和 檢測。在步驟1013中，光學(xué)地激發(fā)顆粒中的至少一些，檢測來自經(jīng)激發(fā)的顆粒的至少一些 信號，并且然后引導(dǎo)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步分析或?qū)⑵湟龑?dǎo)到廢物或進(jìn)行某些其它處理。在步驟 1015中，所述顆粒可由更長通過時間數(shù)據(jù)收集和分析部分進(jìn)一步分析。在步驟1017中，所 述顆粒可由廢物或附加處理部分提取為廢物或者受到附加處理。
[0074] 圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的分層沖洗流體的聲學(xué)聚焦。包含顆粒 1109 (可能包括一個或多個罕見事件顆粒）的樣本連同分層沖洗流體1107 -起被引入平面 聲學(xué)流動室1101中。換能器1103基于聲學(xué)對比度生成聲波1105,所述聲波將顆粒1109聲 學(xué)聚焦到穿過節(jié)點(diǎn)1111的軌跡。平面聲學(xué)流動室1101也可以具有位于外部的聲學(xué)節(jié)點(diǎn)， 在該情況下顆粒1109可以聲學(xué)聚焦到流動室的頂部。
[0075] 圖12示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的并行流體聲學(xué)切換裝置的示意圖。包 含第一顆粒1202和第二顆粒1204 (可能包括一個或多個罕見事件顆粒）的第一、最外側(cè)樣 本介質(zhì)1205被引入毛細(xì)管1201。第二、中間介質(zhì)1213連同第三、最內(nèi)側(cè)介質(zhì)1209 -起被 引入毛細(xì)管1201。線驅(qū)動器1203可以聲學(xué)地再定向第一、第二和第三介質(zhì)并且可以基于它 們的聲學(xué)對比度而聲學(xué)聚焦第一顆粒和第二顆粒。所述顆粒然后可以流到毛細(xì)管之外。當(dāng) 切換時，顆粒中的一些可以從第一介質(zhì)穿過第二介質(zhì)（其可以是試劑流）聲學(xué)聚焦到第三 介質(zhì)，或者它們可以從第二介質(zhì)聲學(xué)聚焦到第三介質(zhì)。
[0076] 圖13A和13B示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的未溶解全血的切換。血液樣本 1309和沖洗緩沖液1307在不同位置被引入毛細(xì)管1302。當(dāng)啟動換能器1304時，可能包括 一個或多個罕見事件紅/白血細(xì)胞的紅血細(xì)胞1303和白血細(xì)胞1305被聲學(xué)聚焦，并且樣 本1309和沖洗緩沖液1307被聲學(xué)再定向。由于它們的數(shù)量較小，所以白血細(xì)胞在經(jīng)聚焦 血液的繩狀結(jié)構(gòu)中保持分離。
[0077] 圖14示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)流切換顆粒計(jì)數(shù)裝置的示意圖。 所述裝置1400允許與未知或不可用導(dǎo)電緩沖液1403 -起流動的具有顆粒1409 (可能包括 一個或多個罕見事件顆粒）的樣本1405的線內(nèi)分析。顆粒1409可以使用換能器1407聲 學(xué)聚焦到緩沖液1403,而樣本介質(zhì)可以在廢物出口 1411被丟棄。當(dāng)顆粒移動經(jīng)過第二換能 器1413到達(dá)具有孔徑大小1419b的檢測點(diǎn)1419時顆?？梢杂蓹z測電極1415處的信號的 任何合適的電子檢測器1417分析并且計(jì)數(shù)。
[0078] 圖15示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的陰性對比度載體顆粒與血液樣本核心 的分離。其中，換能器1507可以聲學(xué)聚焦可能包括一個或多個罕見事件顆粒的陰性對比度 載體顆粒1505,這些顆粒1505從初始包括它們和血細(xì)胞1503的血液核心樣本1511橫越血 液核心樣本1511和清潔緩沖液1513之間的界面1502,朝著毛細(xì)管壁1501移動。在其它聲 學(xué)模式中，血細(xì)胞1503可以被驅(qū)動到壁，而陰性對比度載體顆粒1505可以被驅(qū)動到中心軸 線。
[0079] 圖16示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)沖洗系統(tǒng)中的多路免疫測定。在 聲學(xué)沖洗系統(tǒng)1600中，可以通過使分析物1609/1611/1613在中心流1607中流動并且將預(yù) 先結(jié)合有熒光抗原的小珠1603/1605/1621從外部流1601推入中心流1607中而快速地執(zhí) 行競爭免疫測定。特定化學(xué)制品可被置于在單反應(yīng)容器中混合并且在流動中處理的每個群 體上。離開容器的群體1615(可能包括一個或多個罕見事件群體）可以在分析點(diǎn)1617經(jīng) 由尺寸和或熒光顏色和/或熒光而加以區(qū)分。
[0080] 圖17示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的使用聲學(xué)流體的高吞吐量篩選的流程 圖。在步驟1701中，可能包括一個或多個罕見事件顆粒的細(xì)胞/小珠型顆粒被收集和/或 培養(yǎng)以供試驗(yàn)。在步驟1703中，用感興趣的標(biāo)簽和/或藥物候選培育這些顆粒并將其引 導(dǎo)到聲學(xué)聚焦器/流切換器。與此同時，在步驟1709中，（一種或多種）其它藥物和/或 (一種或多種）附加反應(yīng)物可以被引入聲學(xué)聚焦器/流切換器。在步驟1705中，聲學(xué)聚焦 器/流切換器聚焦和/或切換顆粒和/或流，并且可以使顆粒從過量的藥物/配體中分離。 在步驟1707中，立即或在附加切換之后使用聲學(xué)聚焦器/流切換器收集清潔流體。在步驟 1711中，可以識別和/或分揀顆粒。然后，在步驟1713中，可以將不需要的顆粒送往廢物， 并且在步驟1715中，可以將選定顆粒送往附加分析或處理。在步驟1717中，可以執(zhí)行包括 藥物結(jié)合的確定、閃爍計(jì)數(shù)、存活/凋亡確定和基因表達(dá)分析的附加處理。
[0081]圖18示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的使用聲學(xué)沖洗的雙室培養(yǎng)/收獲皿。其 中，可能包括一個或多個罕見事件細(xì)胞的細(xì)胞在室1801中培養(yǎng)并且可被定期發(fā)送以聲學(xué) 聚焦到通道1805中，在那里它們可由光學(xué)檢測器1817檢查細(xì)胞密度/生長。當(dāng)滿足生長 目標(biāo)并且室1801中的培養(yǎng)基用完時，可以啟動閥以允許來自容器1803的新鮮培養(yǎng)基沿著 通道1805流動并且在室1811中收獲用過的培養(yǎng)基。細(xì)胞然后可被聲學(xué)聚焦到新鮮培養(yǎng)基 中并被轉(zhuǎn)移到第二培育室1809。于是可以反向重復(fù)相同過程，以使得細(xì)胞在室1809中培養(yǎng) 并被轉(zhuǎn)移到室1801內(nèi)的新鮮培養(yǎng)基中。
[0082] 圖19A-19C示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的來自庫的適體選擇。圖19A顯示 了具有用適體庫1901培育的靶分子的多重小珠/細(xì)胞1903。圖19B示出了使用線內(nèi)聲學(xué) 介質(zhì)切換使小珠/細(xì)胞1903和1907從未結(jié)合適體1904分離?？梢哉{(diào)節(jié)沖洗核心（中心 圓）的鹽和/或pH以選擇更高親和力適體，并且可以執(zhí)行連續(xù)沖洗以增加純度。圖19C示 出了經(jīng)分選的小珠1911。
[0083] 圖20示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的允許罕見細(xì)胞群體的線內(nèi)非稀釋高速 分選的雙級聲學(xué)閥分選器。其中，包括顆粒2007的樣本被引入聲學(xué)閥分選器2000的部分 2001。第一換能器2002引起通道2004中的聲波，并且探詢源2013在探詢點(diǎn)2006探詢顆 粒2007。在分選點(diǎn)2009檢測到的不需要的顆粒可以被引導(dǎo)通過廢物閥2010a，而選定顆粒 可以沿著通道2004被引導(dǎo)到下游處理2011以供第二換能器2002進(jìn)一步聚焦、由光源2015 探詢并且對于不需要的顆粒朝著廢物閥2010b適當(dāng)?shù)胤诌x或者對于選定顆粒2019從通道 2004離開。對于罕見細(xì)胞，上述分選提供捕獲感興趣細(xì)胞的高速初始閥分選，因此增加了分 選部分中的期望細(xì)胞的比率。隨后，上述分選可以在更低速率下再次進(jìn)行以用于提高純度。 如果例如以每秒30, 000個細(xì)胞的速率分析細(xì)胞并且閥分選能夠以每秒300個細(xì)胞的速度 進(jìn)行分選，則每個初始分選決定應(yīng)當(dāng)包含平均大約100個細(xì)胞。如果這些100個細(xì)胞隨后 以更慢的流速轉(zhuǎn)移到第二分選器（或在初始分選之后的相同分選器），則可以顯著地純化 感興趣的細(xì)胞。
[0084] 圖21A和21B示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的聲學(xué)再定位顆粒和介質(zhì)的光學(xué) 分析。其中，樣本2103中的顆粒2102 (可能包括一個或多個罕見事件顆粒）基于聲學(xué)對比 度由線驅(qū)動器2105聲學(xué)聚焦（作為顆粒2115)。顆粒2115進(jìn)入光室2117并且探詢源2111 探詢這些顆粒。檢測器陣列2107隨后收集來自每個顆粒的光信號2113,并且如果信號滿足 某個用戶確定的標(biāo)準(zhǔn)，則相應(yīng)顆粒（或顆粒組）由光源2119 (例如閃光LED(寬帶或UV)) 照明并且由成像器2109成像。在圖21A中，不采集圖像并且顆粒2125的流速2129保持不 變。然而在圖21B中，顆粒2125的流速2127減小到適合于所需成像分辨率的值以采集顆 粒的圖像。
[0085] 圖22示出了具有不同參數(shù)的顆粒分組的示圖，所述參數(shù)例如可以在如圖21A和 21B中所示的系統(tǒng)中被分析。顆粒組2202內(nèi)的每個顆粒關(guān)于參數(shù)1和參數(shù)2(各自例如可 以是前向散射、側(cè)向散射或熒光）是類似的。用戶定義的閾值2201基于參數(shù)1和參數(shù)2的 值識別滿足該閾值的用于成像的顆粒。如果顆粒滿足用戶定義的閾值，則流動可以減小到 合適速率以供成像器捕獲顆粒的焦內(nèi)圖像。也可以建立其它檢測閾值2205、2209和2215。 當(dāng)然，不需要成像每個顆粒。相反地，可以構(gòu)造來自選通亞群的顆粒的采樣矩陣以基于它們 的散射和熒光標(biāo)記來限定待捕獲的一組顆粒圖像，這可以允許高顆粒分析速率（例如超過 每秒2000)。圖像可以捕獲細(xì)胞形態(tài)、定向和內(nèi)部結(jié)構(gòu)（例如細(xì)胞核的位置和數(shù)量），并且 可使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的成像裝置獲得，包括電子CCD搖拍技術(shù)。成像可以相對 較慢（達(dá)300細(xì)胞/秒），但是更慢的流動可以允許保持高靈敏度的長探詢時間并實(shí)現(xiàn)良好 的空間分辨率（達(dá)0. 5微米）。
[0086] 圖23示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的由成像器成像的聲學(xué)再定位顆粒。它 顯示了從聲學(xué)再定向流2305捕獲的血細(xì)胞2303的照片，其中為了血細(xì)胞2303的焦內(nèi)圖像 捕獲而減慢光室2307中的流。為創(chuàng)建圖像，例如內(nèi)徑410iim的線驅(qū)動毛細(xì)管可以用光室 (其例如可以是具有內(nèi)部圓柱形通道的硼硅玻璃立方體，所述內(nèi)部圓柱形通道具有與線驅(qū) 動毛細(xì)管的內(nèi)徑相同的直徑）截斷。激發(fā)頻率為大約2. 1MHz并且聲學(xué)裝置的功耗為125 毫瓦。線驅(qū)動毛細(xì)管可以在超過5ml/min的容積流速下產(chǎn)生5ym乳膠顆粒和血細(xì)胞的精 細(xì)聚焦。線驅(qū)動毛細(xì)管可以附連到方形橫截面石英光室。光室的內(nèi)腔可以在橫截面上為圓 形，并且可以具有與線驅(qū)動毛細(xì)管相同的內(nèi)徑以延長流體柱的共振條件并且由此將聲學(xué)聚 焦力延伸到光室中。
[0087] 圖24示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的顆粒的聲學(xué)融合。包含第一顆粒類型 的第一樣本2401被泵送通過由PZT換能器2404驅(qū)動的第一聲學(xué)聚焦器2402并且所述顆 粒被聲學(xué)聚焦成線2408。包含第二顆粒類型的第二樣本2403類似地被泵送并且聚焦成由 PZT換能器2407驅(qū)動的第二聲學(xué)聚焦器2405中的線2409。樣本流動到由PZT換能器2411 驅(qū)動的第三聲學(xué)聚焦器2410中使得顆粒的線被聚焦以形成顆?？梢韵嗷プ饔玫膯尉€。在 下游，顆粒穿過使用融合顆粒2412的電極2413產(chǎn)生的電場，可能形成一個或多個罕見事件 顆粒。
[0088] 圖25示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的顆粒的聲學(xué)聚焦和分離?？赡馨ㄒ?個或多個罕見事件顆粒的顆粒2503移動到第一聲學(xué)聚焦器2505,所述第一聲學(xué)聚焦器用 第一換能器2507將它們聚焦成單行線2509。線2509隨后可以被給饋入基于尺寸和聲學(xué)性 質(zhì)中的一個或多個進(jìn)行分離和收集的聲學(xué)分離器2513中，所述聲學(xué)分離器配備有第二換 能器2512和多個出口 2519a、2519b和2519c。當(dāng)進(jìn)入聲學(xué)分離器2513中時可以通過拉走 流體或以另外方式例如通過側(cè)向通道2511去除流體而調(diào)節(jié)線2509的位置。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例，通過使用能夠控制顆粒速度并且允許長通過時間的 聲學(xué)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器執(zhí)行這樣的測定，如本文中所述，可以減小對單個患者的血液進(jìn)行測 定的臨床免疫表型板中的測定量，這可以增加一次測定的標(biāo)記物的數(shù)量?？梢砸淮螆?zhí)行例 如4、6或更多抗體的更大無補(bǔ)償板。例如，在AIDS進(jìn)展監(jiān)測中用于T細(xì)胞的CD4陽性枚舉 的anti-⑶45、⑶4和⑶8抗體的板中，例如可以加入或代用⑶3以有助于識別T細(xì)胞?？?以使用藍(lán)色（例如488nm)和紅色（例如635nm)激光細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行測定，每個抗體具有 不同的熒色物（例如FITC、PE、PE-Cy5和APC)。例如可以使用用于白血病/淋巴瘤分類 的許多四抗體測定組合，例如可以包括（1)⑶3、⑶14、HLADr和⑶45 ; (2)⑶7、⑶13、⑶2和 CD19 ;(3)CD5、Lambda、CD19 和Kappa; (4)CD20、CDllc、CD22 和CD25 ; (5)CD5、CD19、CD10 和CD34;以及（6)CD15、CD56、CD19 和CD34。此外，在Sutherland等人的"Enumerationof CD34+HematopoieticStemandProgenitorCells，'，CurrentProtocolsinCytometry, 6. 4. 1-6. 4. 23(2003)中描述的方案可以有利地用于本文中所述的本發(fā)明的示例性實(shí)施例 中的一個或多個，上述文獻(xiàn)通過引用完整地被合并于本文中。
[0090] 也可以使用用于白血病/淋巴瘤分類的許多六抗體測定組合，包括表1中所示的 例子（左列指示測定編號并且頂欄指示用于每個抗體的熒色物；從左到右在其相應(yīng)的熒色 物標(biāo)記物之下列出了每個抗體的特異性）。通過用長壽命試劑和窄帶試劑代替熒色物，最小 補(bǔ)償抗體板是可能的。在表2中顯示了可以實(shí)現(xiàn)不需要補(bǔ)償控制的最小補(bǔ)償結(jié)果的標(biāo)記物 的更多幾個例子。測定例如可以使用405nm和635nm脈沖二極管激光器。
[0091]表1

【權(quán)利要求】
1. 一種使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測罕見事件的方法，所述流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器包括： 包括樣本通道的毛細(xì)管； 耦合至所述毛細(xì)管的至少一個振動產(chǎn)生換能器，所述至少一個振動產(chǎn)生換能器被配置 成產(chǎn)生聲信號，所述聲信號引起所述樣本通道內(nèi)的聲輻射壓力以聲學(xué)集中在所述樣本通道 中的流體樣本流內(nèi)流動的顆粒； 包括紫光激光器和藍(lán)光激光器的探詢源，所述紫光激光器和所述藍(lán)光激光器被配置成 與經(jīng)聲學(xué)集中的顆粒中的至少一些相互作用以產(chǎn)生輸出信號； 光學(xué)模塊，用于收集來自所述探詢源的輸出信號； 檢測器模塊，用于檢測所述光學(xué)模塊的輸出信號；以及 數(shù)據(jù)采集模塊，用于處理所述檢測器模塊的輸出， 其中所述光學(xué)模塊包括收集來自所述探詢源的輸出信號的收集透鏡，并且其中所述收 集透鏡的輸出用空間濾光針孔裝置分成兩個光束，其中第一光束是來自所述紫光激光器的 輸出而第二光束是來自所述藍(lán)光激光器的輸出， 所述方法包括： 使包括顆粒的樣本流體流入通道； 通過將聲輻射壓力施加到包含在所述通道內(nèi)的第一區(qū)域而將樣本流體中的顆粒的至 少一些聲學(xué)聚焦在所述第一區(qū)域中； 通過使鞘液圍繞所述樣本流體流動而將包括所述至少一些經(jīng)聲學(xué)聚焦的顆粒的樣本 流體流體動力學(xué)地聚焦在第一區(qū)域下游的第二區(qū)域中； 調(diào)節(jié)所述鞘液與所述樣本流體的容積比以保持處于第二區(qū)域內(nèi)或下游的探詢區(qū)中的 大致恒定的總顆粒速度； 分析所述探詢區(qū)中的經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦的顆粒的至少一些；以及 基于在所述探詢區(qū)檢測到的至少一個信號檢測一個或多個罕見事件，所述一個或多個 罕見事件選自下列：一個或多個罕見熒光事件、一個或多個罕見細(xì)胞類型、以及一個或多個 死亡細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使樣本流體以至少200微升每分鐘的樣本流速流 動并且使鞘液以至多2200微升每分鐘的鞘液流速流動，并且其中調(diào)節(jié)所述鞘液與所述樣 本流體的容積比包括將所述鞘液與所述樣本流體的容積比調(diào)節(jié)到大約11比1至大約1. 4 比1之間的比率。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使樣本流體以至少500微升每分鐘的樣本流速流 動并且使鞘液以至多1900微升每分鐘的鞘液流速流動，并且其中調(diào)節(jié)所述鞘液與所述樣 本流體的容積比包括將所述鞘液與所述樣本流體的容積比調(diào)節(jié)到大約3. 8比1至大約1. 4 比1之間的比率。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括保證所述經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦的顆粒通過所 述探詢區(qū)的通過時間超過大約20微秒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括保證所述經(jīng)聲學(xué)和流體動力學(xué)聚焦的顆粒通過所 述探詢區(qū)的通過時間超過大約40微秒。
【文檔編號】G01N15/10GK104330346SQ201410492244
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月4日
【發(fā)明者】G·卡達(dá)查克, M·D·沃德, J·A·布萊德弗德, A·T·G·帕克 申請人:生命技術(shù)公司