專利名稱：大腸癌特異性抗原肽及大腸癌檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大腸癌特異性抗原肽的表達載體及構(gòu)建方法、大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及操作方法。
背景技術(shù)：
大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率位于第三，在我國則有逐年上升的趨勢，在上海已位居惡性腫瘤發(fā)病率第二位。根據(jù)中國衛(wèi)生部衛(wèi)生信息2007年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第3位，大腸癌死亡率為10.25 / 10萬，占癌癥致死第5 位。大腸癌根據(jù)1匪分期不同可分為I、II、III、IV期，各期大腸癌預后相差很大，早期大腸癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移率低，預后良好，術(shù)后5年生存率可達97%，進展期大腸癌術(shù)后5年生存率僅為40%-50%。因此探索大腸癌早期診斷和篩查方法非常重要。目前常用的大腸癌檢查方法有直腸指診、糞便隱血實驗、結(jié)腸鏡及影像學檢查。而這些檢查都存在有不足之處，直腸指診范圍局限，糞隱血實驗敏感性及特異性差，結(jié)腸鏡檢查有一定痛苦，患者較難接受，影像學檢查對于早期腫瘤不敏感。目前常用的腫瘤標志物如癌胚抗原(CEA)，CA19-9等指標缺乏敏感性及特異性，不能對大腸癌進行早期診斷。因此建立能高通量診斷大腸癌的特異檢查方法是當務之急。

發(fā)明內(nèi)容
腫瘤發(fā)生后，腫瘤細胞表面的特征抗原或腫瘤細胞分泌的特征抗原刺激機體產(chǎn)生抗體，這些抗體可存在于尚無癥狀的早期腫瘤患者血清中。通過尋找大腸癌特征抗原，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而做為分子標志，可以早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，與現(xiàn)行的其他方法相比，具有微創(chuàng)、簡單、經(jīng)濟、敏感度及特異度高等特點，方便用于社區(qū)人群的篩查，從而達到早期檢測大腸癌的目的。本發(fā)明的第一個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽，利用它來檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而作為分子標志來早期發(fā)現(xiàn)大腸癌。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種大腸癌特異性抗原肽的表達載體。本發(fā)明的第三個目的在于提供該表達載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第四個目的在于提供包含表達載體的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，用于檢測早期大腸癌。本發(fā)明的第五個目的在于提供該試劑盒的制備及其操作方法。本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2、SEQ IDNo. 4,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8，或 SEQ ID No. 10 所示。本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽的表達載體，由噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構(gòu)成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No. USEQ ID No. 3,SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9所示。優(yōu)選的，所述噬菌體為17噬菌體。本發(fā)明提供的大腸癌特異性抗原肽表達載體的構(gòu)建方法，包括a)構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA,等量混合成Img后抽提mRNA,應用ol igo dT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA末端進行平齊，加Ecol I和Hind III接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入17噬菌體雙臂，進行體外包裝，構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫；b)親和篩選大腸癌特異抗原肽取10 iilA/G的瓊脂糖珠置于一 1.5ml離心管中，用pH7. 4的500 ill PBS洗2次，1%BSA4°C封閉lh，瓊脂糖珠分別與15iU大腸癌患者及對照患者的血漿4°C孵育過夜， 500 u I PBS洗滌3次后，用10 ill PBS溶解富集到的抗體，10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管，取所述噬菌體展示肽庫擴增液20iU，先與20iU的非大腸癌抗體孵育lh，未結(jié)合的上清再與20 Ul大腸癌抗體結(jié)合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用100 u 11%SDS洗脫，將其轉(zhuǎn)染細菌至擴增，完成一輪親和篩選，重復上述步驟，反復進行五輪親和篩選；c)血清學篩選大腸癌早期檢測分子標志Cl)混合血樣初篩篩選后得到的噬菌體展示肽庫用LB液體培養(yǎng)基I: IO8稀釋后，取100 U I噬菌體液、250 u I新?lián)u好的BLT5403細菌，3ml保溫55°C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿中，冷卻后，37°C溫箱孵育4小時，可見有單個的噬菌斑形成，每I個I. 5ml離心管中，加入Iml新?lián)u好的細菌BLT5403，隨機挑取單個的、邊界清晰的噬菌體于I個I. 5ml離心管中，共隨機挑選噬菌體克隆2000個，并按順序編號，挑好的噬菌體置37°C恒溫振蕩器搖4小時以上，直至每一管液體均變澄清為止，挑選好的噬菌體克隆置4°C保存，用T7引物進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體克隆的插入片段，挑取擴增片段200bp以上的噬菌體克隆進行ELISA實驗進一步篩選；所述ELISA實驗的步驟為將I7TAILER抗體用pH7. 4的PBS按I :1000來稀釋，每孔取100 U I包被于96孔酶標板，4°C搖床輕搖過夜；用洗液洗板，每孔300 U 1，洗四次，每次約I分鐘，拍干；采用200 U 12%BSA/PBS于26°C封閉2小時；用洗液洗板，每孔300 U 1，洗四次，每次約I分鐘，拍干；加入用1%BSA以I :5比例稀釋的噬菌體100 iil，每個標本加4孔；每次試驗均加入沒有插入片段的空噬菌體作為陰性對照4孔和空白對照2孔，室溫孵育2小時，棄去孔內(nèi)液體，拍干；每個噬菌體標本加入100 U 11%BSA以I :500比例稀釋的大腸癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔，所用大腸癌組、對照組的混合血漿的患者信息同步驟b)親和篩選所用的患者，室溫孵育I小時；洗板后每孔加入IOOiUl :10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG，于26°C室溫孵育I小時；洗板后每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴，混勻后，37°C孵育5分鐘，加入終止液25 yl，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的OD值，并記錄結(jié)果，每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值> 2. 0，判斷為陽性結(jié)果；樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值〈2. 0，判斷為陰性結(jié)果；找出與大腸癌混合血清反應為陽性，而與對照混合血清反應為陰性的有意義的噬菌體克??；c2)獨立血清復篩將經(jīng)步驟Cl)初篩后的所述有意義的噬菌體應用30例大腸癌患者血清及30例健康對照血清進行ELISA復篩，步驟同Cl中所述ELISA實驗的步驟，不同之處在于篩選所用的血清為獨立的，而不是混合血清，對比所述有意義的噬菌體與各大腸癌患者血清及對照血清的反應性，應用獨立樣本t檢驗的方法，挑選出與30例大腸癌血清及30例健康對照血清的反應數(shù)據(jù)具有顯著差異的噬菌體克??；c3)大腸癌特異性抗原肽重組載體的診斷模塊的獲得 應用dige R軟件采用隨機森林法對所有獨立血清樣本進行2000次隨機抽樣，根據(jù)各噬菌體肽區(qū)分大腸癌血清的能力，對步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體的篩選能力從高到低進行排序；采用貝葉斯雙變量模型，依次檢驗噬菌體聯(lián)合檢測的效果，按聯(lián)合數(shù)量最少、且聯(lián)合檢測的靈敏度與特異性與步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體聯(lián)合檢測的靈敏度與特異性最接近的標準，得到5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體，其上插入的 cDNA 片段的序列如 SEQ ID No. I、SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ IDNo. 9所示。本發(fā)明提供的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括I7TAILER單克隆抗體、酶標板、陰性對照、酶聯(lián)物、顯色劑A&B、終止液，其中，所述試劑盒還包括5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體，所述5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體均由T7噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構(gòu)成，所述cDNA片段的序列分別如SEQ ID No. I、SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 7、SEQ ID No. 9所示，且所述陰性對照為空噬菌體，所述酶聯(lián)物為HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG。本發(fā)明提供的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的操作方法，包括A)將T7TAILER抗體，按I :1000稀釋度，用pH為7. 4的I XPBS稀釋，每孔IOOul,包被于96孔酶標板，4°C搖床輕搖過夜；采用IX洗液，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干后用2%BSA/PBS 200ul于26°C封閉每孔2小時；1X洗液，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干，加入1%BSA1 5稀釋的5個表達大腸癌特異性抗原肽的重組載體lOOul，每個標本加2孔；每次試驗均加入沒有插入片段的空噬菌體作為陰性對照和空白對照各2孔，室溫孵育2小時，棄去孔內(nèi)液體，拍干；B)每孔加入100ull%BSAl :500稀釋的大腸癌病人血漿，室溫孵育I小時，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干；每孔加入IOOull :10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫孵育I小時，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干；每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴，混勻后，37°C孵育5分鐘，加入終止液25ul，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的OD值，并記錄結(jié)果；C)按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào)零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，將結(jié)果代入聯(lián)合篩選模型，設定cut-off值為0. 5，當結(jié)果> 0. 5，判斷為陽性；結(jié)果〈O. 5，則將其結(jié)果判斷為陰性，其中，所述聯(lián)合篩選模型是通過匯總5個表達大腸癌特異性抗原肽的重組載體與30例大腸癌癥患者的血清和30例健康對照血清的反應數(shù)據(jù)，應用Binary Regression Models Version2. 0軟件在Matlab7. 0環(huán)境下建立篩選大腸癌的貝葉斯雙變量回歸模型。本發(fā)明利用17噬菌體將大腸癌cDNA文庫展示到噬菌體表面，并經(jīng)親和篩選和血清學分析從中篩選出大腸癌特異性抗原肽的表達載體，包含表達載體的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有檢測大腸癌病人血清中由于腫瘤刺激所產(chǎn)生的自身抗體的能力。將篩選出的多個抗原肽經(jīng)過聯(lián)合，可達到早期檢測和篩選大腸癌病人的目的。


圖I為大腸癌噬菌體展示肽庫原始庫的光學圖片。

圖2為隨機挑選噬菌斑PCR擴增圖。圖3為根據(jù)16個噬菌體聯(lián)合篩選30對訓練組血清的結(jié)果構(gòu)建的數(shù)學模型示意圖。圖4 (a)和(b)分別為16個曬菌體克隆聯(lián)合篩選與5個曬菌體聯(lián)合篩選ROC曲線圖。圖5為根據(jù)5個噬菌體聯(lián)合篩選30對訓練組血清的結(jié)果構(gòu)建的數(shù)學模型示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA,等量混合成Img后抽提mRNA,應用ol igo dT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA末端進行平齊，加Ecol I和Hind III接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入T7噬菌體(N0VAGEN)雙臂，進行體外包裝，構(gòu)建成大腸癌噬菌體展示肽庫，其光學圖片如圖I所示。測定構(gòu)建的噬菌體展示肽庫庫容量為3. OX 106pfu，重組率為60%，符合篩選后期試驗要求。實施例2親和篩選大腸癌特異抗原肽取10 ill A/G的瓊脂糖珠置于一 I. 5ml離心管中，500 ill PBS (pH7. 4)洗2次，1%BSA4°C封閉lh。瓊脂糖珠分別與15iU大腸癌患者及對照患者血清4°C孵育過夜，其中對照患者是指排除任何惡性腫瘤及癌前病變，排除腺瘤性息肉病和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌患者。PBS500 洗滌3次后，用10 u I PBS溶解富集到的抗體。10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管。取噬菌體庫擴增液20 iil，先與20iU的非大腸癌抗體孵育lh，未結(jié)合的上清再與20iil大腸癌抗體結(jié)合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用IOOii I 1%SDS洗脫，將其轉(zhuǎn)染細菌至擴增，完成一輪親和篩選。為了富集可以和大腸癌自身抗體結(jié)合的特異展示肽，重復上述步驟，反復進行五輪親和篩選。實施例3血清學篩選大腸癌早期檢測分子標志3. I混合血樣初篩篩選后的肽庫用LB液體培養(yǎng)基I: IO8稀釋后，取100 ill噬菌體液、250iU新?lián)u好的BLT5403細菌，3ml保溫55°C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿中，冷卻后，37°C溫箱孵育4小時，可見有單個的噬菌斑形成。每I個I. 5ml離心管中，加入Iml新?lián)u好的細菌BLT5403，用消毒的牙簽隨機挑取單個的、邊界清晰的噬菌體于I個I. 5ml離心管中，共隨機挑選噬菌體克隆2000個，并按順序編號。挑好的噬菌體置37°C恒溫振蕩器搖4小時以上，直至每一管液體均變澄清為止。挑選好的噬菌體置4°C保存。用17引物(上海生工生物有限公司合成)進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體的插入片段，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示，挑取擴增片段200BP以上的噬菌體進行ELISA實驗進一步篩選，其中17引物的序列為Up :5， -GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’Down :5，-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’將T7TAILER 抗體(N0VAGEN)用 PBS (pH7. 4)按 I :1000 來稀釋，每孔 100 U I 包被于96孔酶標板，4°C搖床輕搖過夜。用洗液(上海科華生物技術(shù)公司)洗板，每孔300 yl，洗 四次，每次約I分鐘，拍干。200iU2%BSA/PBS室溫(26°C)封閉2小時。洗板同前，加入用1%BSA以I :5比例稀釋的噬菌體IOOii 1，每個標本加4孔。每次試驗均加入沒有插入片段的50號空噬菌體作為陰性對照4孔和空白對照2孔。室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)液體，拍干。每個噬菌體標本加入100iUl%BSA以I :500比例稀釋的大腸癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔。所用大腸癌組、對照組的混合血漿的患者信息同實施例2的親和篩選所用的患者。也就是說，某待測的噬菌體包被六孔，其中兩孔加大腸癌患者混合血清，兩孔加對照混合血清，兩孔不加任何血清作空白對照，同時包被空噬菌體四孔，每兩孔分別加肺癌患者混合血清和對照混合血清，作前面四孔相應的陰性對照。室溫孵育I小時。洗板后每孔加入IOOiill :10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG，26°C室溫孵育I小時。洗板后每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴(上?？迫A生物技術(shù)公司)，混勻后，37°C孵育5分鐘，加入終止液25iU。立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的光密度值(0D值)，并記錄結(jié)果。每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào)零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值彡2. 0，判斷為陽性結(jié)果；樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值〈2. 0，判斷為陰性結(jié)果。找出與大腸癌混合血清反應為陽性，而與對照混合血清反應為陰性的噬菌體，作為有篩選意義的克隆進行后續(xù)研究，共篩選出21個有意義克隆，經(jīng)過PCR鑒定均為有插入片段的噬菌體。這些噬菌體克隆表面所展示的抗原可能具有診斷大腸癌的潛能，將應用其對大腸癌病人和對照血清進行ELISA試驗篩選，以確定其在臨床中檢測早期大腸癌的可行性。3. 2獨立血清復篩將初篩后的有意義的21個噬菌體應用30例大腸癌患者血清及30例健康對照血清進行ELISA復篩，方法同實施例3. 1，不同之處在于篩選所用的血清為獨立的，而不是混合血清。對比21個噬菌體克隆在大腸癌患者血清及對照血清的反應性，應用獨立樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)其中16個噬菌體克隆與30例大腸癌血清及30例健康對照血清的反應數(shù)據(jù)具有顯著差異(P〈0. 05)。實施例4應用訓練組血清建立檢測模型4. I建立聯(lián)合檢測數(shù)學模型
為了提高檢測試劑盒的敏感度，采用不同噬菌體克隆聯(lián)合檢測的方法。匯總16個不同噬菌體克隆與30對訓練組(30例癌癥患者和30例對照)的反應數(shù)據(jù)，應用BinaryRegression Models Version2. 0軟件在Matlab7. 0環(huán)境下，建立篩選大腸癌的貝葉斯雙變量數(shù)學模型(Bayesian binary regression),檢測檢測者患大腸癌的概率。30例癌癥患者為類別1，30例對照為類別0，cut-off值為0. 5，大于等于0. 5為陽性，小于0. 5為陰性，如圖3所示，可以應用此模型成功區(qū)分出30對訓練組的癌癥患者及健康對照。4. 2優(yōu)化聯(lián)合檢測數(shù)學模型 在保證檢測效果的前提下，為了使試劑盒的制備及使用更加簡便，對以上16個噬菌體克隆進行精簡篩選。方法如下通過dige R軟件采用隨機森林法(Random Forest)對所有獨立血清樣本進行2000次隨機抽樣，進行編號，對這16個噬菌體克隆的篩選能力由高到低排序；根據(jù)排序結(jié)果依次選擇前16、15個，14個，直到前3個噬菌體克隆，將其反應性數(shù)值分別輸入貝葉斯雙變量模型(Bayesian binary regression),發(fā)現(xiàn)卩遼菌體克隆聯(lián)合數(shù)量最少，即僅使用前五個噬菌體克隆(1009號噬菌體克隆、174號噬菌體克隆、149號噬菌體克隆、396號噬菌體克隆、95號噬菌體克隆)聯(lián)合篩選，其靈敏度及特異度與16個噬菌體克隆聯(lián)合篩選時靈敏度及特異度接近，敏感度及特異度分別為90. 0%和96. 7%，如圖4所示，16個噬菌體克隆聯(lián)合監(jiān)測的ROC曲線下面積為0. 937，5個噬菌體克隆聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積為0. 940。經(jīng)測序，前五個噬菌體克隆的cDNA插入片段的序列如SEQ ID No. USEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9所示，相對應所編碼的大腸癌特異性抗原肽的氨基酸序列如SEQID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 10 所示。因此，最終的聯(lián)合檢測模型是通過匯總5個不同噬菌體克隆與30對訓練組(30例癌癥患者血清和30例健康對照血清)的反應數(shù)據(jù)所建立的貝葉斯雙變量數(shù)學模型(Bayesian binary regression),如圖 5 所不。實施例5應用驗證組血清檢驗5個噬菌體聯(lián)合篩選效果將這五個噬菌體克隆分別與經(jīng)金標準(病理結(jié)果)確診的60例大腸癌患者血清和60例對照血清反應，方法同獨立血清復篩選(實施例3. I)。將檢測值輸入根據(jù)訓練組的30對獨立血樣所建立的數(shù)學模型中，產(chǎn)生該檢測者患大腸癌的概率，cut-off值為0. 5，大于等于0. 5為陽性，小于0. 5為陰性，檢測結(jié)果，結(jié)果如表I所示。ELISA檢測方法檢測驗證組大腸癌的敏感度為90. 0%、特異度為91. 7%。表IELISA檢測結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種大腸癌特異性抗原肽，其特征在于，所述大腸癌特異性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 10 所示。
2.一種用于表達權(quán)利要求I所述的大腸癌特異性抗原肽的表達載體，其特征在于，由噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構(gòu)成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No. 9所示。
3.如權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述噬菌體為T7噬菌體。
4.一種大腸癌特異性抗原肽表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括 a)構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫 抽提30例新鮮大腸癌組織總RNA,等量混合成Img后抽提mRNA,應用oligodT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA末端進行平齊，加Ecol I和Hind III接頭，雙酶切后去除小片斷，然后接入T7噬菌體雙臂，進行體外包裝，構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫； b)親和篩選大腸癌特異抗原肽 取10 ill A/G的瓊脂糖珠置于一 1.5ml離心管中，用500 ill pH7. 4的PBS洗2次，.1%BSA4°C封閉lh，瓊脂糖珠分別與15iU大腸癌患者及對照患者的血漿4°C孵育過夜，.500 u I PBS洗滌3次后，用IOiU PBS溶解富集到的抗體，10管大腸癌的抗體及10管非大腸癌的抗體各自合并成一管，取所述噬菌體展示肽庫擴增液20iU，先與20iU的非大腸癌抗體孵育lh，未結(jié)合的上清再與20 Ul大腸癌抗體結(jié)合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并用100 u 11%SDS洗脫，將其轉(zhuǎn)染細菌至擴增，完成一輪親和篩選，重復上述步驟，反復進行五輪親和篩選； c)血清學篩選大腸癌早期檢測分子標志 cl)混合血樣初篩 篩選后得到的噬菌體展示肽庫用LB液體培養(yǎng)基I: IO8稀釋后，取100 ill噬菌體液、.250 u I新?lián)u好的BLT5403細菌，3ml保溫55°C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿中，冷卻后，37°C溫箱孵育4小時，可見有單個的噬菌斑形成，每I個I. 5ml離心管中，加入Iml新?lián)u好的細菌BLT5403，隨機挑取單個的、邊界清晰的噬菌體克隆于I個I. 5ml離心管中，共隨機挑選噬菌體克隆2000個，并按順序編號，挑好的噬菌體置37°C恒溫振蕩器搖4小時以上，直至每一管液體均變澄清為止，挑選好的噬菌體克隆置4°C保存，用T7引物進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體克隆的插入片段，挑取擴增片段200bp以上的噬菌體克隆進行ELISA實驗進一步篩選； 所述ELISA實驗的步驟為 將I7TAILER抗體用pH7. 4的PBS按I :1000來稀釋，每孔取100 U I包被于96孔酶標板，4°C搖床輕搖過夜； 用洗液洗板，每孔300 iil，洗四次，每次約I分鐘，拍干；采用200 u 12%BSA/PBS于26 °C封閉2小時； 用洗液洗板，每孔300 yl，洗四次，每次約I分鐘，拍干；加入用1%BSA以I :5比例稀釋的噬菌體IOOii 1，每個標本加4孔；每次試驗均加入沒有插入片段的空噬菌體作為陰性對照4孔和空白對照2孔，室溫孵育2小時，棄去孔內(nèi)液體，拍干； 每個噬菌體標本加入100iUl%BSA以I :500比例稀釋的大腸癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔，所用大腸癌組、對照組的混合血漿的患者信息同步驟b)親和篩選所用的患者，室溫孵育I小時； 洗板后每孔加入IOOiIll 1 0000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG，于26 °C室溫孵育I小時； 洗板后每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴，混勻后，37°C孵育5分鐘，加入終止液25 u I，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的OD值，并記錄結(jié)果，每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值> 2. 0，判斷為陽性結(jié)果；樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值〈2. 0，判斷為陰性結(jié)果；找出與大腸癌混合血清反應為陽性，而與對照混合血清反應為陰性的有意義的噬菌體克??； c2)獨立血清復篩 將經(jīng)步驟Cl)初篩后的所述有意義的噬菌體克隆應用30例大腸癌患者血清及30例健康對照血清進行ELISA復篩，步驟同Cl中所述ELISA實驗的步驟，不同之處在于篩選所用的血清為獨立的，而不是混合血清，對比所述有意義的噬菌體克隆與各大腸癌患者血清及對照血清的反應性，應用獨立樣本t檢驗的方法，挑選出與30例大腸癌血清及30例健康對照血清的反應數(shù)據(jù)具有顯著差異的噬菌體肽克隆； c3)大腸癌特異性抗原肽重組載體的診斷模塊的獲得 應用dige R軟件采用隨機森林法對所有獨立血清樣本進行2000次隨機抽樣，根據(jù)各噬菌體區(qū)分大腸癌血清的能力，對步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體的篩選能力從高到低進行排序；采用貝葉斯雙變量模型，依次檢驗噬菌體聯(lián)合檢測的效果，按聯(lián)合數(shù)量最少、且聯(lián)合檢測的靈敏度與特異性與步驟c2所得到的具有顯著差異的噬菌體聯(lián)合檢測的靈敏度與特異性最接近的標準，得到5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體，其上插入的cDNA 片段的序列如 SEQ ID No. I、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9所示。
5.一種大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括I7TAILER單克隆抗體、酶標板、陰性對照、酶聯(lián)物、顯色劑A&B、終止液，其特征在于，所述試劑盒還包括5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體，所述5個大腸癌特異性抗原肽的表達載體均由T7噬菌體和編碼大腸癌特異性抗原肽的cDNA片段構(gòu)成，所述cDNA片段的序列分別如SEQ ID No. USEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9所示，且所述陰性對照為空噬菌體，所述酶聯(lián)物為HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG。
6.一種大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的操作方法，其特征在于，包括 A)將I7TAILER抗體，按I:1000稀釋度，用pH為7. 4的I XPBS稀釋，每孔IOOul，包被于96孔酶標板，4°C搖床輕搖過夜；采用IX洗液，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干后用2%BSA/PBS 200ul于26°C封閉每孔2小時；1X洗液，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干，加入1%BSA1 :5稀釋的5個表達大腸癌特異性抗原肽的重組載體lOOul，每個標本加2孔；每次試驗均加入沒有插入片段的空噬菌體作為陰性對照和空白對照各2孔，室溫孵育2小時，棄去孔內(nèi)液體，拍干； B)每孔加入IOOul1%BSA I 500稀釋的大腸癌病人血漿，室溫孵育I小時，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干；每孔加入IOOul I :10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫孵育I小時，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次約I分鐘，拍干；每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、B各2滴，混勻后，37°C孵育5分鐘，加入終止液25ul，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的OD值，并記錄結(jié)果； C)按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào)零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，將結(jié)果代 入聯(lián)合篩選模型，設定cut-off值為0. 5，當結(jié)果> 0. 5，判斷為陽性；結(jié)果〈O. 5，則將其結(jié)果判斷為陰性，其中，所述聯(lián)合篩選模型是通過匯總5個表達大腸癌特異性抗原肽的重組載體與30例大腸癌癥患者的血清和30例健康對照血清的反應數(shù)據(jù)，應用Binary Regression Models Version2. 0軟件在Matlab7. 0環(huán)境下建立篩選大腸癌的貝葉斯雙變量回歸模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸癌特異性抗原肽、大腸癌特異性抗原肽的表達載體以及制備方法，包含表達載體的大腸癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其操作方法。利用噬菌體將大腸癌cDNA文庫展示到噬菌體表面，并經(jīng)親和篩選和血清學分析從中篩選出大腸癌特異性抗原肽的表達載體，作為主要組分，與陰性對照、酶標板、顯色劑及終止液等構(gòu)成檢測試劑盒。本發(fā)明的大腸癌特異性抗原肽的表達載體，有效表達大腸癌特異性抗原肽，包被在酶標板上，具有檢測大腸癌病人血清中由于腫瘤刺激所產(chǎn)生的自身抗體的能力，從而達到早期檢測和篩選大腸癌病人的目的。
文檔編號C07K14/47GK102775488SQ20121026708
公開日2012年11月14日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者傅傳剛, 劉巖, 吳玲玲, 常文軍, 曹付傲, 曹廣文, 李小攀, 高顯華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學