一種攜帶iRGD穿膜肽雙靶向陽離子超聲微泡制備方法
【專利說明】一種攜帶iRGD穿膜肽雙靶向陽離子超聲微泡制備方法 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,涉及超聲微泡的制備方法,尤其涉及一種攜帶iRGD穿 膜肽雙靶向陽離子超聲微泡制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 超聲微泡(microbubble,MB),即超聲造影劑的主要成分,具有安全性高、能增強超 聲散射強度和產(chǎn)生豐富諧波信號的特點,被廣泛應(yīng)用于多種類型的疾病診斷,顯著提高疾 病診斷的靈敏性和特異性,運用超聲造影劑進行超聲成像已經(jīng)成為超聲診斷工作中重要的 組成部分。
[0003] 近年來,隨著超聲分子影像學的發(fā)展,超聲微泡的使用不再僅僅局限于成像領(lǐng)域, 通過生化技術(shù)對超聲微泡進行適當改造,可以將藥物或基因攜載于微泡表面、殼層或內(nèi)部 而用于疾病治療,具有廣闊的發(fā)展及運用前景。給予一定聲強的超聲輻照時,微泡發(fā)生振 動、膨脹和壓縮運動,當聲場較強時甚至發(fā)生破裂崩潰,這時微泡周圍引發(fā)高溫高壓、微射 流、沖擊波、切邊應(yīng)激力等多種能量釋放,產(chǎn)生的生物學效應(yīng)不僅能夠引起輻照區(qū)域血管內(nèi) 皮細胞間隙增寬,為基因、藥物穿越內(nèi)皮屏障創(chuàng)造有利條件,還可影響細胞膜流動性,使細 胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生可自我修復(fù)的斷裂,導(dǎo)致瞬時可逆的細胞膜微孔產(chǎn)生,Ca2+內(nèi) 流促使細胞膜通透性增加,將更多的藥物或基因傳遞入細胞內(nèi)發(fā)揮作用,從而改善治療效 果。研究證明,超聲微泡聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)的腫瘤治療具有安全系數(shù)高、靶向破壞微泡釋放 治療物質(zhì)、促進治療物質(zhì)滲透入病變組織的特點,尤其在遞送基因具有巨大的應(yīng)用潛力和 獨特的優(yōu)勢,例如提高細胞對質(zhì)粒DNA的攝取,通過調(diào)節(jié)超聲參數(shù)及改變超聲輻照部位更 方便有效地調(diào)控基因轉(zhuǎn)染等。
[0004] 然而,與其他基因傳遞系統(tǒng)相比,目前超聲微泡攜帶質(zhì)粒DNA的能力較低,且難以 實現(xiàn)微泡在腫瘤細胞周圍的聚集,以至給予超聲輻照時進入腫瘤細胞內(nèi)的基因數(shù)量受到限 制,從而影響轉(zhuǎn)染率。陽離子材料聚醚酰亞胺(PEI)是一種多用途的陽離子聚合物,能夠中 和DNA電荷,增加DNA與細胞膜的相互作用并促進細胞內(nèi)吞,是常用的轉(zhuǎn)染試劑。研究表明, PEI與超聲具有協(xié)同作用,PEI修飾的微泡能通過正負電荷相吸作用攜帶更多的DNA,在超 聲介導(dǎo)下有效地提高基因轉(zhuǎn)染效率。對于質(zhì)粒DNA靶向聚集問題,微泡進行靶向修飾是一 個很好的解決方案,通過在微泡表面連接上針對某種腫瘤的特異性抗體或配體,使其能夠 特異性識別靶細胞而靶向聚集到病灶內(nèi)。利用靶向微泡攜帶傳輸基因不僅可以實現(xiàn)基因在 靶細胞富集,為實現(xiàn)基因高效轉(zhuǎn)染提供必要的先決條件,同時也大大降低微泡在正常組織 的濃度,極大地減少了對正常組織產(chǎn)生副作用的可能。有研究表明,雙靶向微泡能與不同的 腫瘤細胞表面標記性分子結(jié)合,更好地克服血流剪切力的影響,增加超聲微泡與腫瘤靶細 胞的粘附機會,增強微泡的靶向效能,從而提高其所攜帶基因在靶組織的富集程度。整合素 是細胞黏附分子家族中的一類生物分子,由125kDa的a v亞基和105kDa的0亞基形成跨 膜異二聚體,在腫瘤血管內(nèi)皮細胞及部分腫瘤細胞上均呈高表達,而在休眠狀態(tài)的內(nèi)皮細 胞和正常細胞上幾乎不表達,廣泛參與細胞之間的相互作用及腫瘤血管的生成,與腫瘤細 胞的粘附,增殖和迀移密切相關(guān),其中整合素ave3(Integ rinav0 3)的作用尤為重要, 是許多抗腫瘤血管生成藥物的靶點。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的iRGD肽是一種 環(huán)狀的穿膜肽,與整合素a 3受體具有高親和力,同時具有祀向Neuropilin-1受體和加 速大分子物質(zhì)(基因或藥物)遞送入腫瘤細胞的功能。iRGD穿膜肽能與腫瘤血管形成有 關(guān)的整合素蛋白結(jié)合,然后這種肽被劈開,成為激活的CendR肽,后者與neuropilin-1相結(jié) 合。CendR/neuropilin-1的結(jié)合調(diào)控著一種激活的運輸系統(tǒng),讓同時注射的治療物質(zhì)從血 管中滲出。這種傾注在血管外的腫瘤組織中繼續(xù)發(fā)生,從而讓治療分子越來越深地滲透到 腫瘤組織中。單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1),主要表達于單核細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞,是 一類參與血管形成的趨化因子,許多腫瘤細胞均可分泌MCP-1因子促進腫瘤血管的生成, 在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌等腫瘤中MCP-1因子的分泌與腫瘤微血管的密度及侵襲能 力密切相關(guān)。MCP-1介導(dǎo)血管生成的途徑主要依賴于MCP-1與其特異性受體一一CC類趨化 因子受體2(CCR2)之間的相互作用。CCR2被發(fā)現(xiàn)在部分腫瘤血管內(nèi)皮細胞上呈現(xiàn)高表達狀 態(tài),MCP-1直接作用于內(nèi)皮細胞上的CCR2受體,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞趨化。MCP-1/CCR2的激活直 接參與腫瘤血管的生成和進展,促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,且這種作用與內(nèi)皮細胞上的CCR2受 體表達情況呈正相關(guān)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明提供了一種攜帶iRGD穿膜肽雙靶向陽離子超聲微泡制備方法;本發(fā)明將 革巴向Integrin a v 0 3的iRGD穿膜肽與抗CCR2抗體結(jié)合至微泡表面,構(gòu)建雙革E1向陽離子超 聲造影劑,該雙靶向陽離子超聲微泡粒徑分布均勻,具有攜載質(zhì)粒DNA和靶向腫瘤細胞雙 重功能,可作為質(zhì)粒DNA的傳輸載體,使質(zhì)粒在腫瘤組織周圍富集,聯(lián)合超聲介導(dǎo)的生物學 效應(yīng)和iRGD的穿膜作用,促進基因進入腫瘤細胞內(nèi),提高基因轉(zhuǎn)染效率,有望發(fā)展應(yīng)用于 可視化超聲控釋基因治療腫瘤。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案的實施如下:
[0007] -種攜帶iRGD穿膜肽雙靶向陽離子超聲微泡制備方法,包括以下工藝步驟:
[0008] (l)DSPE-PEG2000-iR⑶的制備
[0009] ①稱量:按照摩爾比1. 5 : 1稱量藥品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide ;
[0010] ②溶解:將藥品iR⑶和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中,加雙蒸水4ml溶 解,吹勻;
[0011] ③反應(yīng):將裝有藥品的西林瓶置于冰塊中,磁力攪拌24h ;
[0012] ④透析:取一大燒杯,裝滿蒸餾水,將反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)(Mw :3500)置 于大燒杯內(nèi),將大燒杯維持在冰塊環(huán)境中,磁力攪拌透析48h,每隔4h換一次雙蒸水以及冰 塊;
[0013] ⑤冷凍干燥:透析完畢后,將透析好的溶液轉(zhuǎn)移至西林瓶中,置于-80°C中凍存約 4h至固體,取出置冷凍干燥機中干燥48h ;
[0014] ⑥存放:干燥完畢后,封口,貼標簽,于-20°C中保存;
[0015] (2)Stearie_PEI600 的制備
[0016] ①取0. 35gN,N' -羰基二咪唑(CDI)和0. 6g硬脂酸(Stearic)分別溶解于10ml 無水氯仿中,〇. 7g支鏈PEI600溶解于20ml無水氯仿中,分別得N,N'_羰基二咪唑溶液、硬 脂酸溶液、支鏈PEI600溶液備用;
[0017] ②將①中所得的N,N'-羰基二咪唑溶液進行磁力攪拌,在不斷磁力攪拌下,將① 中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N,N' -羰基二咪唑溶液中,得混合物溶液一,將混合物溶液 在氬氣保護下反應(yīng)2小時后,再將其逐滴加入支鏈PEI600溶液中,得混合物溶液二備用;
[0018] ③將②中所得的混合物溶液二在氬氣保護下于室溫環(huán)境中進一步攪拌24小時, 所得產(chǎn)物在冷乙醚中沉淀純化,然后放入大型離心機中清洗除去未反應(yīng)的溶劑l〇min,收集 上清液得到純化的Stearic-PEI600 ;然后將清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空 干燥機中干燥數(shù)小時,完畢后置于_20°C儲物箱中保存,制備微泡時將其融于無水氯仿中使 用;
[0019] (3)雙靶向陽離子超聲微泡的制備
[0020] ①將 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin 溶解于 三氯甲烷中,按摩爾比8.5 : 0.5 : 0.5 : 0.5取上述配制的溶液于干凈試管中,將試管置 于旋轉(zhuǎn)儀,使用干燥的隊氣流除去溶劑使其在試管壁上形成一層均勻的薄膜,真空烘箱中 干燥3小時以上,備用;
[0021] ②在試管中加入一定體積的Tris緩沖溶液,得到一定濃度的磷脂溶液,加熱磷脂 溶液到其相轉(zhuǎn)變溫度(55-60°C)以上,并用水浴超聲制成透明的磷脂溶液,將所得磷脂溶 液分裝入潔凈西林瓶中(1ml/瓶),用全氟丙烷(C3F8)置換瓶中的空氣,機械震蕩器震蕩 30s后形成生物素化的陽離子MBiR⑶微泡;
[0022] ③將所得生物素化的陽離子MBiR⑶微泡用PBS借助離心漂浮法清洗三次,然后加 入60 y g抗CCR2抗體孵育20分鐘,離心清洗除去過量的未結(jié)合的抗體,制得攜iRGD穿膜 肽雙靶向陽離子超聲微泡。
[0023]制成所述超聲微泡成分為:DSPC、DSPE-PE62000-maleimide、 DSPE-PEG2000-Biotin、iR⑶肽、抗CCR2抗體、硬脂酸、支鏈聚醚酰亞胺-600、N,N' -羰基 二咪唑、抗生物素蛋白。
[0024] 所述純化的Stearic_PEI600在大型離心機清洗時轉(zhuǎn)數(shù)為3000rpm。
[0025] 所述Tris緩沖溶液含10%甘油和10%丙二醇,pH為7. 4。<