高負(fù)載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米藥物，具體涉及一種高負(fù)載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥嚴(yán)重危害著人類的生命健康，其發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)僅次于心臟病和傳染疾病。目前，癌癥的主要治療手段有手術(shù)切除、放射療法和化學(xué)療法三種。如果腫瘤只在某個(gè)局部范圍內(nèi)生長(zhǎng)或發(fā)現(xiàn)時(shí)間較早，適合采用手術(shù)切除和放射療法這兩種治療手段。但是，通常病人發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)候己經(jīng)處于癌癥中晚期，且常常伴隨著病灶轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的跡象，這種情況下化學(xué)療法才是病人存活的唯一希望。傳統(tǒng)的化學(xué)療法是通過口服或靜脈注射抗癌藥物(如阿霉素、喜樹堿、紫杉醇、順鈾等，使這些抗癌藥物經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)腫瘤部位，以此殺死癌細(xì)胞。然而，這些臨床中使用的抗癌藥物通常具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，并且缺乏特異識(shí)別性，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)殺死正常的組織細(xì)胞。此外，化學(xué)療法還存在藥物生物利用率低的缺點(diǎn)，具體表現(xiàn)為癌細(xì)胞對(duì)藥物的攝入效率較低，藥物在血液循環(huán)過程中難以跨過生理障礙到達(dá)腫瘤部位。這些問題都不同程度地限制了抗癌藥物的使用劑量和應(yīng)用范圍，阻礙了化學(xué)療法在癌癥治療中的應(yīng)用，亟待人們的解決。
[0003]納米材料由于具有獨(dú)特的尺寸優(yōu)勢(shì)，靶向功能，可跨越生理屏障，多功能性，能增溶疏水性藥物，可提高藥物的穩(wěn)定性，對(duì)藥物的可控釋放，降低藥物的毒副作用等化學(xué)和物理特性，使其在藥物傳輸方面具有很多優(yōu)越性，受到了材料科學(xué)家和臨床醫(yī)生的重視并得到了廣泛的研究。納米鉆石因其具有低毒性、高生物相容性和表面易修飾特性，將其作為載體制備納米藥物時(shí)受到了眾多研究者的青睞。PEG在水溶液和一些溶劑中具有極好的溶解性，無毒且具有低的免疫原性，這使其制備過程具有靈活性且在制備腫瘤藥物中得到了廣泛應(yīng)用?；诖?，本文以H2N-PEG-COOH修飾納米鉆石，在檸檬酸鈉或醋酸鈉作用下物理吸附化療藥物阿霉素制備得到高負(fù)載及PH控釋的納米藥物，并研究了該種藥物的抗腫瘤活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種高負(fù)載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的一種高負(fù)載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)取真空干燥的羧基化納米鉆石，按每毫克羧基化納米鉆石加入1-1.5mL的濃度為0.1M、pH為5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每毫克羧基化納米鉆石加入0.2mg EDC, 0.25mg NHS，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h，反應(yīng)完畢后以15000rpm高速離心5min棄除上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；接著將活化羧基的納米鉆石沉淀物迅速分散到濃度為0.1Μ、ρΗ為8.4的硼酸緩沖溶液中，經(jīng)過短暫超聲分散形成懸濁液，再按每毫克活化的羧基化納米鉆石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，待反應(yīng)結(jié)束，以15000rpm高速離心5min吸除上清液，并用0.1Μ、ρΗ 8.4的硼酸緩沖溶液高速離心洗滌三次，獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
[0007](2)取真空干燥的納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH) lmg,按每毫克ND-PEG-C00H加入l_1.5mL檸檬酸鈉(Na3Cit, 1.0M)溶液，超聲分散I小時(shí)形成懸濁液，再按每毫克ND-PEG-C00H加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于搖勻儀上反應(yīng)6小時(shí)，待反應(yīng)完畢，以15000rpm高速離心5min收集上清液，并用1.0M朽1檬酸鈉(Na3Cit)繼續(xù)以15000rpm高速離心5min洗滌三次，制得納米鉆石-聚乙二醇-阿霉素/檸檬酸鈉(ND-PEG-D0X/Na3Cit)納米藥物，真空干燥，冷藏，避光保存。
[0008]所述的檸檬酸鈉可以用醋酸鈉替代。
[0009]上述制備的高負(fù)載及pH可控釋放阿霉素的納米鉆石藥物可以在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)；PEG因其在水溶液和一些溶劑中具有極好的溶解性、無毒且具有低的免疫原性等優(yōu)勢(shì)，使制備過程具有靈活性。與本實(shí)驗(yàn)室前期研究相比較，本文發(fā)明的納米藥物其載藥量比之高了 5-6倍，且在腫瘤環(huán)境中的釋藥率高達(dá)到80%，而在正常組織環(huán)境中卻相對(duì)穩(wěn)定，釋藥率僅為7%，這均比前期研究略勝一籌。通過納米載體ND-PEG與人肝癌細(xì)胞0fepG2)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG載體具有生物兼容性；將納米載體納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG)在檸檬酸鈉或醋酸鈉作用下，物理吸附阿霉素，制備得到ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc納米藥物，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞攝取ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc實(shí)驗(yàn)，表明ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG_D0X/NaAc均可以進(jìn)入細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的活性，表明該納米藥物不僅可以降低化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，而且能提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，所以ND-PEG-D0X/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0011]圖1各種納米顆粒的紅外光譜圖
[0012]圖2A不同pH對(duì)納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit體外釋藥的影響
[0013]圖2B不同pH對(duì)納米藥物ND-PEG-D0X/NaAc體外釋藥的影響
[0014]圖3A用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的散點(diǎn)圖
[0015]圖3B用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND_PEG_D0X/Na3Cit的散點(diǎn)圖
[0016]圖3C用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND-PEG_D0X/NaAc的散點(diǎn)圖
[0017]圖4A用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的熒光強(qiáng)度圖
[0018]圖4B用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND_PEG_D0X/Na3Cit的熒光強(qiáng)度圖
[0019]圖4C用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND-PEG_D0X/NaAc的熒光強(qiáng)度圖
[0020]圖5A不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)H印G2細(xì)胞活性的影響
[0021]圖5B不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞活性的影響
[0022]圖5C不同濃度的納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞活性的影響
[0023]圖6A納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間HepG2細(xì)胞活性的影響
[0024]圖6B納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間HeLa細(xì)胞活性的影響
[0025]圖6C納米藥物ND-PEG-D0X/Na3Cit對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間MCF-7細(xì)胞活性的影響
[0026]圖7A納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間MCF-7細(xì)胞活性的影響
[0027]圖7B納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間HeLa細(xì)胞活性的影響
[0028]圖7C納米藥物ND-PEG-DOX/NaAc對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間MCF-7細(xì)胞活性的影響
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下為實(shí)施例中使用的材料:
[0030]納米鉆石(ND，元素六，直徑大約140nm, Ireland)。
[0031]阿霉素(DOX)是鹽酸多柔比星，分子式為C27H29NO11.HCl，分子量為579.99，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格按C27H29NO11.HCl計(jì)算為10mg。
[0032]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,分子量為2000)為上海西寶生物有限公司生產(chǎn)。
[0033]二水合檸檬酸鈉(C6H5Na3O7.2H20，分子量為294.10)為阿拉