專利名稱：微泡超聲造影劑及其與抗體、靶向基團(tuán)、基因連接的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及應(yīng)用于超聲診斷與治療的可攜帶藥物的微泡超聲造影劑，尤其涉及一類可有效連接抗體、靶向基團(tuán)、基因等藥物的微泡超聲造影劑，本發(fā)明還涉及該微泡超聲造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因進(jìn)行連接的方法。
背景技術(shù)：
超聲造影劑是一類能夠顯著增強(qiáng)醫(yī)學(xué)超聲檢測信號的診斷藥劑，在人體微小血管和組織灌注檢測與成像方面，使用超聲造影劑進(jìn)行超聲檢測具有成像效果好、實(shí)時、操作簡便、無離子輻射、無損性、適用面廣等優(yōu)點(diǎn)，因此在醫(yī)學(xué)臨床檢測中得到了越來越多的應(yīng)用。由于超聲成像是基于回波信號的反射強(qiáng)度，而微泡具有較強(qiáng)的回波反射性能，因此被認(rèn)為是目前最好的人體微管內(nèi)的造影材料，以微泡制成的超聲造影劑稱為微泡型超聲造影劑。超聲造影劑的出現(xiàn)，開創(chuàng)了無創(chuàng)傷超聲醫(yī)學(xué)的一個嶄新的領(lǐng)域，除了作為超聲診斷藥劑之外，近年來還發(fā)現(xiàn)微泡超聲造影劑具有分子成像、促進(jìn)血栓溶解、促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染及藥物體內(nèi)運(yùn)輸定點(diǎn)釋放等作用。
利用靶向分子導(dǎo)向一直是非?；钴S的一個研究領(lǐng)域，但由于目前對生物體本身各類生化作用的特異性還遠(yuǎn)缺乏了解，這對該方法的應(yīng)用產(chǎn)生了一個目前仍然無法克服的瓶頸效應(yīng)。采用在微米微泡及亞微米或納米載藥微球膜上分別引入能發(fā)生相互作用的分子或基團(tuán)，然后將微泡與微球載藥體按一定比例連接，靜脈注入體內(nèi)后，在特定組織部位通過超聲引爆微米微泡，利用微泡崩潰時產(chǎn)生的能量將周圍連接的微球擊碎，從而達(dá)到藥物及微泡的靶向運(yùn)輸與控制釋放的目的，這一過程可以同時實(shí)現(xiàn)造影與釋藥，即同時實(shí)現(xiàn)診斷與治療的目的。由于不涉及體內(nèi)的生化反應(yīng)，而微泡與微球的連接易通過一些化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)，此外由于體外超聲引爆微米微泡的無損性、安全性和可控性在微泡超聲造影劑的應(yīng)用中已得到廣泛證實(shí)，因此認(rèn)為這一方案可能會成為今后較短時期內(nèi)靶向給藥及控制釋放的突破點(diǎn)。除了可以在微泡表面接入載藥微球之外，也可在微泡制備時將藥物包裹在微泡中，形成同時包裹藥物和氣體的載藥載氣的微泡體，如果在內(nèi)部包裹藥物的表面接入靶向分子，則可以實(shí)現(xiàn)微泡定向引爆和靶向分子導(dǎo)向的雙重靶向作用。
微泡超聲造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因等熱敏性藥物或非熱敏性藥物的高效連接尚未見有實(shí)質(zhì)性方法報(bào)道，一般直接將微泡與藥物混合，一方面藥物直接與微泡連接的效率極差，另一方面容易造成空間位阻，降低藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類可高效連接抗體、靶向基團(tuán)、基因的超聲微泡造影劑，解決了微泡與抗體、靶向基團(tuán)、基因等藥物連接時的效率問題，和容易造成空間位阻的問題。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述超聲微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因進(jìn)行連接的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，可有效連接抗體、靶向基團(tuán)、基因的超聲微泡造影劑，由微泡膜和膜內(nèi)填充的氣體組成，膜內(nèi)氣體為氮?dú)?、空氣、二氧化碳、氧氣、惰性氣體、六氟化硫、氟里昂類或全氟化碳，其特點(diǎn)是，微泡膜按重量百分比，其組成為，
連接作用的聚合物1％～50％其它成膜材料1％～90％膜穩(wěn)定劑1％～50％乳化劑 1％～15％連接作用的聚合物為低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，其它成膜材料選自糖類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、磷脂類物質(zhì)、聚合物、改性蛋白質(zhì)、表面活性劑、高級脂肪醇類或高級脂肪酸類的一種或一種以上的組合。
本發(fā)明所采用的另一技術(shù)方案是，利用上述超聲微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因進(jìn)行有效連接的方法，具體包括以下步驟a.按重量百分比，選取微泡膜材料，其組成為，連接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜穩(wěn)定劑1％～50％，乳化劑1％～15％，連接作用的聚合物為低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，其它成膜材料選自糖類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、磷脂類物質(zhì)、聚合物、改性蛋白質(zhì)、表面活性劑、高級脂肪醇類或高級脂肪酸類的一種或一種以上的組合，膜穩(wěn)定劑包括碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪醇類和具有較高黏度的多元醇類、碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪酸類、纖維素類、糖類物質(zhì)、油脂類、呈液體形式存在的聚合度小于200的聚合物；b.將上述選取的微泡膜材料制備成微泡超聲造影劑；c.使抗體、靶向基團(tuán)、基因不失活的狀態(tài)下，將上述制得的微泡超聲造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因混合均勻，即完成了超聲微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因的連接。
本發(fā)明采用在微泡膜材料中加入低熔點(diǎn)的長直鏈生物相容性聚合物或不造成空間位阻的帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，而生成一類新的微泡超聲造影劑，使加入的低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或不造成空間位阻的帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物作為與微泡的粘合連接臂，微泡通過該連接臂與藥物連接，從而解決了空間位阻問題，實(shí)現(xiàn)了造影劑微泡與抗體、靶向基團(tuán)、基因等藥物的高效連接。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的超聲微泡造影劑的膜材料，按重量百分比，其組成為連接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜穩(wěn)定劑1％～50％，乳化劑1％～15％。微泡制備時，首先要將膜材料配成膜溶液，膜溶液中需加入緩沖劑。
其它成膜材料即為現(xiàn)在常用的糖類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、聚合物、改性蛋白質(zhì)或表面活性劑的一種或一種以上的組合，還包括高級脂肪醇類、高級脂肪酸類等物質(zhì)的一種或與其它膜材料一種以上的組合。膜穩(wěn)定劑包括碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪醇類和具有較高黏度的多元醇類、碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪酸類、纖維素類、糖類物質(zhì)、油脂類等、呈液體形式存在的聚合物類如聚合度200的聚乙二醇。膜內(nèi)氣體可以是現(xiàn)在常用的氮?dú)?、空氣、二氧化碳、氧氣、惰性氣體、六氟化硫、氟里昂類或全氟化碳，本發(fā)明的特點(diǎn)是在現(xiàn)有的超聲微泡造影劑的膜材料中引入低熔點(diǎn)的長直鏈生物相容性聚合物，或不造成空間位阻的其它帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，即連接作用的聚合物，使之成為微泡的粘合連接臂，使藥物不直接與微泡連接，從而解決了空間位阻問題。
連接作用的聚合物為低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，低熔點(diǎn)聚合物可以是聚合度相同的一種聚合物，也可以是熔點(diǎn)較低的不同聚合物的混合體，可以是低聚合度液態(tài)形式存在的聚合物與同類或不同類高聚合度固態(tài)形式存在的聚合物的混合體?？蛇x自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸類、氨基酸-非氨基酸共聚物類、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸鈉、聚酯類或聚醚類其中的一種或一種以上的組合。
微泡連接抗體基因等藥物時，根據(jù)采用溫度的不同，選取在該溫度下具有粘滯性的聚合物，粘滯性的聚合物指的是該聚合物在該溫度下具有粘滯性，其性質(zhì)介于固態(tài)與液態(tài)之間或附近，如聚合度800左右的聚乙二醇。
將選取的微泡膜材料采用聲空化方法、噴霧干燥法、冷凍干燥法、乳液聚合等常規(guī)方法制備得到微泡超聲造影劑，使抗體、靶向基團(tuán)、基因不失活并稍高于體溫下、常溫下或低溫情況下，將含有在該溫度下具有粘滯性的聚合物的微泡與抗體、基因等熱敏性藥物或非熱敏性藥物混合均勻，即可實(shí)現(xiàn)微泡與抗體、靶向基團(tuán)或基因等熱敏性藥物或非熱敏性藥物的簡單、高效結(jié)合。
實(shí)施例1帶有聚乙二醇粘合連接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇800 (連接作用的聚合物)12.5g(50％)聚乙二醇3000 (膜材料) 0.25g(1％)Tween80 (乳化劑) 0.25g(1％)
蔗糖(膜穩(wěn)定劑)12g(48％)生理鹽水(緩沖劑) 余量實(shí)施例2帶有聚乙二醇連接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇800 (連接作用的聚合物)0.5g(1％)聚乙二醇3000 (膜材料) 17g(34％)Tween80 (乳化劑) 7.5g(15％)月桂酸 (膜穩(wěn)定劑)25g(50％)pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液(緩沖劑) 余量實(shí)施例3帶有聚乙二醇連接臂的微泡膜溶液配方聚乙二醇600 (連接作用的聚合物) 0.4g(1％)聚乙二醇800 (連接作用的聚合物) 1.6g(4％)聚乙二醇1500 (膜材料)24g(60％)span60 (膜材料)12g(30％)Tween80 (乳化劑)1.6g(4％)葡萄糖 (膜穩(wěn)定劑) 0.4g(1％)pH7.01的磷酸鹽緩沖溶液(緩沖劑) 余量實(shí)施例4帶有聚乙二醇連接臂的微泡膜溶液配方其中，連接作用的聚合物24％，其它成膜材料24％，膜穩(wěn)定劑38％，乳化劑14％，聚乙二醇600 (連接作用的聚合物) 3g
聚乙二醇800 (連接作用的聚合物) 3g聚乙二醇3000 (膜材料) 3g聚乙二醇4000 (膜材料) 2g聚乙二醇6000 (膜材料) 1gOP-10 (乳化劑) 3.5g葡萄糖(膜穩(wěn)定劑) 5.5g甘油 (膜穩(wěn)定劑) 4gpH7.0的磷酸鹽緩沖溶液(緩沖劑)余量實(shí)施例5帶有聚乙二醇和聚乙烯醇連接臂的微泡膜溶液配方其中，連接作用的聚合物10％，其它成膜材料70％，膜穩(wěn)定劑10％，乳化劑10％，聚乙二醇600(連接作用的聚合物)1g聚乙二醇800(連接作用的聚合物)1g聚乙二醇3000 (膜材料) 4g聚乙二醇4000 (膜材料) 4g聚乙烯醇1500 (膜材料) 6gOP-10 (乳化劑) 2g葡萄糖 (膜穩(wěn)定劑)1g枸杞多糖 (膜穩(wěn)定劑)1g生理鹽水 (緩沖劑) 余量實(shí)施例6帶有聚乙烯醇連接臂的微泡膜溶液配方
其中，連接作用的聚合物30％，其它成膜材料20％，膜穩(wěn)定劑40％，乳化劑10％，聚乙烯醇600(連接作用的聚合物)5.1g聚乙烯醇1500 (膜材料) 3.4gOP-10 (乳化劑) 1.7g羥乙基纖維素 (膜穩(wěn)定劑)1.8g葡萄糖 (膜穩(wěn)定劑)5gpH7.0的磷酸鹽緩沖溶液(緩沖劑)余量實(shí)施例7帶有聚乙烯醇連接臂的微泡膜溶液配方其中，連接作用的聚合物24％，其它成膜材料20％，膜穩(wěn)定劑41％，乳化劑15％，聚乙烯醇600(連接作用的聚合物)4.8g聚乙烯醇1500 (膜材料) 2gSpan60 (膜材料) 2OP-10 (乳化劑) 3g月桂醇 (膜穩(wěn)定劑)8.2gpH7.0的磷酸鹽緩沖溶液(緩沖劑)余量實(shí)施例8微泡膜溶液配方其中，連接作用的聚合物18％，其它成膜材料32％，膜穩(wěn)定劑48％，乳化劑2％，
聚乙烯醇600(連接作用的聚合物)4g人血清白蛋白 (膜材料) 5g聚乙烯醇1500 (膜材料) 2g甘油 (膜穩(wěn)定劑)2g可溶性淀粉 (膜穩(wěn)定劑)0.6g葡萄糖 (膜穩(wěn)定劑)2g蔗糖 (膜穩(wěn)定劑)6gTween80(乳化劑) 0.4g生理鹽水 (緩沖劑) 余量實(shí)施例9微泡膜溶液配方，其中，連接作用的聚合物29％，其它成膜材料30％，膜穩(wěn)定劑40％，乳化劑1％，聚乙二醇800(連接作用的聚合物)10g人血清白蛋白 (膜材料) 6g聚乙二醇1500 (膜材料) 4.5gtween80(乳化劑) 0.35g甘油 (膜穩(wěn)定劑)4g葡萄糖 (膜穩(wěn)定劑)10g生理鹽水 (緩沖劑) 余量實(shí)施例10采用實(shí)施例1配方進(jìn)行微泡制備方法采用聲空化方法，將上述實(shí)施例1的膜溶液在超聲功率500瓦聲處理3分鐘，過程中給膜溶液中通入六氟化硫氣體，制備后的微泡液體于分液漏斗中靜置20分鐘以上，取下層呈微粉懸浮的微泡作為制備出的微泡超聲造影劑。該微泡平均直徑2.8微米，微泡濃度1.87×109。
實(shí)施例11采用實(shí)施例2進(jìn)行微泡制備方法采用聲空化方法，將上述實(shí)施例2的膜溶液在超聲功率400瓦聲處理5分鐘，過程中給膜溶液中通入全氟丙烷氣體，制備后的微泡液體于分液漏斗中靜置20分鐘以上，取下層呈微粉懸浮的微泡作為制備出的微泡超聲造影劑。該微泡平均直徑3.17微米，微泡濃度2.34×109。
實(shí)施例12采用實(shí)施例8配方進(jìn)行微泡制備方法將上述實(shí)施例8含蛋白膜材料在20KHZ、800W時進(jìn)行超聲波空化處理，過程中通入全氟丙烷，制備出的微泡直徑分布小于10個微米，微泡濃度1.12×109。
實(shí)施例13將上述實(shí)施例8含蛋白膜溶液混合均勻后，在1萬轉(zhuǎn)高速乳化機(jī)下滴入含有3％span60的大豆油中，滴完后將乳化機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)制到1.5萬轉(zhuǎn)均質(zhì)5分鐘，此后將大豆油溫度升高到100度以上，并持續(xù)乳化5分鐘，冷卻，將固體部分過濾收集，石油醚洗滌除油后于80攝氏度真空干燥10小時。制備出的微泡前體白色粉末直徑分布可從幾十個到幾百個納米，使用時在該前體粉末中加入生理鹽水等即可形成直徑分布在幾十個到幾百個納米的微泡。
實(shí)施例14微泡與抗球蛋白抗體結(jié)合實(shí)例常溫下將制備出的微泡與抗體混合均勻，靜置1分鐘后即可實(shí)現(xiàn)微泡與抗球蛋白抗體的結(jié)合，結(jié)合率大于95％。采用免疫熒光法可觀測到抗體緊密結(jié)合在微泡表面。
實(shí)施例15微泡與其它蛋白質(zhì)類物質(zhì)的結(jié)合4℃下將制備出的微泡與蛋白質(zhì)類物質(zhì)如人血清白蛋白混合均勻，靜置1分鐘后即可實(shí)現(xiàn)微泡與人血清白蛋白的良好結(jié)合，結(jié)合率大于95％。
實(shí)施例16微泡與小分子肽類物質(zhì)的結(jié)合實(shí)例如靶向血栓，在常溫下將制備出的微泡與對血栓具有親和力的Dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH.2混合均勻，靜置1分鐘后即可實(shí)現(xiàn)微泡與該小分子肽類物質(zhì)的結(jié)合，結(jié)合后的微泡具有靶向血栓的能力。
實(shí)施例17微泡與基因物質(zhì)的結(jié)合實(shí)例4℃下將制備出的微泡與基因類物質(zhì)混合均勻，靜置1分鐘后即可實(shí)現(xiàn)微泡與基因類物質(zhì)的良好結(jié)合，結(jié)合率大于95％。
實(shí)施例18實(shí)施例13所得微泡超聲造影劑與抗體、小分子肽、基因等的連接方法將所得白色粉末分散到含有抗體、或小分子肽或基因等的溶液中，200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?分鐘后即獲得帶有抗體、或小分子肽或基因的微泡。
權(quán)利要求
1.一種可有效連接抗體、靶向基團(tuán)、基因的超聲微泡造影劑，由微泡膜和膜內(nèi)填充的氣體組成，膜內(nèi)氣體為氮?dú)?、空氣、二氧化碳、氧氣、惰性氣體、六氟化硫、氟里昂類或全氟化碳，其特征在于，所述的微泡膜按重量百分比，其組成為，連接作用的聚合物1％～50％其它成膜材料1％～90％膜穩(wěn)定劑1％～50％乳化劑 1％～15％所述連接作用的聚合物為低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，所述其它成膜材料選自糖類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、磷脂類物質(zhì)、聚合物、改性蛋白質(zhì)、表面活性劑、高級脂肪醇類或高級脂肪酸類的一種或一種以上的組合。
2.按照權(quán)利要求1所述的超聲微泡造影劑，其特征在于，所述低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物為聚合度相同的一種聚合物或聚合度不同的一種以上聚合物的混合體。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的超聲微泡造影劑，其特征在于，所述連接作用的聚合物選自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸類、氨基酸-非氨基酸共聚物類、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸鈉、聚酯類或聚醚類其中的一種或一種以上的組合。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的超聲微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因進(jìn)行有效連接的方法，其特征在于，具體包括以下步驟a.按重量百分比，選取微泡膜材料，其組成為，連接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜穩(wěn)定劑1％～50％，乳化劑1％～15％，所述連接作用的聚合物為低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物或帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性聚合物，所述其它成膜材料選自糖類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、磷脂類物質(zhì)、聚合物、改性蛋白質(zhì)、表面活性劑、高級脂肪醇類或高級脂肪酸類的一種或一種以上的組合，b.將上述選取的微泡膜材料制備成微泡超聲造影劑；c.使抗體、靶向基團(tuán)、基因不失活的狀態(tài)下，將上述制得的微泡超聲造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因混合均勻，即完成了超聲微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因的連接。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述低熔點(diǎn)長直鏈生物相容性聚合物為聚合度相同的一種聚合物或聚合度不同的一種以上聚合物的混合體。
6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述連接作用的聚合物選自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨基酸類、氨基酸-非氨基酸共聚物類、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙烯酸鈉、聚酯類或聚醚類其中的一種或一種以上的組合。
7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜穩(wěn)定劑包括碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪醇類和具有較高黏度的多元醇類、碳原子數(shù)十二以下的低級脂肪酸類、纖維素類、糖類物質(zhì)、油脂類、呈液體形式存在的聚合度小于200的聚合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的微泡超聲造影劑，按重量百分比組成為，連接作用的聚合物1％～50％，其它成膜材料1％～90％，膜穩(wěn)定劑1％～50％和乳化劑1％～15％。該微泡造影劑與抗體、靶向基團(tuán)、基因的連接方法是以具有低熔點(diǎn)的長直鏈生物相容性聚合物作為微泡膜的組分之一，或采用不造成空間位阻的其它帶有小側(cè)鏈基團(tuán)的生物相容性低熔點(diǎn)聚合物作為微泡膜的組分之一，在使抗體、靶向基團(tuán)、基因等不失活并稍高于體溫下、常溫下或低溫等情況下，將制得的微泡與抗體或基因等熱敏性藥物或非熱敏性藥物混合均勻，即實(shí)現(xiàn)微泡與抗體或基因等藥物的簡單、高效結(jié)合。本發(fā)明解決了抗體、靶向基團(tuán)、基因等藥物與造影劑微泡連接的問題，并消除了藥物直接微泡而造成的空間位阻問題，具有簡單、實(shí)用的特征。
文檔編號A61K49/22GK1985996SQ20061010519
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者杜永峰, 姚秉華, 高彩霞 申請人:西安理工大學(xué)