一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，包括以下步驟：以端粒酶活性為作用靶點篩選抗腫瘤藥物；應(yīng)用快速熒光素測定法篩選抗腫瘤藥物；應(yīng)用結(jié)晶紫染色測定法篩選抗腫瘤藥物；應(yīng)用噬菌體篩選抗腫瘤藥物；本發(fā)明所提供的這種篩選方法優(yōu)勢有兩點：其一是多種細胞株初篩有可能篩選出對特殊的人類腫瘤或?qū)μ厥饨M織亞型有活性的物質(zhì)；其二是這種體外篩選尤其適合于復雜天然產(chǎn)物提取物中有效成分的證實，過去動物篩選需較大量的天然產(chǎn)物，而現(xiàn)在天然產(chǎn)物的需要量就大大減少，可以指導有效成分的進一步分離純化，使得從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物更加便利。
【專利說明】
一種抑制腫瘤細胞増殖的藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物篩選是現(xiàn)代藥物開發(fā)流程中檢驗和獲取具有特定生理活性化合物的一個步驟，系指通過規(guī)范化的實驗手段從大量化合物或新化合物中選擇對某一特定作用靶點具有較高活性化合物的過程。是臨床新藥開發(fā)的必經(jīng)過程。
[0003]—個新藥從研發(fā)到臨床使用歷時十年以上，耗資10億美金。平均而言，每一百萬個化合物中最終能被FDA批準上市的只有一個，而上市的藥物中，也只有30 %的藥物能夠獲得的利潤，收回其研發(fā)成本。制藥公司年收入的20%用在新藥的研發(fā)上，全球每年在新藥上的投資超過300億美金。在先導化合物的后續(xù)篩選過程中，40%到60%的先導化合物在后續(xù)的ADME/T (藥物吸收、分布、代謝、分泌和毒性檢測)中被淘汰。72 %的藥物研發(fā)費用被浪費在:日益增長的臨床耗費、體內(nèi)無法預測的調(diào)控環(huán)境以及藥物的副作用方面。因此，選出優(yōu)良品質(zhì)的先導化合物是藥物篩選的一個至關(guān)重要的過程。各制藥公司在藥物開發(fā)的早期都會收集盡可能多的關(guān)于靶點、待測化合物性質(zhì)、以及現(xiàn)有篩選方法手段優(yōu)劣性的信息，以確保盡快剔出陰性化合物，拿到優(yōu)良品質(zhì)的先導化合物，降低藥物篩選的成本。
[0004]傳統(tǒng)的中藥篩選方法包括隨機篩選和經(jīng)驗式重復篩選。
[0005]一、隨機篩選
[0006]是最經(jīng)典的藥物篩選方式，在歷史上曾發(fā)揮過重要作用，特別在50?60年代較為變通。它用一種或多種生物試驗手段評篩化合物或自然資源?，F(xiàn)在應(yīng)用的許多有效治療藥物都是通過隨機篩選得到的。隨機篩選典型代表，如利用細菌培養(yǎng)法從自然資源中篩選抗菌素，利用瘤株細胞培養(yǎng)法從多種來源的化學物質(zhì)中篩選抗癌藥物;70年代后利用受體(競爭)結(jié)合法隨機篩選神經(jīng)一精神性藥物等。
[0007]隨機篩選發(fā)現(xiàn)新藥的機率較低，據(jù)統(tǒng)計，篩選800個化合物可發(fā)現(xiàn)一個有活性化合物，一個投放市場的藥物，常需篩選上萬個化合物，例如美國國家腫瘤研究所(NCL)每年篩選一萬個化合物，連續(xù)9年，只有一個成為上市藥物。尤其早期(50?60年代)隨機篩選常用整體動物試驗方法，不但速度慢、所獲信息少、耗資巨大，且不能有效地利用化合物資源。因此，隨機篩選遭到冷落，新藥研制部門，特別是藥物產(chǎn)業(yè)部門很少依靠隨機篩選做為發(fā)現(xiàn)新藥的主要手段。
[0008]隨著篩選技術(shù)方法的進步和自動化技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用，特別是90年代以來，組合化學在新藥發(fā)展研究中確立了重要的地位，隨機篩選又逐漸興起，甚至出現(xiàn)了專門從事隨機篩選的公司，例如有的公司(PanLabs)用全細胞、純化酶、受體或離子通道建立了45種篩方法，從微生物發(fā)酵液和其他自然產(chǎn)物中篩選導向化合物。又如英國的Xenova選用30個與疾病有關(guān)的靶標，建立篩選方法，從自然資源中篩選免疫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、癌和心血管系統(tǒng)疾病的治療藥物，每年可完成100萬次以上的篩選實驗。
[0009]二、經(jīng)驗式重復篩選
[0010]是使用最為廣泛的傳統(tǒng)的篩選方法。
[0011]這種篩選主要特點是合成篩選緊密配合，經(jīng)重復性(trial and error)試驗過程，根據(jù)構(gòu)效關(guān)系(SAR)，不斷對化合物進行結(jié)構(gòu)修飾(structural modificat1n)，找到選擇性導向或候選化合物。它屬于定向合成與篩選，成敗的關(guān)鍵在于確定適當?shù)暮Y選目標和范圍，選好靶標(target)和篩選指標。60年代以來，特別是70年代以后，這種篩選在新藥發(fā)現(xiàn)研究中占主導地位。80年代以來這種篩選方式更強調(diào)靶標的選擇，提出了基于機制的篩選(mechanism-based screening),即根據(jù)疾病性病的分子機制，選擇關(guān)鍵革E標，建立相應(yīng)篩選方法，進行革巴向篩選(targeted screening)。
[0012]基于以前的篩選方法存在較大缺陷，1985年以后研究單位普遍開始采用針對疾病的篩選方法來代替針對化合物的篩選方法，即體外代表各種常見實體瘤的人類腫瘤細胞株篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所提供的這種篩選方法優(yōu)勢有兩點:其一是多種細胞株初篩有可能篩選出對特殊的人類腫瘤或?qū)μ厥饨M織亞型有活性的物質(zhì);其二是這種體外篩選尤其適合于復雜天然產(chǎn)物提取物中有效成分的證實，過去動物篩選需較大量的天然產(chǎn)物，而現(xiàn)在天然產(chǎn)物的需要量就大大減少，可以指導有效成分的進一步分離純化，使得從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物更加便利。
[0014]為此，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，包括以下步驟:
[0015]步驟一:以端粒酶活性為作用靶點篩選抗腫瘤藥物；
[0016]步驟二:應(yīng)用快速熒光素測定法篩選抗腫瘤藥物；
[0017]步驟三:應(yīng)用結(jié)晶紫染色測定法篩選抗腫瘤藥物；
[0018]步驟四:應(yīng)用噬菌體篩選抗腫瘤藥物。
[0019]進一步地，所述步驟一還包括以下步驟:
[0020]端粒酶產(chǎn)物的擴增；
[0021 ]聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物；
[0022]用12%丙烯酰胺灌膠，膠聚合后，取擴增產(chǎn)物1025微升加入加樣孔，以180V的電壓進行電泳2小時；
[0023]銀染顯色；
[0024]10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝膠35分鐘，然后加入濃度為0.2%的硝酸銀溶液，在37攝氏度水浴上振蕩染色5分鐘，用超純水洗滌三次，加入顯色液直至DNA條帶出現(xiàn)；
[0025]結(jié)果判斷。
[0026]用PCR擴增產(chǎn)物間接反映端粒酶活性，即在DNA條帶中顯示出6bp的梯狀條帶，則判斷端粒酶活性為陽性。
[0027]進一步地，所述步驟二還包括以下步驟:
[0028]細胞培養(yǎng)；
[0029]藥物敏感性實驗；
[0030]熒光素測定。
[0031]進一步地，所述步驟三還包括以下步驟:
[0032]細胞培養(yǎng)；
[0033]藥物敏感性實驗；
[0034]結(jié)晶紫染色測定。
[0035]進一步地，所述步驟四使用的方法是雙層瓊脂平板-紙片法，即兩層瓊脂分別鋪于平皿底部和上層，用無菌圓形濾紙片一片，沾取待篩藥物浸膏貼于平板上，于37攝氏度培養(yǎng)，24小時候觀察結(jié)果，陽性結(jié)果:溶原性細菌釋放多量成熟的噬菌體，浸入指示菌體內(nèi)繁殖，而使得指示菌裂解，在濾紙片周圍出現(xiàn)密集的噬斑，陰性結(jié)果，濾紙片周圍與背景相同。
[0036]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所提供的這種篩選方法優(yōu)勢有兩點:其一是多種細胞株初篩有可能篩選出對特殊的人類腫瘤或?qū)μ厥饨M織亞型有活性的物質(zhì);其二是這種體外篩選尤其適合于復雜天然產(chǎn)物提取物中有效成分的證實，過去動物篩選需較大量的天然產(chǎn)物，而現(xiàn)在天然產(chǎn)物的需要量就大大減少，可以指導有效成分的進一步分離純化，使得從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物更加便利。
【具體實施方式】
[0037]是本發(fā)明提供的一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，包括以下步驟:
[0038]步驟一:以端粒酶活性為作用靶點篩選抗腫瘤藥物；
[0039]步驟二:應(yīng)用快速熒光素測定法篩選抗腫瘤藥物；
[0040]步驟三:應(yīng)用結(jié)晶紫染色測定法篩選抗腫瘤藥物；
[0041 ]步驟四:應(yīng)用噬菌體篩選抗腫瘤藥物；
[0042]據(jù)統(tǒng)計，除去抗感染、抗病毒和抗寄生蟲類藥物以外，制藥工業(yè)用來做為藥物靶向篩選的靶標有417種，包括受體、酶、離子通道等，涉及10個系統(tǒng)的功能。在人類基因組計劃完成后這種靶標可增至3000 — 4000個。據(jù)統(tǒng)計，人類疾病有30000種，但藥物能控制和改善的只有100 —150種。未得到控制和改善的疾病大多數(shù)與基因有關(guān)，每一種疾病大約涉及5 —10個基因。因此，靶向篩選是新藥篩選的一個有發(fā)展?jié)摿Φ闹匾较蚝皖I(lǐng)域。
[0043]進一步地，所述步驟一還包括以下步驟:
[0044]端粒酶產(chǎn)物的擴增；
[0045]聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物；
[0046]用12%丙烯酰胺灌膠，膠聚合后，取擴增產(chǎn)物1025微升加入加樣孔，以180V的電壓進行電泳2小時；
[0047]銀染顯色；
[0048]10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝膠35分鐘，然后加入濃度為0.2%的硝酸銀溶液，在37攝氏度水浴上振蕩染色5分鐘，用超純水洗滌三次，加入顯色液直至DNA條帶出現(xiàn)；
[0049]結(jié)果判斷。
[0050]用PCR擴增產(chǎn)物間接反映端粒酶活性，即在DNA條帶中顯示出6bp的梯狀條帶，則判斷端粒酶活性為陽性。
[0051]作為本發(fā)明技術(shù)方案的一大改進，所述步驟二還包括以下步驟:
[0052]細胞培養(yǎng)；
[0053]藥物敏感性實驗；
[0054]熒光素測定。
[0055]作為本發(fā)明技術(shù)方案的一大改進，所述步驟三還包括以下步驟:
[0056]細胞培養(yǎng)；
[0057]藥物敏感性實驗；
[0058]結(jié)晶紫染色測定。
[0059]作為本發(fā)明技術(shù)方案的一大改進，所述步驟四使用的方法是雙層瓊脂平板-紙片法，即兩層瓊脂分別鋪于平皿底部和上層，用無菌圓形濾紙片一片，沾取待篩藥物浸膏貼于平板上，于37攝氏度培養(yǎng)，24小時候觀察結(jié)果，陽性結(jié)果:溶原性細菌釋放多量成熟的噬菌體，浸入指示菌體內(nèi)繁殖，而使得指示菌裂解，在濾紙片周圍出現(xiàn)密集的噬斑，陰性結(jié)果，濾紙片周圍與背景相同。
[0060]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解實現(xiàn)上述實施例方法中的全部或部分流程，是可以通過計算機程序來指令相關(guān)的硬件來完成，所述的程序可存儲于一計算機可讀取存儲介質(zhì)中，該程序在執(zhí)行時，可包括如上述各方法的實施例的流程。其中，所述的存儲介質(zhì)可為磁碟、光盤、只讀存儲記憶體(Read-Only Memory，ROM)或隨機存儲記憶體(RandomAccessMemory，RAM)等。
[0061]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:以端粒酶活性為作用靶點篩選抗腫瘤藥物； 步驟二:應(yīng)用快速熒光素測定法篩選抗腫瘤藥物； 步驟三:應(yīng)用結(jié)晶紫染色測定法篩選抗腫瘤藥物； 步驟四:應(yīng)用噬菌體篩選抗腫瘤藥物。2.如權(quán)利要求1所述的一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，其特征在于，所述步驟一還包括以下步驟: 端粒酶產(chǎn)物的擴增； 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物； 用12%丙烯酰胺灌膠，膠聚合后，取擴增產(chǎn)物1025微升加入加樣孔，以180V的電壓進行電泳2小時； 銀染顯色； 10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝膠35分鐘，然后加入濃度為0.2%的硝酸銀溶液，在37攝氏度水浴上振蕩染色5分鐘，用超純水洗滌三次，加入顯色液直至DNA條帶出現(xiàn)；結(jié)果判斷； 用PCR擴增產(chǎn)物間接反映端粒酶活性，即在DNA條帶中顯示出6bp的梯狀條帶，則判斷端粒酶活性為陽性。3.如權(quán)利要求1所述的一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，其特征在于，所述步驟二還包括以下步驟: 細胞培養(yǎng)； 藥物敏感性實驗； 熒光素測定。4.如權(quán)利要求1所述的一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，其特征在于，所述步驟三還包括以下步驟: 細胞培養(yǎng)； 藥物敏感性實驗； 結(jié)晶紫染色測定。5.如權(quán)利要求1所述的一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物篩選方法，其特征在于，所述步驟四使用的方法是雙層瓊脂平板-紙片法，即兩層瓊脂分別鋪于平皿底部和上層，用無菌圓形濾紙片一片，沾取待篩藥物浸膏貼于平板上，于37攝氏度培養(yǎng)，24小時候觀察結(jié)果，陽性結(jié)果:溶原性細菌釋放多量成熟的噬菌體，浸入指示菌體內(nèi)繁殖，而使得指示菌裂解，在濾紙片周圍出現(xiàn)密集的噬斑，陰性結(jié)果，濾紙片周圍與背景相同。
【文檔編號】C12Q1/02GK106086171SQ201610421639
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610421639.6, CN 106086171 A, CN 106086171A, CN 201610421639, CN-A-106086171, CN106086171 A, CN106086171A, CN201610421639, CN201610421639.6
【發(fā)明人】張湘東, 潘文杰, 葛發(fā)歡
【申請人】廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司