專利名稱：用于診斷乳癌侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳癌控制的領域，包括所述乳癌的侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的診斷，以及適當的治療的選擇。本發(fā)明是在POLQ的過度表達與乳房腫瘤的侵襲性、以及因此的患者的生存高度相關這一發(fā)現的基礎上的。同樣其過度表達還與遺傳不穩(wěn)定性相關，其然后可被用于殺傷腫瘤細胞。例如，輻射療法對已經受損的DNA更有效。同樣地，DNA修復抑制因子可以防止DNA斷裂的修復，從而導致腫瘤細胞死亡。
背景技術：
乳癌是女性中最常見的惡性腫瘤，是影響女性的所有癌癥中具有最高致死率的一種。大多數乳癌表現為生長緩慢，無痛性團塊。有一些可能表明乳癌存在的體征，其可通過乳房檢查被發(fā)現。乳癌通過直接擴散、以及通過淋巴和血流轉移。目前有一些方法被用于治療乳癌，包括手術、輻射療法、激素療法和化學療法。成功的癌療法涉及原發(fā)腫瘤以及任何轉移瘤，無論是臨床上顯著的或是顯微的。因為乳房腫瘤可用綜合療法(combined modality therapy)治愈,可以單獨使用上述方法的一個,或使與其一種或更多種其它療法組合。對于患者，選擇合適的治療是重要的。有必要知道為了防止侵襲性乳癌的擴散，什么時候立刻使用劇烈的積極治療(aggressive treatment)操作。否則，患者的生存可能被嚴重受損盡管存在許多用于檢測、診斷和治療乳癌的技術，該疾病仍是女性最常見的癌癥，是最致命的疾病之一(Jemal等人，Cancer Statistics59:225-249，2009)。相反地，當患者所患的腫瘤沒有必要的時候而進行劇烈的積極治療，對于患者也是不利的。事實上，劇烈的積極治療常常導致不利的毒性，可能嚴重影響患者的生活質量。另外，這種劇烈的積極治療通常是非常昂貴的，因而僅應當在必要的時候進行。目前，治療的選擇根據腫瘤的階段，其通常使用來自美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)的腫瘤/結/轉移(TW)測試進行。TW系統(tǒng)根據三種類型分配一個數字?！癟”表示腫瘤大小，〃N〃表示淋巴結浸潤程度，且“M”表示轉移程度。癌癥的較寬的階段通常被引作數字
I、II、III、IV，其來自由預后分組的 !值；更高的數字表示更加進展的癌癥，其可能有更不好的結果-0期表示非侵襲性乳癌。其沒有在乳房中或者向身體其它部分擴散。-I期是浸潤性乳癌的早期，其中測量腫瘤直徑不超過2厘米(cm)，并且沒有涉及淋巴結轉移。在此階段，癌不擴散到乳房以外。-II期，細分為IIA和IIB，表示浸潤性乳癌，其中有以下中的一項是事實-測量腫瘤小于2cm，但已經擴散到臂下淋巴結-在乳房沒有發(fā)現腫瘤，但在腋窩淋巴結發(fā)現癌-腫瘤在2cm和5cm之間(大約I至2英寸)，但可能擴散到臂下淋巴結-腫瘤超過5cm，但沒有轉移到任何淋巴結-III期乳癌被細分為3個類型——IIIA、IIIB和IIIC——根據不同標準的數字。根據定義，III期的癌癥沒有擴散(轉移)至遠處。-一個IIIA期腫瘤，例如，大于5cm，并擴散至一個至三個臂下淋巴結。其它IIIA期腫瘤可以是任何尺寸并且擴散至多個淋巴結。這些淋巴結聚在一起，互相附著或附著于周圍組織。-在IIIB期乳癌中，任何尺寸的腫瘤擴散至乳房臨近組織一皮膚和胸肌一且可能已擴散至乳房內或臂下淋巴結。IIIB期也包括炎性乳癌，一種不常見的但侵襲性的乳癌類型。-IIIC期是任何尺寸的腫瘤。其已擴散-至10或更多的臂下淋巴結-至鎖骨上或下和頸部附近的淋巴結-至乳房自身內的淋巴結和至臂下淋巴結-IV期的乳癌已擴散至身體的其它遠處部分，如肺、肝臟、骨或腦。盡管此測試和階段系統(tǒng)提供了一些關于在患者中被診斷為乳癌的階段的有價值的信息，但是其不能鑒別腫瘤進展的最早期。已經顯示遺傳的不穩(wěn)定性是致突變的第一事件之一(Bartkova 等人，Nature, 434:864-870，2005;Gorgoulis 等人，Nature, 434:907-913, 2005)?？墒?，這不能在TNM測試中被檢測，僅僅能夠通過臨床中常規(guī)基礎很難使用的分析進行。另外，TNM測試不能給出腫瘤侵襲性的信息，因而其對預后的有用性是有限的。事實上，為了進行可靠的預后，在最早期能夠區(qū)分侵襲性和非侵襲性腫瘤是重要的。盡管在IV期的患者顯然具有不良的預后，但在早期被診斷為乳癌的事實也不能排除盡管在最早期，該腫瘤可能進一步非常迅速發(fā)展的可能性。相反地，當淋巴結被腫瘤細胞浸潤時， M測試給出了一個不好的預后，患者通常經歷一個嚴重的手術并隨后的加強的化學療法。然而，如果某些這樣的患者實際上患的是非侵襲性的乳癌，則化學療法，一種積極的致突變的治療，則是可以避免的，且并不降低患者的生存預后。因而，真正需要更好的乳癌預后測試，其不僅僅改善患者的全面生存，還改善了他們的生存質量，且對真正能從積極的高花費的化學療法受益的患者堅持該化學療法。因而，發(fā)現新的更可靠的預后檢測成為一個非常積極的研究領域。在正常細胞的增殖中，DNA復制是通過已知為復制聚合酶(P0LA、P0LD和POLE)三種DNA聚合酶進行的。可是，在人類細胞中鑒別了 10種其它的DNA聚合酶，其被認為是專門的聚合酶，其功能仍大部分未知。因為他們能加工盡管受損了的DNA的能力，因此這些專門的聚合酶看起來是經歷了進化而保留的。還看起來這些聚合酶是非常致突變的，他們的活性被嚴格控制。POLQ (也稱為POL theta或POL 0 )是這些專門的DNA聚合酶的一種，在其N-端部分包含一個解旋酶域，在其C-端包含一個聚合酶域。盡管此特殊的專門的DNA聚合酶的功能仍大部分未知，看起來其涉及基因組穩(wěn)定性的維持和DNA修復(Seki等人，EMBO J，23:4484-4494，2004 ；Masuda 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，102:13986-13991，2005，Yoshimura 等人，Mol. Cell, 24:115-125，2006)。Kawamura 等人(Kawamura 等人 ，Int J Cancer, 109:9-16，2004)比較了在一些包括乳腺的非腫瘤組織和在肺(27名患者)、結腸(26名患者)和胃(28名患者)的癌組織中的POLQ的表達水平。他們發(fā)現POLQ在非腫瘤組織中幾乎不能被檢測到，但是其在相當比例的肺、胃和癌組織中過度表達。作者還指出腫瘤組織中POLQ的過度表達與不好的生存預后相關。但是，他們沒有測試乳房腫瘤細胞系或乳房腫瘤中POLQ的表達水平。本發(fā)明人分析了腫瘤相對于鄰近的正常乳房組織中POLQ基因表達的變化，比較了這些數據與疾病進展和臨床特性。其顯示POLQ在乳房腫瘤組織中顯著地過度表達。另夕卜，其證明了 POLQ的失控表達積極地有助于腫瘤進展。事實上，POLQ過度表達導致遺傳的不穩(wěn)定性和明顯的DNA斷裂。

發(fā)明內容
因而，本發(fā)明提供了用于診斷患者中乳癌侵襲性的方法。根據本發(fā)明的方法，提高的POLQ基因表達水平表明所述乳癌的侵襲性。因此，本發(fā)明提供了用于從患者的乳癌樣本診斷所述患者中乳癌侵襲性的方法， 其包括a)體外測量所述患者乳癌樣本中POLQ基因的表達水平和對照基因的表達水平，b)計算所述患者的乳癌樣本中所述POLQ基因的POLQ表達水平與所述對照基因的表達的表達水平比，c)比較所述POLQ表達水平比與相應的閾值，和d)如果所述POLQ表達水平比高于相應的閾值，則診斷乳癌為侵襲性。特別地，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可被用于預后具有多個轉移淋巴結的患者的生存。在此實施方案中，具有多個轉移淋巴結的患者中高水平的POLQ表達表明腫瘤的侵襲性，導致不好的生存預后，而具有多個浸潤淋巴結的患者中低水平的POLQ表達與比較好的診斷相關。數量少的轉移淋巴結可以被定義為，例如，浸潤淋巴結計數等于I或小于1，而多個轉移淋巴結可以被定義為浸潤淋巴結計數等于2或大于2。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可被用于預后患有表達p53wt cDNA (與來自GenBank的NC000017-9的序列對照后該序列包含任何突變)的腫瘤的患者的生存。在這個實施方案中，具有表達p53wt cDNA腫瘤的患者中POLQ表達的高水平表明腫瘤的侵襲性，導致不好的生存預后，而具有表達p53wt cDNA腫瘤的患者中POLQ表達的低水平與比較好的預后相關。事實上，發(fā)明人已顯示具有表達p53wt cDNA腫瘤的患者中POLQ表達的低水平與98%的生存可能性相關。在另一方面，本發(fā)明的方法允許檢測表現遺傳不穩(wěn)定性的癌細胞。POLQ的失控表達導致增加的DNA損傷和染色體的不穩(wěn)定性，因而誘發(fā)Y H2AX-ATL-CHK2DNA損傷檢驗點的構建性激活。因此，本發(fā)明提供了用于從患者的乳癌樣本診斷所述患者中乳癌遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括a)體外測量所述患者乳癌樣本中POLQ基因的表達水平和對照基因的表達水平，b)計算所述患者乳癌樣本中所述POLQ基因的POLQ的表達水平與所述對照基因的表達的表達水平比，c)比較所述POLQ表達水平比與相應的閾值，和d)如果所述POLQ表達水平比高于其相應的閾值，則診斷乳癌為遺傳不穩(wěn)定性。應該理解兩種方法可以組合。因而，在另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷患者中乳癌侵襲性和用于檢測表現遺傳不穩(wěn)定性的癌細胞的方法。因而，本發(fā)明的方法呈現出允許檢測與不良生存預后和遺傳不穩(wěn)定性相關的遺傳事件的優(yōu)點。如文中使用的，術語“P0LQ”指編碼DNA聚合酶0的人類基因(Entrez基因ID號10721 ;mRNA序列參照號NM 199420. 3 ;蛋白序列參照號=NP 955452. 3)。此外，本發(fā)明包括所述POLQ基因的所有同種型。同種型，如此處所用，涉及POLQ基因的所有不同形式，并可能由突變產生，或可能通過可選的剪接來自同一基因。多數同種型是由單核苷酸多態(tài)性或SNPs，相同基因的等位基因間小的遺傳差別引起的。這些發(fā)生在一個基因內特定的個別的核苷酸位點。在此定義中也包括通過采用不同的啟動子從相同的基因產生不同版本的信使RNA的情況，該啟動子引起越過某些外顯子的轉錄。因而，應當理解本發(fā)明的方法不局限于POLQ本身，也包含一個或多個POLQ同種型。根據本發(fā)明的方法，測量POLQ基因和/或一個或多個其同種型的表達水平，并計算表達比。根據本發(fā)明，乳癌的“侵襲性”意指所述乳癌浸潤腸壁、淋巴結和發(fā)生轉移的傾向以及所述浸潤可能出現的速度。乳癌的侵襲性顯然與生存相關，可以使用上述方法預后患者的生存，其中診斷為侵襲性的病例導致不好生存預后，而沒有侵襲性的診斷則產生良好的生存預后。如文中使用的，乳癌的“遺傳不穩(wěn)定性”意指所述乳癌的腫瘤細胞具有遭受DNA損傷的傾向。遺傳不穩(wěn)定性是更加常常發(fā)生DNA損傷的乳癌的標志。通過“DNA損傷”表明對DNA的損傷通過引起DNA的共價修飾或使其偏離其正常的雙螺旋構象而影響DNA的正常功能。DNA損傷包括結構變形，其干擾復制與轉錄，以及能斷裂堿基并改變DNA序列的點突變。一般而言，當一個細胞發(fā)生DNA損傷時，細胞周期停止在三個檢驗點之一(G1/S、S期內或G2/M)。細胞周期停止可導致DNA修復過程的激活(在DNA損傷相對小的情況)，或者導致凋亡的發(fā)生(在嚴重的DNA損傷的情況)。DNA損傷可由內源過程自發(fā)產生，比如由正常代謝產生的活性氧和自由基引起的堿基氧化和DNA鏈中斷的發(fā)生，在DNA復制期間由DNA聚合酶產生的堿基的甲基化、脫嘌呤、脫嘧啶、堿基的錯配等等。DNA損傷也可以由環(huán)境危害引起，如輻射(例如，紫外線輻射、X-射線、Y射線、電離輻射)、天然毒素(例如，植物毒素)、合成毒素、藥物(例如，癌癥化學療法，輻射療法)，烷化劑等等。DNA損傷可導致或來自于各種疾病，包括遺傳性遺傳疾病和由于暴露于環(huán)境危害引起的疾病。DNA損傷也可由吸煙引起，其導致例如心臟病，或由其它疾病，如癌癥的療法引起。使用待檢測患者的乳癌樣本進行上述方法。在某些情況中，根據本發(fā)明的方法可進一步包括從患者獲取乳癌樣本的預備步驟。通過“乳癌樣本”，指腫瘤乳房組織樣本。甚至在癌癥患者中，乳房組織也包括非腫瘤的健康組織。因而“乳癌樣本”應當被限定于取自患者的腫瘤乳房組織。所述“乳癌樣本”可以是活檢樣本或取自外科乳房切除術療法的樣本。另外，根據本發(fā)明的方法可以在從患者獲取樣本以及如上述步驟a)之間包括其它的預備步驟，相應的為將乳癌樣本(以及任選地，健康的乳房組織樣本)轉換成mRNA (或相應的cDNA)樣本或轉換成蛋白質樣本，隨后其可備用于步驟a)中的體外基因表達水平的測量。從組織樣本中mRNA (以及逆轉錄為cDNA)或蛋白質的制備或提取僅僅是本領域技術人員熟知的常規(guī)程序。
一旦犾得了即用的乳癌mRNA (或對應的cDNA)或蛋白質樣本,可進打POLQ基因表達水平的測量，其取決于轉換和可獲得的即用樣本的類型，是在mRNA (即，根據樣本中mRNA的含量)還是在蛋白質(即，根據樣本中蛋白質的含量)水平。在某些實施方案中，可以在mRNA水平測量一些基因的表達水平，而在蛋白質的水平測量其它基因的表達水平。在這個情況中，取自患者的乳癌樣本的一部分被轉換為mRNA (或對應的cDNA)樣本而另一部分被轉換成蛋白質樣本。在其它實施方案中，所有被測試的基因的表達水平是在mRNA水平測量或在蛋白質水平測量。當在mRNA水平測量表達水平時，顯著地可以使用熟知的技術進行，如定量PCR或核酸微陣列技術(包括cDNA和寡核苷酸微陣列)。這些技術現在已被本領域技術人員常規(guī)使用，因此不需要在此詳細地描述。使用定量PCR的實施方案的實施例在實驗部分描述?？蛇x地，可以使用允許根據mRNA含量評價基因表達水平的任何已知或未來技術。例如，可以使用原位雜交中偶聯(lián)熒光的組織微陣列。組織微陣列(也稱為TMAs)由石蠟塊組成，其中多至1000個獨立的組織核以陣列形式組裝，以允許多重組織分析。在組織微陣列技術中，使用空心針從石蠟包埋的組織(如臨床活檢或腫瘤樣本)的目標區(qū)域取出直徑小如0. 6mm的組織核。然后將該組織核以精確的空間陣列模式插入受體石蠟塊中。使用切片機對所述塊切片，裝于顯微鏡載片上，然后通過任何標準組織學分析的方法分析。每個微陣列塊可被切為 100-500個切片，其可被用于獨立的測試。在組織微陣列中通常采用的測試包括免疫組織化學和原位雜交中的熒光。對于在mRNA水平的分析，可以將微陣列技術偶聯(lián)至原位雜交中的熒光。當在蛋白質水平測量表達水平時，顯著地可以使用特異性的抗體進行，特別地使用熟知的技術，如Western印跡、ELISA或ELISP0T、抗體微陣列、或偶聯(lián)免疫組織化學的組織微陣列。通過計算所述患者乳癌樣本中的POLQ基因的表達水平相對于對照基因表達水平的表達水平比，通過比較得到的表達水平比與相應的閾值，進行所述患者的乳癌樣本中被測量基因的表達水平的比較。根據本發(fā)明，所述的對照基因是在所有細胞類型中表達的基因。更特別地，根據本發(fā)明的對照基因是在構成乳房的所有細胞中表達的基因。在另一方面，對照基因的表達水平不受細胞狀態(tài)的影響，即，在健康細胞和腫瘤細胞中對照基因表達為相同的水平。在一個特定的實施方案中，對照基因是管家基因。管家基因是在所有細胞類型中表達的基因，其為所有細胞類型的維持提供了基本的功能。人類管家基因的列表可在 Eisenberg 等人(Trends in Genetics 19:362-365，2003)中找到。根據本發(fā)明優(yōu)選的管家基因是選自 B2M、TFRC, YffHAZ, RPLO, 18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB,PGKl、HPRTl、IP08和HMBS的基因。根據本發(fā)明的進一步優(yōu)選的管家基因是IP08或HMBS。根據本發(fā)明，“閾值”意指允許區(qū)分樣本的值，其中目標基因的表達水平比對應于患者乳癌樣本中所述的目標基因的表達水平，其是低的或高的。特別地，如果基因表達水平比低于或等于閾值，那么在患者乳癌樣本中的該基因表達水平被認為是低的，而如果基因表達水平比高于閾值，那么在患者乳癌樣本中的該基因表達水平被認為是高的。對于每個基因，且取決于用于測量基因表達水平的方法的不同，最佳的閾值可不同。但是，本領域技術人員根據多種對照乳癌樣本的分析以及比較其與對照基因(例如，管家基因)的表達，可以容易地確定該閾值，在所述對照乳癌樣本中，對于該特定基因的表達水平(低或高)是已知的。特別地，發(fā)明人確定了 15. 8的獨特閾值是特別有用的。發(fā)明人顯示表達水平比在此閾值上的患者生存顯著地降低。當使用定量PCR在mRNA水平測量所有基因的表達水平時，該15. 8的獨特閾值特別有用。本發(fā)明進一步涉及專用于實現根據本發(fā)明方法的微陣列，其包括最多500個、優(yōu)選最多300個、最多200個、更優(yōu)選最多150個、最多100個、甚至更優(yōu)選最多75個、最多50個、最多40個、最多30個、最多20個、最多10個不同的探針，其中至少I個特異地結合POLQ mRNA (或相應的cDNA)或蛋白質。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述微陣列是核酸微陣列，其包括最多500個、優(yōu)選最多300個、最多200個、更優(yōu)選最多150個、最多100個、甚至更優(yōu)選最多75個、最多50個、最多40個、最多30個、最多20個、最多10個不同的探針(因而，例如排除了全基因組(pangenomic)微陣列)其中至少I個特異地結合POLQ mRNA (或相應的cDNA)。除特異地雜交POLQ的探針外，所述微陣列還包含至少一個特異地雜交管家基因的探針。在一個實施方 案中，所述管家基因選自 B2M、TFRC、YffHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08和HMBS。更優(yōu)選地，管家基因是IP08或HMBS基因。根據本發(fā)明，“核微陣列”由不同的核酸探針組成，其附著于基底，該基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、樹脂、多糖、硅或基于硅的物質、碳、金屬、無機玻璃或硝化纖維構成。探針可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微陣列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微陣列”，寡核苷酸長度為大約25至大約60個堿基對或更短)?？蛇x擇地，在另一個實施方案中，所述微陣列可以是抗體微陣列，其包括最多500個、優(yōu)選最多300個、最多200個、更優(yōu)選最多150個、最多100個、甚至更優(yōu)選最多75個、最多50個、最多40個、最多30個、最多20個、最多10個不同的抗體，其中至少I個特異地結合POLQ蛋白質。除特異地結合POLQ蛋白質的抗體外,所述微陣列還包含至少一個特異地結合管家蛋白質的抗體。在一個實施方案中，所述管家蛋白質選自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKU HPRTU IP08 和 HMBS 蛋白質。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述管家蛋白質是IP08或HMBS蛋白質。除核酸或抗體微陣列技術外，可以使用定量PCR，因而待檢測的基因特異的擴增引物對于進行根據本發(fā)明的方法也非常有用。因而，本發(fā)明進一步涉及用于從患者的乳癌樣本中診斷所述患者乳癌的侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的試劑盒，其包括如上所述的專用微陣列或POLQ特異的擴增引物。在此，當試劑盒包含擴增引物時，所述試劑盒可包含其它基因特異的擴增引物，所述試劑盒優(yōu)選包含最多100、最多75、50、最多40、最多30、優(yōu)選最多25、最多20、最多15、更優(yōu)選最多10、最多8、最多6、甚至更優(yōu)選最多5、最多4、最多3或甚至2或I或甚至0對其它基因而非POLQ特異的擴增引物。例如，除POLQ的引物外，所述試劑盒可以包含至少一對用于至少一個管家基因的擴增引物。在一個實施方案中，所述管家基因選自 B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGKl、HPRTl、IP08和HMBS。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述管家基因是IP08或HMBS基因。如上提及的，預后與其侵襲性相關聯(lián)的乳癌進展的能力，對于選擇適當的治療非常重要，理由是除傳統(tǒng)的外科治療外，每次必要時且僅在必要時，使用具有潛在副作用的劇烈的昂貴的治療。因而，本發(fā)明還涉及用于在患者中選擇適當的乳癌治療的方法，其包括a)使用如上所述的根據本發(fā)明的方法診斷所述患者中所述乳癌是或不是侵襲性，以及b)如果所述乳癌在步驟a)中診斷為侵襲性，則在外科治療中增加輔助的輻射療法和化學療法。除了其對乳癌侵襲性的預后價值外，發(fā)明人還發(fā)現基于POLQ表達水平分析的相同測試可以允許診斷是否存在遺傳不穩(wěn)定性，因而導致上述方法可用于診斷遺傳不穩(wěn)定性。特別地，本發(fā)明人顯示失控的POLQ表達與DNA斷裂頻率的增加相關。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法被用于診斷DNA斷裂。這種遺傳不穩(wěn)定性以及DNA斷裂頻率的顯著增加可能導致有關輔助療法的選擇。特別地，遺傳不穩(wěn)定性可能有助于腫瘤細胞突變，以及因此增殖和粘附的失控，DNA斷裂的出現也可被用于抗腫瘤細胞。事實上，對于連續(xù)的增殖，那些DNA斷裂被修復，而具有大量DNA斷裂的細胞通常容易引起細胞死亡。結果，輻射療法可能不能在所有環(huán)境中有效，但其
對已經存在增加的DNA斷裂頻率的腫瘤細胞的效率可被改善。例如，輻射療法可能對于被本發(fā)明的方法確認的POLQ過度表達的乳房腫瘤細胞高度有效，原因是這些細胞含有高水平的DNA斷裂和染色體不穩(wěn)定性。以同樣的方式，使用DNA修復抑制因子可允許凍結DNA斷裂而導致腫瘤細胞死亡。更一般地，發(fā)明人顯示DNA損傷檢驗點(DDC)或DNA代謝的抑制導致降低的POLQ過度表達的細胞的活力。例如，Chk2激酶活性中受影響的細胞不能檢測到POLQ過度表達誘導的DNA損傷和/或響應所述損傷而引起的細胞周期的停止。同樣地，POLQ過度表達細胞表現出對DDC或核苷酸代謝抑制增加的敏感性。因而，本發(fā)明還涉及用于預后輻射療法或DNA修復DNA損傷信號或核苷酸代謝抑制因子在患者乳癌治療中效率的方法，其包括a)使用如上所述的根據本發(fā)明的方法診斷所述患者的所述乳癌是或不是遺傳不穩(wěn)定性，和b)如果在步驟a)診斷為遺傳不穩(wěn)定性，則預后輻射療法或DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝抑制因子效率。根據本發(fā)明，“DNA修復抑制因子”意指能夠抑制DNA斷裂(特別是雙鏈DNA斷裂)修復的分子。然而，這種表述不應當被理解為限定性的，DNA修復抑制因子的實例包括DNA修復蛋白 PARP 的抑制因子(參見，例如 W02004080976、W02005/053662、W02009/046205)、組蛋白脫乙?；傅囊种埔蜃樱鏟CT申請W02008/082856中描述的那些，和DNA聚合酶3抑制因子(參見W02007001684)?！癉DC抑制因子”是能夠阻斷涉及DNA損傷檢驗點中任何蛋白質活性的分子。此種蛋白質的實例包括ATM/ATR、Chk2和Chkl。如文中使用的，“核苷酸代謝抑制因子”包括所有導致核苷酸庫失衡的化合物，理由是所述核苷酸代謝抑制因子是例如核苷酸類似物(如6TG)或由于其抑制核苷酸生物合成酶(如HU)。在其它實施方案中，本發(fā)明還涵蓋用于分離能夠抑制DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝的新的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使化合物與過度表達POLQ的細胞或不過度表達POLQ的細胞接觸，和b)分析是否所述化合物對POLQ過度表達細胞活力的影響多于其對不過度表達POLQ細胞的活力的影響。過度表達POLQ的細胞可以是任何類型的細胞，其中POLQ的表達失控，而不過度表達POLQ的細胞是對POLQ表達的調節(jié)得以維持的細胞。例如，在強的普遍存在的啟動子的控制下，用帶有POLQ基因或cDNA的骨架載體轉染宿主細胞，可以獲得過度表達POLQ的所述細胞。在此情況中，有利地，所述細胞是用相同骨架載體轉染的宿主細胞，其中所述載體不含有POLQ插入。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種或多種DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝抑制因子在制備藥物中的用途，其中所述藥物預期用于治療其乳房腫瘤過度表達POLQ的患者的乳癌。根據本發(fā)明，如果所述乳癌樣本中所述基因表達水平與對照基因表達水平的比高于如上定義的閾值，則該乳癌樣本中的基因被認為是“過度表達的”。在一個特別的實施方案中，所述閾值可以是15. 8。本發(fā)明還涉及用于治療患過度表達POLQ的乳癌的患者的方法，其包括對所述患者實施輻射療法和/或向所述患者施用有效量的一種或多種DNA修復抑制因子。


圖I.來自組I (法國，n=105)的乳房腫瘤中DNA聚合酶基因的相對表達。計算了腫瘤(T)和正常(N)乳房樣本mRNA表達比(T/N)(預先對表達水平相對于對照基因進行了正態(tài)化)。T/N>1和〈I分別表示與合并的正常組織相比腫瘤中較高和較低的表達水平。從雙向精確的二項檢驗給出未校正的P值；使用本杰明2001程序對全部為0. 05的FDR評價顯著水平。由X軸表示的患者樣本，并按照與每組(panel)相同的順序進行分類。+和-分別代表與正常組織(N)相比，腫瘤(T)中的較高和較低的表達。對于小于I的圖表征T/N值被轉換為倒數(inverse) N/T值。圖2.來自組2 (法國，n=101)的乳房腫瘤中DNA聚合酶基因的相對表達。計算了腫瘤(T)和正常(N)乳房樣本(T/N) mRNA表達比(預先對表達水平相對對照基因進行了正態(tài)化)。T/N>1和〈I分別表示與合并的正常組織相比腫瘤中較高和較低的表達水平。從雙 向精確的二項檢驗給出未校正的P值；使用本杰明2001程序對全部為0. 05的FDR評價顯著水平。由X軸表示的患者樣本，并按照與每組相同的順序進行分類。+和-分別代表與正常組織(N)相比，腫瘤(T)中較高和較低的表達。對于小于I的圖表征T/N值被轉換為倒數N/T值。圖3.腫瘤中相對基因表達的基因與基因的比較。法國人乳房腫瘤中DNA聚合酶表達間的所有配對相關的圖形表示(非參數Spearman’ s相關；(A)組I (n=105) ； (B)組2(n=101))。Spearman rho系數越接近I (由水平和垂直軸相交的紅或黃色區(qū)域表示),認為兩基因的表達間越具有相關性。相反地，rho值小于I (由綠色區(qū)域表示)表示被比較的表達是互相獨立的。圖4. POLQ基因表達水平對患者的癌癥特異性生存的影響。(A)根據原發(fā)腫瘤中DNAP0LQ表達水平的乳癌患者的Kaplan-Meier生存。來自法國人群的患者(n=203,而不是206，3例沒有確定POLQ的樣本被廢棄)。表明來自每次對數秩(log-rank)檢驗的p值。(B)在原發(fā)乳房腫瘤中的POLQ基因表達和陽性淋巴結數目間的配對比較的Kaplan-Meier生存?；颊邅碜苑▏巳?n=203)。給出了對數秩卡方檢驗(X2)和p值。Pq代表P0LQ，Ln代表陽性淋巴結。圖5. POLQ過度表達克隆的細胞內平衡(A)穩(wěn)定地過度表達POLQ的克隆的確認。來自用空載體(CTL2)穩(wěn)定轉染的對照細胞和來自用POLQ cDNA (Q1、Q2和Q3)穩(wěn)定轉染的克隆的細胞提取物(100 ii g)在5%SDS-PAGE上進行分離，電轉移至PVDF膜，使用親和純化的抗POLQ (15)和抗粘著斑蛋白(作為加樣的內對照)抗體通過免疫印跡分析。使用純化的POLQ (50ng)作為大小對照；(B)細胞周期的結果。在用碘化丙啶染色DNA后，通過流式細胞術確定處于細胞周期每一期的細胞數。至少分析3次獨立的實驗。確定平均值和標準誤差，通過學生t檢驗計算p值。圖6.在POLQ過度表達的克隆中ATM-CHK2DNA損傷檢驗點。Y -H2AX (A)和PT68-CHK2 (B)染色陽性的細胞平均數的定量。用UV (10J. m_2)處理的對照(CTL)克隆被作為陽性對照。對于定量，在至少3次獨立的實驗中最少分析100個細胞。確定平均值和標準誤差，通過學生t檢驗計算p值；(C)表示過度表達POLQ (Q1、Q2、Q3)的細胞的共聚焦顯微鏡圖片。圖7.Y-H2AX檢測。收獲250，000個尚未完全匯合(sub-confIuent)的細胞，然
后超聲處理。通過在15%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離總蛋白提取物。將凝膠轉移至Hybond-P 膜上(Amersham, Arlington Heights, IL),用單克隆抗 H2AX 抗體(Upstate, LakePlacid, NY)在4 °C下過夜雜交(probe)。使用辣根過氧化物酶羊抗鼠抗體作為二抗(Sigma, St. Louis, MO)。然后使膜與增強化學發(fā)光試劑(Amersham)孵育。通過用抗肌動蛋白抗體免疫印跡該膜，評價加樣的提取物的等量。圖8. POLQ過度表達的克隆中DNA斷裂和染色體異常。(A)在對照克隆(CTL2和CTL9)和過度表達POLQ (Q1、Q2和Q3)的克隆中定量異常的中期。秋水仙酰胺處理3小時候收集細胞，制備中期涂片(spread)。對于定量,在至少3次獨立的實驗中最少分析100個中期。確定平均值和標準誤差，通過學生t檢驗計算p值；(B)表示來自CTL9和Q3克隆的中期涂片的顯微鏡圖像。箭頭表示染色體異常。圖9.對烷化劑的敏感性。通過克隆分析確定藥物敏感性。POLQ過度表達(Q1、Q2、Q3)細胞和同基因對照(CTL2、CTL5)細胞對甲磺酸甲酯(麗S)和N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)的敏感性。生存被表示為被處理細胞對對照的相對接種效率(relative platingefficiency)。麗S和MNU的劑量以線性標度在x軸上表示，而生存的克隆分數以對數標度在y軸上表示。結果為至少3次獨立的實驗重復兩次的平均值+/-SD。圖10.在過度表達POLQ的細胞中DNA復制叉速度。(A)代表對照細胞或過度表達POLQ細胞中梳(combed)和免疫染色的DNA纖維的圖像；(B)表示分布于對照克隆(CTL2)和兩個過度表達POLQ的克隆(Q2和Q3)中的復制叉速度的直方圖；(C)總長度是對每個克隆研究的所有DNA纖維的Mb總數；“n”是每個克隆中評分的IdU和CldU軌道(track)數。群的中值以kb/min給出。復制叉速度中值的不確定以絕對偏差中值的單位給出。應用Mann-Whitney檢驗比較Q2和Q3數據組與實驗對照，CTL2。圖11. POLQ基因表達水平對患者的p53特異性生存的影響。(A)根據p53基因(野生型對突變的cDNA序列)狀態(tài)，乳癌患者(n=150)的Kaplan-Meier生存。使用對數秩檢驗比較這些生存曲線。該檢驗計算檢驗在兩群體中生存曲線是相同的這一零假設的P值。表明了來自對數秩檢驗的P值。(B)根據POLQ表達水平的患有p53wt腫瘤的乳癌患者(n=84)的Kaplan-Meier生存。使用對數秩檢驗比較這些生存曲線。該檢驗計算檢驗在兩群體中生存曲線是相同的這一零假設的P值。給出P值。
圖12. POLQ基因表達水平對Chk2抑制因子敏感性的作用。(A) MCF7細胞比MDA-MB231細胞表現出對Chk2抑制因子II水合物(Sigma RefC3742)更高的敏感性。在克隆形成分析中確定生存。MCF7 :方形；MDA-MB231 :菱形(B)在MCF7中POLQ的表達量比在MDA-MB231中更高。通過RT-PCR分析基因表達水平。C51是正常乳房細胞系。
具體實施例方式實施例I.材料與方法I. I研究設計、患者和腫瘤樣本，差異的基因表達包括的患者由來自輔助的多中心III期臨床試驗(PACSOI試驗)的患者亞組組成。臨床試驗的結果已在其它地方發(fā)表了(Roch6等人J Clin Oncol 24:5664-5671，2006)。來 自此群的腫瘤樣本(n=206)被分為用于基因分型的兩組(n=101和n=105)。正常乳房組織獲自Claudius Regaud Institute (Toulouse,法國),取自外科標本,其距離乳癌至少3cm。來自該群的患者以及腫瘤的特征如表I所述。表I患者和腫瘤的基線特征
權利要求
1.一種用于從患者的乳癌樣本診斷所述患者中乳癌侵襲性的方法，其包括 a)體外測量所述患者乳癌樣本中POLQ基因和/或一種或多種其同種型的表達水平和對照基因的表達水平， b)計算所述患者乳癌樣本中所述POLQ基因和/或同種型的POLQ和/或一種或多種其同種型的表達水平與所述對照基因的表達的表達水平比， c)比較所述基因表達水平比與相應的閾值，和 d)如果所述比高于其相應的閾值，則診斷乳癌具有侵襲性。
2.權利要求I所述的方法，其中所述患者具有高數量的轉移淋巴結。
3.權利要求I所述的方法，其中所述乳癌表達野生型p53cDNA。
4.一種用于從患者的乳癌樣本診斷所述患者中乳癌遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括 a)體外測量所述患者乳癌樣本中POLQ基因和一種或多種其同種型的表達水平和對照基因的表達水平， b)計算所述患者乳癌樣本中所述POLQ基因和/或同種型的POLQ和/或一種或多種其同種型的表達水平與所述對照基因的表達的表達水平比， c)比較所述基因表達水平比與相應的閾值，和 d)如果所述比高于其相應的閾值，則診斷乳癌為遺傳不穩(wěn)定性。
5.權利要求I至4任一項所述的方法，其中所述的對照基因是管家基因。
6.權利要求5所述的方法，其中所述管家基因是選自B2M、TFRC,YffHAZ, RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS 的基因。
7.權利要求6所述的方法，其中所述的基因是IP08或HMBS。
8.權利要求I至7任一項所述的方法，其中所述的表達水平是在mRNA水平上測量的。
9.權利要求8所述的方法，其中所述的表達水平是使用定量PCR或微陣列技術測量的。
10.權利要求I至9任一項所述的方法，其中所述的表達水平是在蛋白質水平上測量的。
11.權利要求10所述的方法，其中所述的表達水平是使用特異性抗體測量的。
12.權利要求1-11任一項所述的方法，其中所述閾值為15.8。
13.一種包含至多500個探針的微陣列，其中至少一個探針特異地與POLQ雜交。
14.根據權利要求13所述的微陣列，其中至少一個其它探針特異性與選自B2M、TFRC,YWHAZ、RPL0、18S、(；USB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 的基因雜交。
15.根據權利要求14所述的微陣列，其中所述基因是IP08基因或HBMS基因。
16.一種試劑盒，其用于從患者的乳癌樣本中診斷所述患者乳癌侵襲性和/或遺傳不穩(wěn)定性，其包括權利要求13-15任一項的微陣列或POLQ特異性擴增引物。
17.權利要求16所述的試劑盒，其中進一步包括特異于選自B2M、TFRC,YffHAZ, RPLO,18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS 的基因的擴增引物。
18.權利要求17的試劑盒，其中所述基因是IP08基因或HBMS基因。
19.一種選擇患者中乳癌的適當的治療的方法，其包括 a)使用權利要求1-3任一項的方法診斷所述患者中所述乳癌是或不是侵襲性，和b)如果所述乳癌在步驟a)中診斷為侵襲性，則在外科治療中增加輔助的輻射療法或化學療法。
20.一種用于預后輻射療法或DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝抑制因子在患者乳癌治療中效率的方法，其包括 a)使用權利要求4的方法診斷所述患者的所述乳癌是或不是遺傳不穩(wěn)定性，和 b)如果在步驟a)中診斷為遺傳不穩(wěn)定性，則預后輻射療法或DNA修復抑制因子的效率。
21.一種用于分離能夠抑制DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝的新的化合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)使化合物與過度表達POLQ的細胞或不過度表達POLQ的細胞接觸，和 b)分析是否所述化合物對POLQ過度表達細胞活力的影響多于其對不過度表達POLQ細胞的活力的影響。
22.—種或多種DNA修復、DNA損傷信號或核苷酸代謝抑制因子在制備藥物中的用途，其中所述藥物預期用于治療其乳房腫瘤過度表達POLQ的患者的乳癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從患者的乳癌樣本診斷所述患者中乳癌侵襲性和/或遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括a)體外測量所述患者乳癌樣本中POLQ基因的表達水平和對照基因的表達水平；b)計算所述患者乳癌樣本中所述POLQ基因的POLQ的表達水平與所述對照基因的表達的表達水平比；c)比較所述POLQ表達水平比與相應的閾值，和d)如果所述POLQ表達水平比高于相應的閾值，則診斷乳癌為侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性。本發(fā)明還描述了專用的微陣列和試劑盒，以及選擇適當的治療的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102791879SQ201080056532
公開日2012年11月21日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2009年11月13日
發(fā)明者A·馬沙多達西爾瓦, C·卡佐, H·羅什, J-C·布爾東, J-S·霍夫曼 申請人:克勞迪烏斯勒戈研究所, 國立保爾·薩巴梯埃-圖盧茲第三大學, 法國國家科學研究中心