專利名稱：血清類粘蛋白抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程、基因工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及血清類粘蛋白抗體及其在診斷腫瘤中的用途。
背景技術(shù)：
血清類粘蛋白(Orosomucoid，又被稱為α1-Acid glycoprotein(AGP))是一種血清糖蛋白，其由183個(gè)氨基酸組成，主要合成，分泌于肝細(xì)胞。
盡管它作為應(yīng)急蛋白的多種免疫調(diào)節(jié)功能已經(jīng)被提出，并作了廣泛深入的研究，但其確切的作用至今未知。各種炎癥因子和類固醇激素影響AGP mRNA的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在各種炎癥狀態(tài)、肝病、自身免疫性疾病及癌癥病人血清中AGP的濃度上升。
本領(lǐng)域中還需要找出用于血清學(xué)診斷的腫瘤標(biāo)志物及其相關(guān)的診斷試劑和方法。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一對(duì)能特異性識(shí)別血清類粘蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于血清學(xué)診斷腫瘤的試劑盒，所述試劑盒包含一對(duì)抗體，由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第一抗體，以及由保藏號(hào)為CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第二抗體。
本發(fā)明另一方面還涉及血清類粘蛋白抗體、尤其是上述單克隆抗體在制備用于血清學(xué)檢測(cè)腫瘤的診斷劑中的用途。
本發(fā)明的血清類粘蛋白抗體，尤其是本發(fā)明獲得的單克隆抗體能夠用于血清學(xué)檢測(cè)各種腫瘤。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)可從以下的詳細(xì)描述中得知。


圖1顯示了載體pGEX-2T的圖譜，圖中的Thrombin表示凝血酶；Stop Codons表示終止密碼子；glutathione S-transferase表示谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的編碼序列；Ampr表示氨芐青霉素抗性基因。
圖2顯示了重組血清類粘蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。
圖3顯示了對(duì)富集后的血清類粘蛋白用OroD07和OroD09進(jìn)行Western檢測(cè)的結(jié)果。
圖4顯示了Northern印跡證明血清類粘蛋白在癌癥組織樣品中上調(diào)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明者利用含5612個(gè)基因的人的cDNA陣列，檢測(cè)了多對(duì)癌癥病人及其癌旁正常組織樣品的基因表達(dá)譜，找到多個(gè)在癌癥病人中上調(diào)的基因，再對(duì)這些基因所編碼的蛋白進(jìn)行一，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，試圖找到含有分泌肽的蛋白。也就是說(shuō)所找到的蛋白不僅在癌癥病人中上調(diào)，而且是可以分泌到血清中的。最終發(fā)現(xiàn)血清類粘蛋白在多種癌癥病人組織樣品中上調(diào)，且含有分泌肽。這就提示血清類粘蛋白可以作為腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于腫瘤的血清學(xué)診斷和病情跟蹤。為了驗(yàn)證上面的假設(shè)，本發(fā)明者利用單克隆抗體技術(shù)和免疫酶聯(lián)技術(shù)(ELISA)制備并尋找了可配對(duì)的針對(duì)血清類粘蛋白的單克隆抗體，并利用該配對(duì)抗體檢測(cè)了多種癌癥病人和正常人血清中血清類粘蛋白的含量，所得的結(jié)果顯示血清類粘蛋白可以作為癌癥病人的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明第一方面提供了兩個(gè)能特異性識(shí)別血清類粘蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體分別由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指由至少一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)組成的一個(gè)或一組多肽，其具體包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(即與血清類粘蛋白特異性結(jié)合)。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為Fab片段，每個(gè)片段有單個(gè)抗原結(jié)合部位)，以及一個(gè)殘余的“Fc”片段(如此稱呼是因?yàn)樗苋菀捉Y(jié)晶)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab′)2片段(它具有兩個(gè)能與抗原交聯(lián)的抗原結(jié)合片段)以及一個(gè)殘余的其它片段(稱為pFc′)。其它片段可包括二抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用的，關(guān)于抗體的術(shù)語(yǔ)“功能性片段”是指Fv，F(xiàn)(ab)和F(ab′)2片段。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一群基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包含的各個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體是高特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑(通常是包括針對(duì)不同的決定簇(表位)的不同抗體)相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。本文的單克隆抗體還包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)(其中重鏈和/或輕鏈的一部分與特定動(dòng)物種類衍生的、或是屬于特定的抗體類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分則與另一動(dòng)物衍生的、或是屬于另一抗體類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源)以及這些抗體的片段，只要這些片段具有所需的生物活性即可。
針對(duì)血清類粘蛋白的單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常，首先用血清類粘蛋白蛋白來(lái)免疫合適的動(dòng)物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。所述血清類粘蛋白蛋白可從商業(yè)途徑獲得，或是根據(jù)常規(guī)分子克隆和基因重組表達(dá)技術(shù)來(lái)獲得。由于可獲得的血清體積多，能獲得標(biāo)記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對(duì)于制備多克隆抗血清來(lái)說(shuō)，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進(jìn)行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如弗氏完全佐劑)混合或乳化，然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。隨后用鹽水(較佳的是用弗氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強(qiáng)化免疫。另外可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行體外免疫來(lái)產(chǎn)生抗體。
用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)方法[Nature(1975)256495-96]或其改進(jìn)方法可制得單克隆抗體。通常，如上所述對(duì)嚙齒類動(dòng)物如小鼠和大鼠進(jìn)行免疫。當(dāng)然，也可用家兔、羊或蛙細(xì)胞。采用大鼠可能會(huì)有某些優(yōu)點(diǎn)，但是小鼠是較佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的動(dòng)物，通常能提供較高比例的穩(wěn)定融合。為了產(chǎn)生單克隆抗體，在免疫接種后，選擇具有生產(chǎn)抗體潛力的體細(xì)胞，具體是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，以用于單克隆抗體生產(chǎn)程序。這些細(xì)胞可從活檢的脾臟、扁桃體或淋巴結(jié)、或周圍血液樣品獲得。脾細(xì)胞和周圍血細(xì)胞是較佳的，因?yàn)榍罢呤翘幱诜至训臐{母細(xì)胞階段的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的豐富來(lái)源，而后者周圍血液很容易獲得。通常是對(duì)一組動(dòng)物免疫接種，取出抗體滴度最高的動(dòng)物的脾臟。用注射器將脾臟勻漿，獲得脾淋巴細(xì)胞。免疫接種過(guò)的小鼠的脾臟通常含有約5×107至2×108的淋巴細(xì)胞。
然后，使免疫接種的動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與無(wú)限增殖骨髓瘤細(xì)胞系(通常與免疫接種動(dòng)物的種類相同)融合。適用于產(chǎn)生雜交瘤融合程序的骨髓瘤細(xì)胞系最好不產(chǎn)生抗體，融合效率較高，且有酶缺陷，使得它們不能在某些只支持所需融合細(xì)胞(稱為雜交瘤)生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)?？刹捎迷S多骨髓瘤細(xì)胞中的任何一種，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員中已知的。例如，當(dāng)免疫接種的動(dòng)物是小鼠時(shí)，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp2/0、FO、NSO/U、MPC-11、MPC 11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；對(duì)于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可與人細(xì)胞融合結(jié)合。一種較佳的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是NS-1骨髓瘤細(xì)胞系(也稱為P3-NS-1-Ag4-1)，它可從NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository通過(guò)要求細(xì)胞系保藏號(hào)GM3573獲得?？刹捎玫牧硪环N小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是8-氮鳥嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)型細(xì)胞系。
產(chǎn)生抗體產(chǎn)生性脾或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交物的方法通常包括在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或數(shù)種試劑(化學(xué)或電)存在下，以2∶1的比例混合體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，但是比例也可分別從約20∶1至約1∶1。Kohler & Milstein(1975；1976)已經(jīng)描述了采用Sendai病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了采用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)。采用電誘導(dǎo)的方法也是適用的。
融合步驟產(chǎn)生存活雜交細(xì)胞的頻率通常較低。然而，這并不成問題，因?yàn)橥ㄟ^(guò)在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)可將存活的融合雜交細(xì)胞與親代未融合細(xì)胞(特別是會(huì)繼續(xù)正常無(wú)限分裂的未融合骨髓瘤細(xì)胞)中區(qū)分開來(lái)。選擇性培養(yǎng)基通常含有阻斷組織培養(yǎng)基中核苷酸從頭合成的試劑。典型的較佳的試劑是氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮絲氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻斷了嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅僅阻斷嘌呤的合成。當(dāng)采用氨甲喋呤或氨甲喋呤時(shí)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充入次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸源(HAT培養(yǎng)基)。當(dāng)采用重氮絲氨酸時(shí)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充加入次黃嘌呤。
較佳的選擇培養(yǎng)基是HAT。只有能進(jìn)行核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤在補(bǔ)救途徑中缺少關(guān)鍵性酶，如次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，它們不能存活。B細(xì)胞能進(jìn)行該途徑，但是它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的生命期有限，通常會(huì)在大約兩周內(nèi)死亡。因此在選擇性培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞只有骨髓瘤和B細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞。
這一培育提供了一群雜交瘤，從中選出具體的雜交瘤。通常，雜交瘤的選擇是在微量滴定板中單克隆稀釋，然后測(cè)試各個(gè)克隆的上清液是否具有所需反應(yīng)性。該試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)靈敏、簡(jiǎn)單而迅速，例如放射性免疫試驗(yàn)、酶免疫試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、空斑試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。然后系列稀釋所選雜交瘤，并克隆成單個(gè)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，然后就可使克隆無(wú)限增殖以提供單克隆抗體。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，發(fā)明人通過(guò)數(shù)輪篩選獲得了兩株對(duì)血清類粘蛋白有高特異性的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株OroD07和OroD09，并于2005年10月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)分別為CGMCC No.1512和CGMCC No.1513。
細(xì)胞系可利用兩種基本的方式來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。一種方式是將雜交瘤樣品注射入用未提供體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行最初融合的組織相容性動(dòng)物中，通常注射入腹膜腔內(nèi)。注射過(guò)的動(dòng)物產(chǎn)生的腫瘤分泌出由雜交融合細(xì)胞產(chǎn)生的特異性單克隆抗體。然后可抽出動(dòng)物的體液(如血清或腹水)以提供高濃度的單克隆抗體。任選地，在注射細(xì)胞前給予動(dòng)物一種烴類(具體說(shuō)是油，如降植烷Pristane(四甲基十五烷)、石蠟等)。
本發(fā)明的單克隆抗體也可用本領(lǐng)域熟知的體外方法進(jìn)行繁殖。體外繁殖可在合適的培養(yǎng)基(如Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基)中進(jìn)行，還可任意的補(bǔ)加入哺乳動(dòng)物血清(如胎牛血清)或微量元素以及維持生長(zhǎng)的補(bǔ)充物，如飼養(yǎng)細(xì)胞(如正常小鼠腹膜滲出液細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞等)。體外生產(chǎn)提供了較純的抗體制品，并允許放大規(guī)模來(lái)大量提供所需抗體。在組織培育條件下大規(guī)模培育雜交瘤的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，其包括均相懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器中，或固定或截留細(xì)胞培養(yǎng)。如果需要，用任一方法產(chǎn)生的單克隆抗體可用過(guò)濾、離心和各種層析方法(如HPLC或親和層析)進(jìn)一步純化。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”還涵蓋了該單克隆抗體的功能性片段和偶聯(lián)物。本發(fā)明的單克隆抗體的片段可從上述制得的單克隆抗體獲得，方法例如包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化學(xué)還原來(lái)斷裂二硫鍵。本發(fā)明的單克隆偶聯(lián)物也可用本領(lǐng)域熟知的方法制得，例如，在偶聯(lián)劑(如戊二醛或高碘酸鹽)存在下使上述制得的單克隆抗體與酶反應(yīng)。在這些偶聯(lián)劑存在下或通過(guò)與異硫氰酸鹽反應(yīng)，制得帶熒光素標(biāo)記的偶聯(lián)物。類似地制得帶金屬螯合劑的偶聯(lián)物?？膳c抗體偶聯(lián)的其它物質(zhì)包括放射性核素，如3H、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe、75Se、152Eu和99mTc以及可與抗體偶聯(lián)的其它有用的標(biāo)記物。本發(fā)明的放射性標(biāo)記過(guò)單克隆抗體可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法制得。例如，通過(guò)與碘化鈉和碘化鉀以及化學(xué)氧化劑(如次氯酸鈉)或酶氧化劑(如乳過(guò)氧化物酶)接觸，可使單克隆抗體碘化。本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)配體交換方法或直接標(biāo)記方法來(lái)標(biāo)記锝99m。交換方法例如是用亞錫溶液還原高锝酸鹽，將還原的锝螯合到Sephadex柱上，然后將抗體施加到該柱上；直接標(biāo)記方法例如是培育高锝酸鹽、還原劑(如SNCl2)、緩沖液(鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液)和抗體。
如果需要，抗體可用常規(guī)技術(shù)來(lái)標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結(jié)合配偶的配體。酶通?？科浠钚詠?lái)檢測(cè)。例如，辣根過(guò)氧化物酶通常是檢測(cè)其將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的能力，可用分光光度計(jì)定量測(cè)定。其它特異性結(jié)合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素，IgG和蛋白A，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對(duì)。應(yīng)理解，上述內(nèi)容并非要將各種標(biāo)記分成不同的類，因?yàn)橥粯?biāo)記可在幾種不同的模型中起作用。例如，125I可作為放射活性標(biāo)記，或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外，一種物質(zhì)可以和各種標(biāo)記組合以獲得所需的效果。其它替換和可能性對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，所以應(yīng)認(rèn)作屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)方案。
本發(fā)明另一方面涉及用本發(fā)明的血清類粘蛋白抗體來(lái)檢測(cè)樣品(如血清)中的血清類粘蛋白水平，并將其與正常參考值比較，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)腫瘤的目的。
在較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用來(lái)檢測(cè)肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤。在較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用來(lái)檢測(cè)胃癌和結(jié)腸癌。
所述檢測(cè)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法，例如ELISA、Western印跡方法、RIA以及其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合試驗(yàn)等來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在典型的ELISA中，將本發(fā)明的一對(duì)單克隆抗體中的一個(gè)固定在具有蛋白親和性的選定表面上，例如聚苯乙烯微滴板的測(cè)試孔。然后，在測(cè)試孔中加入懷疑含有抗原的待測(cè)組合物，例如臨床樣品如血清。在結(jié)合、并洗滌去除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，就可以檢測(cè)被結(jié)合的抗原。檢測(cè)通常是通過(guò)加入另一種抗體(如本發(fā)明的另一單克隆抗體)來(lái)完成的，所述抗體對(duì)要求檢測(cè)的抗原具有特異性并連接有可測(cè)標(biāo)記。這類ELISA是一種簡(jiǎn)單的“夾心ELISA”方法。也可以先加入對(duì)所需檢測(cè)抗原具有特異性的第二抗體，然后加入對(duì)第二抗體有結(jié)合親和性的第三抗體來(lái)進(jìn)行測(cè)定，所述第三抗體連接有可測(cè)標(biāo)記。另外，也可以使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA，使待測(cè)樣品與已知量的標(biāo)記抗原或抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，在與包被測(cè)試孔孵育前或孵育過(guò)程中，將樣品與已知的標(biāo)記反應(yīng)物混合來(lái)測(cè)定未知樣品中反應(yīng)物的量。
不論采用何種方式，各種ELISA有一些共同的特征步驟，例如包被、孵育或結(jié)合、洗滌去除非特異性結(jié)合物、和檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合物。下面將對(duì)此進(jìn)行說(shuō)明。
在用抗原或抗體包被測(cè)試板時(shí)，通常是將測(cè)試板孔與抗原或抗體溶液一起孵育過(guò)夜或一定的時(shí)間。然后，洗滌測(cè)試板孔以去除不完全吸附的物質(zhì)。然后，在測(cè)試孔的剩余表面“包被”以非特異性蛋白，此蛋白對(duì)待測(cè)抗血清在抗原性上是中性的。這類蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、伴刀豆蛋白和奶粉溶液。此步包被封閉了固相表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，由此減弱因抗血清與表面的非特異性結(jié)合引起的背景。
在抗原性物質(zhì)與測(cè)試孔結(jié)合，用非反應(yīng)性物質(zhì)包被以減弱背景和洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，使固相化表面在一定條件下與待測(cè)的抗血清或臨床或生物學(xué)提取物接觸形成(抗原/抗體)免疫復(fù)合物。這類條件宜包括用胎牛血清(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖液(PBS)/吐溫等稀釋劑來(lái)稀釋抗血清。加入的這些試劑還有助于減弱非特異性背景。孵育之后，洗滌接觸過(guò)抗血清的表面去除非免疫復(fù)合的物質(zhì)。洗滌過(guò)程宜包括用例如PBS/吐溫或硼酸鹽緩沖液之類溶液進(jìn)行洗滌。
在待測(cè)樣品與結(jié)合的抗體之間形成了特異性免疫復(fù)合物并經(jīng)洗滌后，可以用對(duì)抗原有特異性的第二抗體來(lái)測(cè)定有無(wú)所形成的免疫復(fù)合物甚至測(cè)定其含量。為了提供檢測(cè)手段，第二抗體宜含有與之偶聯(lián)的酶，該酶在與合適的生色底物孵育后會(huì)顯現(xiàn)出顏色。
在與酶標(biāo)記第二抗體一起孵育并洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，通過(guò)與顯色色底物一起孵育來(lái)測(cè)定標(biāo)記的量，所述底物例如脲和溴甲酚紫，如果酶標(biāo)記是過(guò)氧化物酶，則底物為2，2’-偶氮-二-(3-乙基-苯并噻唑林-6-磺酸)(ABTS)和H2O2。然后通過(guò)測(cè)定顯色程度來(lái)定量，例如使用可見光光譜分光光度計(jì)?；蛘?，可以是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
在較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明獲得了能夠配對(duì)用于夾心ELISA法的兩株單克隆抗體，這樣就能實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血清中血清類粘蛋白的水平來(lái)快速診斷對(duì)象是否患有腫瘤。
因此，本發(fā)明的另一方面還提供了一種用于血清學(xué)診斷腫瘤的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含一對(duì)抗體，其中由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第一抗體，由保藏號(hào)為CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第二抗體。在較佳的實(shí)施方案中，所述抗體還可與標(biāo)記物偶聯(lián)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)?；蛘撸砂凑赵噭┥a(chǎn)商所提供的說(shuō)明書進(jìn)行。
實(shí)施例1血清類粘蛋白的克隆純化1).基因的克隆采用引物序列F5-CGCGGATCCAACCTAGTACCGGTGCCCATCACT(SEQ IDNO1)；R5-CGGCGGAATGGATTCCCCCTCCTCCTGTTT(SEQ ID NO2)，擴(kuò)增得到目的基因(SEQ ID NO3)的PCR產(chǎn)物。
將目的基因PCR產(chǎn)物用鼎國(guó)DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoR I進(jìn)行酶切，與相同酶切的載體PGEX-2T(圖1)進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。先雙酶切鑒定，再經(jīng)測(cè)序鑒定。測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果如下核苷酸序列GGATCCAACCTAGTACCGGTGCCCATCACTAACGCCACCCTGGACCGGATCACTGGCAAGTGGTTTTATATCGCATCGGCCTTTCGAAACGAGGAGTACAATAAGTCGGTTCAGGAGATCCAAGCAACCTTCTTTTACTTCACCCCCAACAAGACAGAGGACACGATCTTTCTCAGAGAGTACCAGACCCGACAGGACCAGTGCATCTATAACACCACCTACCTGAATGTCCAGCGGGAAAATGGGACCATCTCCAGATACGTGGGAGGCCAAGAGCATTTCGCTCACTTGCTGATCCTCAGGGACACCAAGACCTACATGCTTGCTTTTGACGTGAACGATGAGAAGAACTGGGGGCTGTCTGTCTATGCTGACAAGCCAGAGACGACCAAGGAGCAACTGGGAGAGTTCTACGAAGCTCTCGACTGCTTGCGCATTCCCAAGTCAGATGTCGTGTACACCGATTGGAAAAAGGATAAGTGTGAGCCACTGGAGAAGCAGCACGAGAAGGAGAGGAAACAGGAGGAGGGGGAATCCTAGCAGGACACACGAATTC推導(dǎo)的氨基酸序列NLVPVPITNATLDRITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLREYQTRQDQCIYNTTYLNVQRENGTISRYVGGQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLSVYADKPETTKEQLGEFYEALDCLRIPKSDVVYTDWKKDKCEPLEKQHEKERKQEEGES(SEQ ID NO4)2).融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)經(jīng)測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)，將陽(yáng)性克隆接種到3mL LB培養(yǎng)基(含Amp，100mg/mL)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶100的比例接種到另一根LB(含Amp)培養(yǎng)基管，37℃快速振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD 600到0.5時(shí)，加入IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L，37℃快速振蕩培養(yǎng)3h，分別在加入IPTG前后取出0.5mL細(xì)菌培養(yǎng)物，離心進(jìn)行SDS-PAGE電泳(聚丙稀酰胺分離膠濃度12％，濃縮膠5％)觀察表達(dá)。PGEX-2T/血清類粘蛋白在BL21(DE3)大腸桿菌為包涵體表達(dá)。
3).重組血清類粘蛋白抗原的表達(dá)在超凈工作臺(tái)上取少量上述陽(yáng)性克隆菌液涂LB固體平板；37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑單克隆接種于3ml的LB培養(yǎng)基，37℃搖菌培養(yǎng)至OD6000.4～0.6，用15％的甘油保菌，0.2ml/管分裝，置-80℃凍存，以后每次表達(dá)時(shí)取出一管活化，一次性使用。
抗原基因表達(dá)純化所用的試劑和儀器如下試劑LB培養(yǎng)基(1LYeast Extract 5g，Tryptone Peptide 10g，NaCl 10g)1M IPTG200mg/mL氨芐青霉素PBS(3.58g Na2HPO4，0.245g KaH2PO4，8.18g NaCl，1L H2O，pH7.5)2M咪唑PBS配制500mM EDTA水配制(pH8.0)6M鹽酸胍(水配制，pH8.0)透析液梯度(緩沖液20Mm Tris，pH8.5，含150mM NaCl，0.5mM EDTA)7M尿素，6M尿素，5M尿素，4M尿素，3M尿素，2M尿素，1M尿素，0M尿素。
(3)基因在大腸桿菌中的表達(dá)活化取上述凍存于-80℃的甘油菌接種于20mL LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜；接種菌液以1∶100稀釋于300mL新鮮LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)左右，使菌體濃度達(dá)到OD600＝0.5；誘導(dǎo)加入1MIPTG誘導(dǎo)至終濃度0.5mmol/L誘導(dǎo)，37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)；收菌離心(6000rpm，4℃，10min)，收集菌體。
6).目的產(chǎn)物的純化GSTtag融合蛋白的分離純化用40mL PBS(pH7.5，預(yù)冷)，重懸離心收集的細(xì)菌(儀器1)，冰浴超聲破碎(200W，工作時(shí)間3秒，間歇時(shí)間5秒，工作次數(shù)40次)，離心(儀器4)14000rpm 10min(4℃)，分別收集上清和沉淀，分別取樣跑12％SDS-PAGE電泳，結(jié)果確定目的蛋白以包涵體狀態(tài)表達(dá)，即是存在于沉淀中。
(1)包涵體洗滌a 1％Triton X-100 20Ml(PBS配)充分懸浮，4℃攪拌30min，離心(14000rpm，20min，4℃)收集沉淀；b 2M Urea 20mL(PBS配)洗滌，重復(fù)a操作；c 4M Urea 20mL(PBS配)洗滌，重復(fù)a操作；(2)包涵體變性6M鹽酸胍20mL攪拌溶解過(guò)夜。
(3)電泳12％SDS-PAGE，以確定純化變性蛋白的純度和濃度(4)梯度復(fù)性取初步純化樣品進(jìn)行梯度透析，7M Urea-6M Urea-5M Urea-4MUrea-3M Urea-2M Urea-1M Urea-0M Urea(buffer 20mMTris.Hcl，50mM NaCl，pH8.5)透析復(fù)性，每個(gè)梯度透析時(shí)間大于4h，4M Urea以下置4℃環(huán)境中透析。
(5)初步純化樣品在CBS(50mM，PH9.6)透析過(guò)夜，OD280＝1.08，分裝100ul/管，-70℃儲(chǔ)存。
重組血清類粘蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。
本實(shí)施例獲得的血清類粘蛋白基因克隆菌株(大腸埃希氏菌)于2005年10月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No.1508。
實(shí)施例2血清類粘蛋白單克隆抗體的制備1.免疫小鼠動(dòng)物選擇雌性BALB/c 6-8周齡免疫方案長(zhǎng)期第一次第一天 50ug抗原/只+CFA sc第二次第十五天 50ug抗原/只+IFA sc第三次第二十九天 50ug抗原/只+生理鹽水 ip第三十二天融合備注CFA福氏完全佐劑；IFA福氏不完全佐劑；Ip腹腔注射；Iv靜脈注射；Sc皮下注射2.融合前測(cè)血清效價(jià)(表1)。
表1

1血清稀釋50倍 2血清稀釋250倍 3血清稀釋1250倍 4血清稀釋6250倍 5血清稀釋12500倍 6血清稀釋25000倍 7血清稀釋50000倍 8血清稀釋100000倍 9血清稀釋200000倍 10血清稀釋400000倍 11血清稀釋800000倍 12血清稀釋1600000倍AB為復(fù)孔一號(hào)小鼠 CD為復(fù)孔二號(hào)小鼠 EF為復(fù)孔空白小鼠一號(hào)小鼠免疫的效果較好，選擇它做融合3.融合當(dāng)天收集骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，直接從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集4.取免疫小鼠脾臟，收集脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)，與SP2/0細(xì)胞按10∶1的比例混合。
5.細(xì)胞融合A準(zhǔn)備1)一支15ml的離心管裝10ml1640不完全培養(yǎng)基(終止液)放置37℃水浴2)PEG一份(0.7ml)放置37℃水浴3)配制HAT培養(yǎng)基1640不完全培養(yǎng)基50*HATFBS 20％100*雙抗100*HEPESB融合1)脾細(xì)胞與SP2/0混合液離心960rpm*8min2)去上清(盡量吸干)，將細(xì)胞彈松。
3)1分鐘內(nèi)加入PEG，逐滴加，邊加邊輕輕混合均勻。
4)37℃水浴1.5分鐘。
5)5分鐘內(nèi)加入終止液(沿管壁滑入，勿吹打細(xì)胞)輕輕攪勻。
6)取一滴于載玻片觀察融合效果，余者960rpm離心8min。
7)棄上清后加入上述HAT培養(yǎng)基。
8)接種與96孔培養(yǎng)板(200ul/孔)置37℃5％CO2培養(yǎng)6.融合后10天左右，待融合細(xì)胞克隆長(zhǎng)成，用ELISA檢測(cè)融合細(xì)胞是否分泌抗體。
表2

C5OroD07 E8OroD097.有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆根據(jù)ELISA結(jié)果(表2)，選取陽(yáng)性孔(傾斜粗體)，用移液槍將孔中細(xì)胞吹下，計(jì)數(shù)后取100個(gè)細(xì)胞溶于20ml1640完全培養(yǎng)基(含20％FBS)，接種于96孔培養(yǎng)板，余細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8.10天左右再?gòu)?fù)篩。
表3

OroD07和OroD09隨機(jī)挑16個(gè)克隆測(cè)ELISA，根據(jù)結(jié)果(表3)，選取陽(yáng)性孔(傾斜粗體)，用移液槍將孔中細(xì)胞吹下，計(jì)數(shù)后取100個(gè)細(xì)胞溶于20ml1640完全培養(yǎng)基(含20％FBS)，接種于96孔培養(yǎng)板，余細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
9.10天左右再?gòu)?fù)篩。
表4

OroD07(A行)和OroD09(B行)隨機(jī)挑12個(gè)單克隆測(cè)ELISA，根據(jù)結(jié)果(表4)，選取陽(yáng)性孔(傾斜粗體)，用移液槍將孔中細(xì)胞吹下，計(jì)數(shù)后取100個(gè)細(xì)胞溶于20ml1640完全培養(yǎng)基(含20％FBS)，接種于96孔培養(yǎng)板，余細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
10.10天左右再?gòu)?fù)篩。
表5

OroD07(A行)和OroD09(B行)隨機(jī)挑12個(gè)單克隆測(cè)ELISA，根據(jù)結(jié)果(表5)，選取陽(yáng)性孔(傾斜粗體)，用移液槍將孔中細(xì)胞吹下，計(jì)數(shù)后取100個(gè)細(xì)胞溶于20ml1640完全培養(yǎng)基(含20％FBS)，接種于96孔培養(yǎng)板，余細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
11.10天左右再?gòu)?fù)篩。
表6

OroD07(A行)和OroD09(B行)隨機(jī)挑12個(gè)單克隆測(cè)ELISA，根據(jù)結(jié)果(表6)，選取陽(yáng)性孔(傾斜粗體)，由于呈100％陽(yáng)性兩次，用移液槍將孔中細(xì)胞吹下，置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，保存細(xì)胞株。所得的兩個(gè)細(xì)胞株OroD07和OroD09已經(jīng)于2005年10月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)分別為CGMCC No.1512和CGMCC No.1513。
ELISA的方法如下1.包被把抗原稀釋成所需濃度，通常為10ug/10ml，用包被液稀釋，100ul/孔加至酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。
1.封閉洗去包被液，用10％胎牛血清或1％的BSA封閉，每孔200ul，37℃放置1.5小時(shí)，或室溫放置2小時(shí)。
2.用洗板機(jī)洗滌三次，200ul/次，拍干。
3.加樣品第一孔抗體稀釋為10*-7mol/l，以后每孔對(duì)倍稀釋。100ul/孔，37℃放置1小時(shí)。
4.重復(fù)步驟3。
5.加酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)羊抗小鼠IgG，用40％小牛血清60％去離子水1∶1000稀釋，100ul/孔，37℃放置1小時(shí)。
6.重復(fù)步驟3。
7.加底物TMBA液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小時(shí)。
8.終止加2M的硫酸，50ul/孔。
9.酶標(biāo)儀讀數(shù)450nm波長(zhǎng)測(cè)定。
實(shí)施例3小鼠腹水制備和抗體的提取1.注射0.5ml石蠟至經(jīng)產(chǎn)孕鼠。
2.兩周后，收集OroD07和OroD09的單克隆抗體細(xì)胞各106個(gè)注射至上述小鼠。
3. 10天左右，當(dāng)小鼠腹部股出并有一點(diǎn)發(fā)黑，體毛有一些豎起時(shí)，拉頸處死，打開腹腔取出腹水。
4.3000rpm，15min。
5.取上清，分裝，-20℃保存。
6.購(gòu)買Amersham Biosciences公司的HITRAP PROTEIN G HP來(lái)提純，請(qǐng)按說(shuō)明書操作。
實(shí)施例4抗體標(biāo)酶a)稱0.004gHRP溶于0.4mlddH2O(溶液1)，稱0.006gNaIO4溶于0.469ml ddH2O(溶液2)。
b)取(溶液2)0.4ml逐滴加入溶液1，混勻放于4℃，避光30min至溶液呈墨綠色c)取0.4ml1％乙二醇逐滴加入上述液體，混勻放于4℃，避光30min至溶液呈深棕色d)取OroD09抗體0.5mg加入150ul反應(yīng)液，放入CBS中4℃透析過(guò)夜。
e)取出透析的溶液，計(jì)算體積。
f)現(xiàn)配5mg/ml的NaBH4g)加入20ul NaBH4，放于4℃，避光2hr。
h)加入等體積飽和(NH4)SO4，混勻放于4℃，避光3hr。
i)5000rmp離心30minj)取沉淀，用0.5mlPBS溶解，放入PBS中4℃透析過(guò)夜。
k)取出標(biāo)記好的抗體做配對(duì)。
實(shí)施例5抗體配對(duì)1.包被把OroD07稀釋成10ug/10ml，用包被液稀釋，100ul/孔加至酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。
2.封閉洗去包被液，用10％胎牛血清，每孔200ul，37℃放置1.5小時(shí)，或室溫放置2小時(shí)。
3.用洗板機(jī)洗滌三次，200ul/次，拍干。
4.加血清類粘蛋白抗原，100ul/孔，37℃放置1小時(shí)。
5.重復(fù)步驟3。
6.加OroD09酶標(biāo)二抗10ug/10ml，100ul/孔，37℃放置1小時(shí)。
7.重復(fù)步驟3。
8.加底物TMBA液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小時(shí)。
9.終止加2M的硫酸，50ul/孔。
酶標(biāo)儀讀數(shù)450nm波長(zhǎng)測(cè)定。

ELISA是酶聯(lián)免疫吸附分析的縮寫，其原理是根據(jù)抗原、抗體的特異性相互作用，以及通過(guò)酶聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)信號(hào)而設(shè)計(jì)的。為了利用ELISA技術(shù)尋找配對(duì)抗體并檢測(cè)抗原，本發(fā)明者首先需要對(duì)抗體進(jìn)行酶聯(lián)標(biāo)記。即將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。由于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。本發(fā)明者采用的標(biāo)記方法是簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法。本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與抗體上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近99％的抗體與酶結(jié)合，酶與抗體的活性無(wú)重大損失，是目前最常用的方法。標(biāo)記方法如下假定要標(biāo)1mg的抗體，1.配1L CBS(50Mm，pH9.6)，4度預(yù)冷；2.稱取1mg的HRP，用ddH2O溶解(棕色溶液)，濃度為10mg/ml，體積為0.1ml；3.稱取多于2mg的NaIO4，用ddH2O溶解，濃度為12.8mg/ml；4.取0.1ml NaIO4溶液(與酶液等體積)，逐滴加入到酶液中，混勻，置于4度，避光反應(yīng)約30min，至反應(yīng)液成墨綠色5.配1ml 1％(V/V)乙二醇，取0.1ml(與酶液等體積)，逐滴加入到反應(yīng)液中，混勻，置于4度，避光反應(yīng)約30min，至反應(yīng)液成棕色；6.將抗體和活化酶液加入到透析袋內(nèi)，混勻，置于CBS中透析，4度過(guò)夜；
7.(第二天)配PBS，10mM，pH7.2，4度預(yù)冷；8.取出透析的混合組分；9.現(xiàn)配NaBH4溶液，5mg/ml；在混合組分中加入40ul NaBH4/mgAb，置于4度，避光靜置2h；10.加入等體積的飽和(NH4)2SO4溶液，混勻，置于4度，避光靜置3h；(若標(biāo)酶體積過(guò)大，可先分裝，直接離心，避免損失)11.離心，5000rpm，4度，30min；12.取沉淀，用適量PBS(大約1ml PBS/mgAb)溶解，置于透析袋內(nèi)，于PBS中透析，4度過(guò)夜；13.(第三天)取出透析袋內(nèi)酶標(biāo)抗體，記下此時(shí)酶結(jié)合物體積，計(jì)算酶標(biāo)抗體的大概濃度，測(cè)OD403/OD280，一般此值在0.7左右(相當(dāng)于70％的標(biāo)記率)，4度放置；14.標(biāo)抗體的質(zhì)檢包括酶標(biāo)抗體活性ELISA檢測(cè)以及酶活力測(cè)定(參見質(zhì)檢)；15.加入等體積的甘油，混勻，置于-20度保存；或者加穩(wěn)定劑至終濃度為0.2mg/ml，4度保存(這一步驟可視情況而定)。
然后進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)，者利用雙抗體夾心法檢測(cè)抗原，操作步驟如下1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2)加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3)加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證OroD07，OroD09這兩個(gè)抗體確實(shí)是能和血清類粘蛋白結(jié)合，本發(fā)明者做了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。利用購(gòu)買的血清類粘蛋白抗體在癌癥病人腹水中進(jìn)行免疫沉淀，使抗原得到富積，然后用這兩個(gè)抗體對(duì)富積后的抗原進(jìn)行western檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該抗原確實(shí)可以被OroD07，OroD09這兩個(gè)抗體識(shí)別(結(jié)果如圖3)。
實(shí)施例6血清類粘蛋白在癌癥樣品中上調(diào)本發(fā)明者利用含5612個(gè)基因的人的cDNA陣列，檢測(cè)了多對(duì)癌癥病人及其癌旁正常組織樣品的基因表達(dá)譜，結(jié)果證實(shí)血清類粘蛋白基因在癌癥組織樣品中上調(diào)(表7)。Northern印跡實(shí)驗(yàn)證明血清類粘蛋白基因在癌癥組織樣品中上調(diào)(圖4)。
表7

實(shí)施例7臨床檢測(cè)1.本發(fā)明者首先對(duì)400份正常人血清中血清類粘蛋白的含量進(jìn)行了檢測(cè)(表8)。健康人均為參與健康體檢的人群，沒有已診斷明確的疾病，女性同時(shí)排除懷孕的情況。健康男性共234人，22-84歲，平均年齡58歲，健康女性共166人，23-85歲，平均53歲。從檢測(cè)結(jié)果中得到其95％的可信區(qū)間，從而確定正常人血清中血清類粘蛋白的參考值為8.07ng/ml。
表8

2.對(duì)100份胃癌，100份結(jié)腸癌及其他若干惡性腫瘤，總計(jì)400份血清；下表9是對(duì)惡性腫瘤病人情況的統(tǒng)計(jì)。
表9

將測(cè)定值超過(guò)正常參考值確定為指標(biāo)陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)各種疾病中的指標(biāo)陽(yáng)性率(表10)。
表10

3.良性疾病病人檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)良性病人為到醫(yī)院就診的其他非惡性腫瘤病人。共50例。包括肝硬化9例，慢性乙肝病人(大三陽(yáng))7例，慢性支氣管炎7例，胃潰瘍23例，胃粘膜息肉4例。在良性腫瘤和炎性病人的樣品中血清類粘蛋白有不同程度的升高，尤其是在肝炎和肝硬化的情況下，但是在癌癥病人中血清類粘蛋白的水平要明顯高于良性病人及正常人血清水平(mean±SD8.88ng/mL±5.58ng/mL vs.5.69ng/mL±2.38ng/mL；P＜0.001)4.正常人血清的參考值8.07ng/ml做為域值，高于該值的認(rèn)為是陽(yáng)性，則在胃癌及結(jié)腸病人中檢出率分別達(dá)到30.0％和32.3％，特異性分別為93.5％和94.2％。
討論本發(fā)明者運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)得到了血清類粘蛋白的一系列單克隆抗體細(xì)胞株，并從中找到了一對(duì)可配對(duì)抗體，又用ELISA和免疫沉淀的方法驗(yàn)證了本發(fā)明獲得的抗體確實(shí)識(shí)別血清類粘蛋白。在臨床檢測(cè)中，通過(guò)對(duì)400份癌癥病人，50份良性病人，400份正常人血清的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清類粘蛋白的血清學(xué)水平在癌癥病人中要明顯高于正常人的，從而可以得出結(jié)論本發(fā)明所制備的OroDO7，oroD09這兩個(gè)單抗細(xì)胞株能很好地檢測(cè)血清中血清類粘蛋白水平；血清類粘蛋白可以作為腫瘤，尤其是胃癌、結(jié)腸癌血清學(xué)診斷的腫瘤標(biāo)志物。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均納入本文作參考。
序列表<110>中資漢脈(北京)生物技術(shù)有限公司<120>血清類粘蛋白抗體及其用途<130>058406<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cgcggatcca acctagtacc ggtgcccatc act 33<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2cggcggaatg gattccccct cctcctgttt 30<210>3<211>531<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3aacctagtac cggtgcccat cactaacgcc accctggacc ggatcactgg caagtggttt 60tatatcgcat cggcctttcg aaacgaggag tacaataagt cggttcagga gatccaagca120accttctttt acttcacccc caacaagaca gaggacacga tctttctcag agagtaccag180acccgacagg accagtgcat ctataacacc acctacctga atgtccagcg ggaaaatggg240accatctcca gatacgtggg aggccaagag catttcgctc acttgctgat cctcagggac300accaagacct acatgcttgc ttttgacgtg aacgatgaga agaactgggg gctgtctgtc360tatgctgaca agccagagac gaccaaggag caactgggag agttctacga agctctcgac420tgcttgcgca ttcccaagtc agatgtcgtg tacaccgatt ggaaaaagga taagtgtgag480ccactggaga agcagcacga gaaggagagg aaacaggagg agggggaatc c 531
<210>4<211>177<212>PRT<213>人工序列<400>4Asn Leu Val Pro Val Pro Ile Thr Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ile Thr1 5 10 15Gly Lys Trp Phe Tyr Ile Ala Ser Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn20 25 30Lys Ser Val Gln Glu Ile Gln Ala Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn35 40 45Lys Thr Glu Asp Thr Ile Phe Leu Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asp50 55 60Gln Cys Ile Tyr Asn Thr Thr Tyr Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly65 70 75 80Thr Ile Ser Arg Tyr Val Gly Gly Gln Glu His Phe Ala His Leu Leu85 90 95Ile Leu Arg Asp Thr Lys Thr Tyr Met Leu Ala Phe Asp Val Asn Asp100 105 110Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Val Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr115 120 125Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr Glu Ala Leu Asp Cys Leu Arg Ile130 135 140Pro Lys Ser Asp Val Val Tyr Thr Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu145 150 155 160Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu165 170 175Ser
權(quán)利要求
1.特異性識(shí)別血清類粘蛋白的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
2.一種用于血清學(xué)診斷腫瘤的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含一對(duì)抗體，由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第一抗體，以及由保藏號(hào)為CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體作為第二抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述腫瘤選自肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述第一抗體和第二抗體中的任一抗體與標(biāo)記物偶聯(lián)。
5.血清類粘蛋白抗體在制備用于血清學(xué)檢測(cè)腫瘤的診斷劑中的用途。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自胃癌和結(jié)腸癌。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCCNO.1512、CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性識(shí)別血清類粘蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含上述單克隆抗體的用于血清學(xué)診斷腫瘤的試劑盒，以及血清類粘蛋白抗體在制備用于血清學(xué)檢測(cè)腫瘤的診斷劑中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1958611SQ200510030899
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者張亮, 胡明慧 申請(qǐng)人:中資漢脈(北京)生物技術(shù)有限公司