羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，屬于水 產(chǎn)生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae)也稱B群鏈球菌（GBS)，是一類廣泛存 在于自然界的革蘭氏陽(yáng)性菌，宿主范圍廣，對(duì)哺乳類、爬行類、兩棲類及魚(yú)類均可造成危害。 1958年在日本養(yǎng)殖虹鱒（Oncorhychusmikiss)中首次發(fā)現(xiàn)了鏈球菌病，其后魚(yú)類鏈球菌 病的報(bào)道逐漸增多。2009年以來(lái)，該病在我國(guó)多流行于養(yǎng)殖的羅非魚(yú)，其感染性強(qiáng)，死亡率 高，治療困難，如何在感染早期快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌成為研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 目前羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括常規(guī)的生化檢測(cè)法，血清學(xué)檢測(cè)法和 分子生物學(xué)檢測(cè)法。常規(guī)生化檢測(cè)主要建立在生物化學(xué)中的快速專有酶反應(yīng)和細(xì)菌代謝產(chǎn) 物的檢測(cè)技術(shù)，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，對(duì)無(wú)乳鏈球菌早期快速批量篩查有一定的局限 性；血清學(xué)檢測(cè)方法，其方法簡(jiǎn)便、快捷，但不能完全排除假陰性結(jié)果；分子生物學(xué)檢測(cè)，實(shí) 驗(yàn)條件要求高，容易受到種種檢測(cè)條件的影響，難以普及推廣。LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)，簡(jiǎn)便 快速、靈敏度高，所需儀器也較簡(jiǎn)單，但對(duì)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境及人員操作要求相對(duì)較高，可能 受人為誤差因素影響，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
[0004] 因此現(xiàn)有無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展，以滿足不同階層工作人員的 需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種羅非魚(yú)無(wú)乳鏈 球菌的探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，旨在解決現(xiàn)有的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、條件高、易 受認(rèn)為誤差因素影響的問(wèn)題。本發(fā)明所提供的試劑盒利用特異性地高辛核酸片段探針，能 同時(shí)鑒別性的檢測(cè)大量樣品中的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌。通過(guò)對(duì)病料組織樣品DNA提取物或細(xì) 菌樣品的煮沸后的上清液進(jìn)行斑點(diǎn)分子雜交，特異的檢測(cè)樣品中的無(wú)乳鏈球菌。
[0006]本發(fā)明所涉及的試劑盒是利用羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌cfb片段（序列1)為模板，用特 定引物（序列2和3)通過(guò)PCR合成了地高辛標(biāo)記（Digoxiaenin，DIG)的探針。通過(guò)斑點(diǎn) 雜交，這些探針（Digoxigenin-labelledcfbprobe)可用于檢測(cè)病料樣品或菌株煮沸后的 上清液中無(wú)乳鏈球菌特異性核酸的存在，用于判定是否有無(wú)乳鏈球菌感染。利用這一方法， 在1張8x8cm大小的尼龍膜上可同時(shí)檢測(cè)約80份病料或菌株的核酸樣品。并可在16h? 24h內(nèi)完成檢測(cè)并報(bào)告結(jié)果。
[0007]本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0008](一）無(wú)乳鏈球菌地高辛標(biāo)記探針的制備及驗(yàn)證
[0009] 1?無(wú)乳鏈球菌cfb片段（序列1)的擴(kuò)增（用作非標(biāo)記的對(duì)照DNA)
[0010] 模板：無(wú)乳鏈球菌菌株pEASY'_-T3-cfb克隆質(zhì)粒（本發(fā)明人制備和測(cè)序并保 存），PCR反應(yīng)體系如下：10xPCRbuffer(Mg+)，5yL;dNTPstocksolution(2mmol/L each), 5yL；Forwardprimer(10ymol/L)(序列 2)，5yL;Reverseprimer(10ymol/L) (序列 3)，5yL;Enzymemix(3. 5U/yL)，0? 75yL;DNA模板，1yL;ddH20, 28. 25yL。將上 述成分加入滅菌的PCR管中，混合均勻后，離心后置于PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C，5min; 94°C，30S，57°C，30s，72°C，lmin，32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin;4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 2.無(wú)乳鏈球菌cfb片段（序列1)PCR法制備地高辛標(biāo)記探針
[0012] 以上pEASY'.-T3-cfb質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：10xPCR buffer(Mg+), 5yL；PCRDIGProbeSynthesismixture, 5yL；Forwardprimer(10ymol/ L)(序列 2)，5yL;Reverseprimer(10ymol/L)(序列 3)，5yL;Enzymemix(3. 5U/yL)， 0? 75yL;pEASYk-T3-cfb質(zhì)粒DNA，1yL;ddH20,28. 25yL。將上述成分加入滅菌的PCR管 中，混合均勾，離心后置于PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C，5min;94°C，30S，57°C，30s，72°C，lmin，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin;4°C保存?zhèn)溆谩?. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并測(cè)序驗(yàn)證。
[0013] (以上模板用質(zhì)粒DNA濃度，PCR終濃度要求為10pg?100pg;若用基因組DNA， PCR體系終濃度為lng?50ng)
[0014] (二）試劑盒組成
[0015] 1.探針
[0016] 試劑1 :地高辛標(biāo)記的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌cfb片段（序列1)探針，lyg/yL， 10yL?50yL/瓶。序列1 (471堿基）：
[0017] CAGTAATCAAGCCCAGCAAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAATATCAAA GATAATGTTCAGGGAACAGATTATGAAAAACCGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGAAAAATTAAAGACTTCA TTGCGTGCCAACCCTGAGACAGTTTATGATTTGAATTCTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCCTTAACAGATGTGATT GAAGCAATCACTTTTTCAACTCAACATTTAGCAAATAAGGTTAGTCAAGCAAATATTGATATGGGATTTGGGATA ACTAAGCTAGTTATTCGCATTTTAGATCCATTTGCTTCAGTTGATTCAATTAAAGCTCAAGTTAACGATGTAAAG GCATTAGAACAAAAGGTTTTAACTTATCCTGATTTAAAACCAACTGATAGAGCTACCATCTATACAAAATCAAAA CTTGATAAGGAAATCTGGAATACACGCTT
[0018] 2.未標(biāo)記的cfb片段對(duì)照DNA
[0019] 試劑2 :羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌cfb片段（471堿基的序列1)PCR擴(kuò)增的DNA，10pg/yL， 50yL/ 瓶。
[0020] 3.PCR引物
[0021] 試劑3 :羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌特異性正向引物，5' -AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3'（序 列2);
[0022] 試劑4 :羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌特異性反向引物，5' -CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3'（序列 3) 〇
[0023] 4.尼龍膜8cmx8cm，20?100片（可根據(jù)樣品多少，裁剪適合大小使用）
[0024] 5?其他試劑
[0025] 試劑5 :封閉試劑（購(gòu)自Roche公司，Cat.No. 10%176,lg/瓶）
[0026] 試劑6 :堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（購(gòu)自Roche公司，10yL/瓶， anti-Digoxigenin-ApConjugate,Cat.No1093274)
[0027] 試劑7 :堿性磷酸酶發(fā)光底物（CSPDready-to-use)(購(gòu)自Roche公司，Cat-No. 11755633001，lOOmL) 。
[0028]試劑 8 :雜交液顆粒（購(gòu)自Roche公司，DIGEasyHybGranules，Cat. No.11796895001)
[0029] 6.自備試劑及耗材
[0030] 20XSSC溶液（3MNacl，0.03枸櫞酸三鈉，調(diào)整pH至7.0)，可封口塑料袋，尖頭一 次性滴頭，洗滌緩沖液（〇. 1M馬來(lái)酸，0. 15MNaCl;pH7. 5 ;0. 3%v/v吐溫20)，馬來(lái)酸緩沖 液（0? 1M馬來(lái)酸，0? 15MNaCl，pH7. 5)，檢測(cè)緩沖液（0? 1MTris-HCl，0. 1MNaCl，pH9. 5)， 10XSDS溶液。
[0031] 7?設(shè)備
[0032] 水浴鍋，壓模機(jī)，5yL、100yL移液器。
[0033](二）試劑盒的操作方法：
[0034] 1.核酸樣品的制備：
[0035] (1)上清液核酸樣品：取2?5個(gè)待檢測(cè)菌株菌落或lmL菌液離心后的沉淀菌株， 溶于100yL無(wú)菌水，100°C水浴15min，立即冰浴3min，稍離心，取上清備用。
[0036] (2)病料核酸樣品：取發(fā)病羅非魚(yú)待檢組織腦或肝臟，利用基因組提取試劑盒 DNeasyblood&TissueKit提取基因組，保存?zhèn)溆?；必要時(shí)也可以基因組為模板，利用引物 2和3對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)體系：；擴(kuò)增程序：94°C，5min;94°C，30S，57°C，30s， 72°C，lmin，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min;)，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)凝膠需電泳確認(rèn)，可直接保存?zhèn)溆谩?br>[0037]2.雜交及免疫檢測(cè)：
[0038] (1)取2UL核酸樣品（上述上清液或基因組或PCR產(chǎn)物），點(diǎn)樣于適當(dāng)大小的尼 龍膜上（尼龍膜劃好格子，長(zhǎng)和寬做好標(biāo)記）。
[0039] (2)在2xSSC中簡(jiǎn)單洗膜，120°下烘烤尼龍膜30min。（可保存于4°C)
[0040] (3)將上述轉(zhuǎn)膜好的尼龍膜（點(diǎn)樣面朝上）放入適量體積的DIGEasyHyb緩沖液 (事先預(yù)熱至40°C)，溫和震蕩30min，進(jìn)行預(yù)雜交。
[0041] (4)取適量地高辛標(biāo)記的DNA探針，沸水浴中變性5min，后立即置于冰上冷切。將 變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的DIGEasyHyb緩沖液中，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。 (雜交液中探針終濃度約為25ng/mL)
[0042] (5)倒出（3)中預(yù)雜交液，在膜上加入⑷中的探針雜交液，40°C溫和震蕩孵育至 過(guò)夜。
[0043] (6)用足量的2XSSC，0. 1%XSDS在室溫（15°C?25°C)連續(xù)振蕩洗膜兩次，每 次 5min〇
[0044] (7)用足量的0?5XSSC，0. 1%XSDS(預(yù)熱到洗滌溫度）