含有甘油和鞣質(zhì)的用于局部應(yīng)用的組合物的制作方法
【專利說明】
【背景技術(shù)】
[0001]幾乎所有的細菌，病毒，免疫學(xué)或創(chuàng)傷性起源的皮膚和粘膜損傷，涉及細胞損傷，以及他們的治愈直接關(guān)系到受損細胞的更換。為了生長，細胞需要水合和干凈，無病原體，無化學(xué)品，無廢料蛋白和蛋白水解酶的環(huán)境。在這些條件下，母細胞分泌包括膠原蛋白，彈性蛋白，層粘連蛋白，纖連蛋白和其他蛋白質(zhì)的游離顆粒的細胞外基質(zhì)，其形成附著子細胞的墊層。如果沒有這種基質(zhì)，子細胞沒有附著的支持體，因此無法成長；因此，損傷不能痊愈。
[0002]局部皮膚和粘膜損傷涉及細胞損傷，是非常難以愈合的，因為，除含有死細胞，細胞碎片，阻礙細胞生長和傷口修復(fù)的多個蛋白水解酶，這些病變保持開放到外部環(huán)境和常常受到污染。這就是為什么大多數(shù)的慢性傷口，如褥瘡，糖尿病潰瘍，或下肢靜脈潰瘍，永遠無法愈合的原因，近40%的患者在他們經(jīng)歷傷口消退之前死亡。
[0003]目前，還沒有具有所需的所有多重和基本性質(zhì)的單一的物質(zhì)或產(chǎn)品，并且沒有可用于皮膚和粘膜損傷的完整的治療。例如，當(dāng)前沒有用于愈合慢性傷口的治療。所有可用的藥物或者充當(dāng)抗菌藥，抗生素以減少微生物生長，充當(dāng)水凝膠或藻酸鹽或酯以保持水合傷口，充當(dāng)止痛藥或麻醉藥來減輕疼痛，充當(dāng)含膠原或透明質(zhì)酸的制劑以提供細胞基質(zhì)成分的一種，或者構(gòu)成生物工程化的皮膚或表皮移植物以取代皮膚，但這些治療中沒有涉及清潔損害和通過促進細胞生長以有利于天然皮膚或粘膜修復(fù)過程。
[0004]同樣缺乏適用于局部病毒感染如唇皰疹，生殖器皰疹，鼻竇炎，和流感的有效治療，其中大量的游離的病毒顆粒存在于受感染的生物表面，并通過局部可用的蛋白酶持續(xù)攻擊新的健康細胞。病毒感染通常是通過損傷表面上存在的多個蛋白酶介導(dǎo)的。目前，沒有任何藥物減少游離的病毒顆?；虻鞍酌?，感染的主要物質(zhì)。為了治療病毒咽喉感染，海水或鹽水含漱藥仍然被認為是最好的補救辦法之一，因為這些滲透活性的解決方案形成在咽喉粘膜的高滲膜，并由此產(chǎn)生低滲液體向外滲出有助于減少對咽喉表面污染物載荷。不幸的是，這種高滲溶液膜在幾分鐘內(nèi)被流出低滲液體稀釋，限制了治療的功效。不推薦使用增加的鹽或其它滲透成分的濃度，因為導(dǎo)致強刺激，細胞損傷和黏膜灼燒，或者因為在細胞附近有毒的化學(xué)品的存在將阻止細胞生長。
[0005]因此，非常重要的是，找到能夠滿足從被感染表面清潔所有污染物，例如自由浮動的細菌，病毒顆粒，死細胞，細胞碎片，死蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶，生長因子，細胞因子，蛋白酶，或灰塵顆粒的多種需求的物質(zhì)，以便提供細胞生長和組織修復(fù)必要的環(huán)境，而沒有對細胞或細胞基質(zhì)的任何毒性作用。
[0006]甘油，具有多個羥基的多元醇，是一種天然或合成來源的粘稠的，透明的，安全的，滲透性活性的，親水性的溶液。甘油通常用作食品成分，防腐劑，和保濕劑，并進入許多化妝品和藥品的組合物。甘油被廣泛用于創(chuàng)傷和燒傷局部應(yīng)用，經(jīng)常用作與其它活性成分聯(lián)合的賦形劑。在所有這些制劑中，甘油被用作媒介物，稀釋劑，粘度增強劑，加濕劑，或味道調(diào)節(jié)劑，但不作為活性成分以治療局部皮膚或粘膜病理。
[0007]損傷的皮膚或粘膜用作半透膜，并允許滲透發(fā)生。溶劑的跨半透膜的流動構(gòu)成滲流或滲透。達到滲透平衡所需要的壓力被稱為滲透壓。所述溶劑的濃度越高，它施加滲透壓越大。淡水被認為是等滲于1000千克/立方米的密度。海水和甘油分別具有1025千克/立方米及1259千克/立方米的密度。由甘油施加的滲透壓是高出海水近10倍。甘油的溶質(zhì)濃度也遠高于海水。在溶液中總?cè)苜|(zhì)濃度確定液體的滲流，因為滲透是由橫跨半滲透膜存在的溶質(zhì)/溶劑濃度差異所驅(qū)動?？?cè)苜|(zhì)濃度可以通過該溶液的重量摩爾滲透壓濃度來確定。含有3.4% NaCl的海水的滲透壓是0.581摩爾/公斤(總?cè)苜|(zhì)/摩爾重量/公斤)，與之相比的是，甘油滲透壓為10.86摩爾/公斤。這表明，純甘油比海水滲透活性高近18倍。因此，甘油可能已經(jīng)是為了產(chǎn)生低滲液體的滲透流出和清潔損傷的應(yīng)用于感染的表面的產(chǎn)品選擇。不幸的是，滲出的低滲液體立即稀釋甘油和在幾分鐘之內(nèi)從傷口表面排出甘油，限制這些清潔效果。
[0008]因此，需要安全和無刺激性的治療，其具有保濕(保持水合)，清潔，殺菌，并且還具有抗細菌，抗病毒和抗蛋白酶活性的多個性質(zhì)。
[0009]W0 00/74668公開了使用高滲滲透活性溶液，其用于治療局部損傷，涉及使用甘油作為粘稠溶液以用于局部應(yīng)用，所述局部應(yīng)用用于治療潰瘍或淺表損傷，其包含甘油作為活性成分和羽衣草(Alchemilla vulgaris)水甘油化提取物作為細胞生長促進劑。然而，在TO 00/74668中使用的甘油不是成膜劑，因此無法提供上述詳細的優(yōu)點。單獨使用甘油作為治療劑來清潔受感染或損傷的組織是不常見的，因為，由于滲透，從組織的內(nèi)部低滲液體流出的現(xiàn)象，甘油在幾分鐘之內(nèi)得到稀釋，逐漸失去其滲透性質(zhì)和活性，并沒有令人滿意地作為總的清潔劑。甘油膜應(yīng)保留在半透活組織膜至少30分鐘，以產(chǎn)生足夠的清潔生物組織表面的滲透。
[0010]本發(fā)明涉及如何改善活生物表面對甘油膜的保留時間，以克服上述的缺點的問題。
[0011]其次，冷凍保存是其中通過冷卻到零度以下的溫度，保存細胞，全組織，或易受化學(xué)反應(yīng)性或時間引起的損害影響的任何其它物質(zhì)的方法。在足夠低的溫度下，可能會造成所涉及的材料受到損害的任何酶或化學(xué)活性被效地停止。冷凍保存方法力求達到低溫，而不產(chǎn)生冷凍過程中由于冰晶的形成而導(dǎo)致的額外傷害。對于長期活細胞儲存，冷凍保護劑必須是對細胞無毒的，并能防止晶體形成。這對于活細胞和組織儲藏或保存(例如:皮膚移植)特別重要，因為，當(dāng)死亡或正在死亡的細胞數(shù)量增加時，成功的細胞復(fù)活或組織移植的可能性降低。
[0012]目前，DMS0(二甲基亞砜)，人或牛胎血清(FCS)，和甘油被用作冷凍保護介質(zhì)，以保護細胞免受凍結(jié)溫度和水晶體損傷，從而最大限度地減少細胞的死亡率。不幸的是，這些冷凍保存劑中沒有一個能夠在很長一段時間，即數(shù)月至數(shù)年保存細胞。通常，30-40%的細胞在活細胞冷凍保存的幾天之內(nèi)，和50%以上的活細胞在冷凍保存的數(shù)月內(nèi)死亡(Bravo等人，燒傷 26(4)，367-78，2000) (Bravo et al.Burns 26 (4)，367-78，2000)，特別是由于形成水晶體所造成的細胞損傷。
[0013]因此，迫切需要找到一種冷凍保存劑，其能夠形成圍繞細胞或組織的薄膜，并保護它們免受外界侵害以及水晶體的形成，以增強細胞生存力。
[0014]概要
[0015]為了解決上述的詳細問題，本發(fā)明提供一種甘油制劑，其含有特定植物鞣質(zhì)，所述特定植物鞣質(zhì)能夠結(jié)合至甘油分子和由此改善甘油制劑在半滲透生物膜上的膜形成性能和保留時間期間。這種成膜劑甘油可用作局部應(yīng)用的天然和安全的治療，以治療各種皮膚和粘膜感染和在冷凍保存過程中保護活組織。
[0016]因此本發(fā)明涉及用于局部應(yīng)用的包括甘油和植物鞣質(zhì)的制劑。所述植物鞣質(zhì)具有結(jié)合甘油，使得甘油具有成膜劑性質(zhì)的能力。
[0017]在一個實施方案中，植物鞣質(zhì)是選自原花色素。
[0018]在優(yōu)選的實施方案中，這些原花色素是從植物的部分或整株植物獲得，所述植物選自歐洲越橘，大果越橘，葡萄，歐洲接骨木，山茶，大豆，兒茶，白蠟樹，銀杏，黑果醋栗，艾菊屬銀膠菊屬(Tenacetum parthenium)，白柳(Salix alba)，鼠尾草(Salviaofficinalis)，迷迭香(Rosmarinus officinalis)，仙人掌屬(Opunitia sp.)，桑(Morusalba)，懸鉤子屬(Rubus sp.)，櫟屬(Quercus sp.)，松屬(Pinus sp.)，以及它們的組合。
[0019]在更優(yōu)選的實施方案中，富含原花色素的鞣質(zhì)級分從植物的部分，或整株植物獲得，所述植物選自歐洲越橘(Vaccinium myrtillus)，大果越橘(Vaccinium macrocarpon)，葡萄(Vitis vinifera)，歐洲接骨木(European elder)，山茶(Camellia sinensis)，黑果醋栗(Ribes nigrum)，兒茶(Acacia catechu)，白錯樹(Fraxinus chinensis)，銀杏(Gingko biloba)，大豆(Glycine max)，以及它們的組合。
[0020]在另一個實施方案中，原花色素是合成的，而不是從植物獲得的。
[0021]在一個實施方案中所述制劑的甘油含量介于30%至99.99% (v/v) 0
[0022]在一個實施方案中，所述制劑包括活性成分?；钚猿煞挚梢詮乃幬铮股?，防腐劑，營養(yǎng)素，抗體，生長因子或蛋白質(zhì)中選擇。
[0023]本發(fā)明還涉及上述制劑用于皮膚和粘膜感染的治療的用途。
[0024]上述制劑可進一步用于保護，運輸，儲存或冷凍細胞，組織或器官。在一個實施方案中最終溶液中的成膜劑甘油與存在于最終溶液中的其它的稀釋劑，諸如例如FCS，培養(yǎng)基，和DMS0相比的濃度，在2至50% (v/v)，優(yōu)選10至30% (v/v)，更優(yōu)選15至20% (v/V)之間變化。
[0025]本發(fā)明還涉及通過以下增強生物表面對甘油膜的保留時間的方法:制備甘油和具有結(jié)合甘油分子的能力的植物鞣質(zhì)的溶液，將溶液施加到生物表面。
[0026]本發(fā)明還涉及治療皮膚和粘膜感染的方法，其包括施加上述制劑至患處(受影響的區(qū)域)(affected area)的步驟。
[0027]本發(fā)明還涉及制備成膜劑甘油的方法，包括混合甘油或多元醇溶液與甘油結(jié)合植物鞣質(zhì)。在一個實施方案中植物鞣質(zhì)可以作為粉末或液體添加。
[0028]如在實施例和在下面的附圖中描述的研究顯示，通過添加鞣質(zhì)改善甘油成膜劑性質(zhì)，和與非成膜劑甘油相比成膜劑的治療功效大幅增加:
[0029]附圖
[0030]圖.1:通過熱重分析(TGA)測量單獨的甘油與成膜劑甘油相比的溶解性。
[0031]圖.2:成膜劑甘油與正常的甘油相比對糖尿病傷口的膜保留持續(xù)時間。
[0032]圖.3:牛皮癬，濕疹及皮炎(PED)現(xiàn)象的平均整體癥狀嚴重程度的測量:單獨的甘油-對照組的影響。
[0033]圖.4:牛皮癬，濕疹及皮炎(PED)表現(xiàn)的平均整體癥狀嚴重程度的測量:成膜劑甘油的影響；積極治療組:用成膜劑甘油VB-DERM治療如通過實施例5制劑n° 11，和51。結(jié)果表明，成膜劑甘油完全消除生長刺激因子，白介素，和干擾素的所有游離粒子，并恢復(fù)正常的皮膚細胞生長。
[0034]圖.5:采用成膜劑甘油治療的PED患者生活質(zhì)量中的改善，與正常甘油相比。
[0035]圖.6:各自的治療(成膜劑甘油與正常甘油相比)對總體PED嚴重性的影響。
[0036]圖.7:總體鼻竇炎病況；采用正常甘油噴霧治療的