檢測(cè)花生fad2基因snp等位變異的引物、探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)花生FAD2基因SNP等位變異的引物、探針及方法，屬于分子 生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是重要的油料作物，其籽粒脂肪酸的組成是衡量花生品質(zhì)的重要指標(biāo)。從油 脂穩(wěn)定性角度看，高油酸/亞油酸比值（0/L比）的花生及其制品不易氧化和腐敗，貨架 期較長(zhǎng)。有研究表明烘焙后的高油酸花生較普通油酸含量花生貯存期延長(zhǎng)8倍（Mozingo etal.，2004);而高油酸花生壓榨的花生油較普通油酸含量品種貯藏期延長(zhǎng)高達(dá)14倍 (O'Keefeetal.，1993)。從對(duì)人體健康角度考慮，油酸有益于維持有益膽固醇高密度脂 蛋白（HDL)水平，增強(qiáng)胰島素敏感性，還可以改善一些炎癥（MesaGarciaetal.，2006; Vassiliouetal.，2009)。為了提高油脂的穩(wěn)定性，工業(yè)上常通過(guò)加氫提高油脂的飽和度， 這往往在碳鏈中引入反式雙鍵生成反式脂肪酸，長(zhǎng)期食用會(huì)大大增加罹患心腦血管病的幾 率。因此，提高花生籽粒的油酸含量和0/L比值是花生油脂遺傳改良的主要目標(biāo)。
[0003]FAD2是控制植物籽粒油酸、亞油酸含量的關(guān)鍵酶，它催化油酸在碳12位去飽和產(chǎn) 生亞油酸。花生是異源四倍體（2n= 4X= 40)，AhFAD2A和AhFAD2B是位于不同基因組上的 非等位基因，這兩個(gè)基因?qū)τ退?、亞油酸含量均有貢獻(xiàn)，只有這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或酶 活降低，籽粒才表現(xiàn)出高油酸性狀。美國(guó)上世紀(jì)80年代通過(guò)化學(xué)誘變和自然突變篩選獲得 的一些高油酸突變體（如F435,8-2122,M2-225,MF)(Nordenetal.，1987 ;Ashri, 1988)， 一直作為親本沿用至今。這些品種或品系籽粒油酸含量都在80%左右。分析F435及其衍 生系高油酸性狀的遺傳基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，AhFAD2A基因編碼區(qū)448nt處核苷酸序列由G-A的堿基 替代，編碼的氨基酸由天冬氨酸D變?yōu)樘於０種，AhFAD2A酶活性大幅降低；同時(shí)AhFAD2B 基因編碼區(qū)442nt處1個(gè)A堿基插入，導(dǎo)致編碼蛋白提前終止。針對(duì)上述突變體及衍生系 AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP差異，近年來(lái)開(kāi)發(fā)了多種用于檢測(cè)的標(biāo)記和檢測(cè)方法，如 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法（CAPS,cleavedamplifiedpolymorphicsequence)、等位基因特 異PCR(AS-PCR，Allele-SpecificPCR)、測(cè)序法和熒光定量PCR法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高油酸花 生育種進(jìn)行輔助選擇（Jungetal.，2000a;Chuetal.，2007;Chuetal.，2009;Chenet al.，2010)。我國(guó)目前也培育出了幾個(gè)高油酸花生品種，如山東花生研究所的培育的花育 32 (2009年山東省審定）、花育51和花育52,河南省開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院開(kāi)農(nóng)H03-3、開(kāi) 農(nóng)61、開(kāi)農(nóng)176、開(kāi)17-15,河北省冀花11號(hào)、13號(hào)等。這些品種與突變體F435AhFAD2A基 因在448nt處以及AhFAD2B基因在442nt處的突變位點(diǎn)相同?？梢允褂孟嗤臉?biāo)記和檢測(cè) 方法檢測(cè)。
[0004]CAPS技術(shù)又稱(chēng)為PCR-RFLP，基本原理是利用己知的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特 異性的PCR引物（19-27bp)，然后擴(kuò)增特異的目的DNA片段，接著用一種專(zhuān)一性的限制性?xún)?nèi) 切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。CAPS標(biāo)記揭示 的是特異PCR片段的限制性長(zhǎng)度變異的信息。AhFAD2A未突變基因中存在的1個(gè)Hpy991 酶切位點(diǎn)（5'CQACG3')，由于448ntG-A的突變?cè)撁盖形稽c(diǎn)消失；而AhFAD2B基因 的442ntA堿基的插入突變則在突變基因中導(dǎo)致多出了一個(gè)Hpyl88I酶切位點(diǎn)識(shí)別位 點(diǎn)（5'TCAGA3')，進(jìn)行酶切檢測(cè)時(shí)突變和未突變AhFAD2A和AhFAD2B基因酶切圖譜具 有明顯不同。該方法因?yàn)樾枰?jīng)過(guò)片段擴(kuò)增、限制性?xún)?nèi)切酶酶切、凝膠電泳檢測(cè)等步驟， 過(guò)程繁瑣、成本較高，并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性要求高。AS-PCR方法的基本原理是根據(jù)基因 上的等位變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)目的片段特異擴(kuò)增引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè) 分析。差異往往通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小差異、有或無(wú)來(lái)判斷。為了檢測(cè)AhFAD2A和AhFAD2B 基因的等位差異，Chen等（2010)設(shè)計(jì)了 5條引物，1條正向引物F435-F和4條反向引物 F435IC-R、F435WT-R、F435SUB-R、F435INS-R，分別用于PCR擴(kuò)增的質(zhì)量控制和擴(kuò)增非突變 基因、AhFAD2A基因448nt堿基替換及AhFAD2B基因A堿基插入。該方法由于檢測(cè)的多為 SNP差異，要求提取DNA質(zhì)量較好，且需控制較為嚴(yán)格的擴(kuò)增條件；但檢測(cè)結(jié)果常常出現(xiàn)偏 差，需多次重復(fù)。針對(duì)這兩個(gè)基因人們還直接采用測(cè)序的方法進(jìn)行檢測(cè)，這一方法不僅成本 高，而且由于AhFAD2A和AhFAD2B基因ORF區(qū)序列相似度極高，因此很難設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異 擴(kuò)增，嚴(yán)格區(qū)分兩基因。特別是AhFAD2A448位的G/A，在AhFAD2B基因?yàn)楸Ｊ氐腉，難以區(qū) 分AhFAD2A為純合的AA還是雜合的G/A狀態(tài)。
[0005] 隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)不斷應(yīng)用于SNP標(biāo) 記的檢測(cè)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)可分為2類(lèi)：一類(lèi)為熒光染料SYBRGreen檢測(cè)法；另一 類(lèi)為T(mén)aqMan探針?lè)?。Barkley等（2010)設(shè)計(jì)了針對(duì)AhFAD2B基因的442ntA堿基的插入 或缺失的TaqMan-MGB探針以區(qū)分該位點(diǎn)插入、缺失或呈雜合。該研究設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物在 AhFAD2A和AhFAD2B基因中沒(méi)有序列差異，僅靠探針5 '端存在的1個(gè)A/C堿基差異區(qū)分 AhFAD2A和AhFAD2B基因；并且對(duì)于AhFAD2A的等位差異還需其他方法進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)花生FAD2基因SNP等位變異的引物、 探針及方法。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了AhFAD2A和AhFAD2B基因的特異性擴(kuò)增引物及針對(duì)這兩個(gè) 基因野生型和突變型的TaqMan探針，并建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種用于檢測(cè)AhFAD2A基因448位G/A差異的引物，該引物為一對(duì)，核苷酸序列如 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0009] 序列表中SEQIDNo.1由20個(gè)堿基組成，該序列為AhFAD2A基因0RF區(qū)自Y端 413-432位堿基序列；SEQIDNo.2由20個(gè)堿基組成，該序列為AhFAD2A基因0RF區(qū)自5' 端528-547位堿基的反向互補(bǔ)序列；擴(kuò)增長(zhǎng)度為135bp。
[0010] 一種用于檢測(cè)AhFAD2A基因448位A堿基的TaqMan探針1，該TaqMan探針1由一 段22個(gè)堿基組成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的TAMRA發(fā)光基團(tuán)及位于核苷酸序 列3'端的BHQ2熒光淬滅基團(tuán)組成，核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0011] 序列表中SEQ ID No. 3由22個(gè)堿基組成，該序列為AhFAD2A基因0RF區(qū)自5'端 436-457位堿基序列。
[0012] 一種用于檢測(cè)AhFAD2A基因448位G堿基的TaqMan探針2,該TaqMan探針2由一 段23個(gè)堿基組成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的CY5發(fā)光基團(tuán)及位于核苷酸序列 3'端的BHQ2熒光淬滅基團(tuán)組成，核苷酸序列如SEQIDNo. 4序列。
[0013] 序列表中SEQIDNo. 4由23個(gè)堿基組成，該序列為AhFAD2A基因0RF區(qū)自5'端 435-457位堿基序列。
[0014] -種用于檢測(cè)AhFAD2B基因442位A堿基插入或缺失的引物，該引物為一對(duì)，核苷 酸序列如SEQIDNo. 5和SEQIDNo.