Aldh2基因的檢測引物組、其構(gòu)成的反應(yīng)體系及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ALDH2基因的檢測引物組、其構(gòu)成 的反應(yīng)體系及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一類催化人體內(nèi)乙醛和其 他脂肪族醛氧化反應(yīng)的重要酶類。ALDH家族共有19種同工酶，其中ALDH1-ALDH4為主要常 見的4種，其中ALDHl和ALDH2主要在人體肝臟內(nèi)發(fā)揮功能，并且只有ALDH2分布在線粒體 中，且編碼基因具有遺傳多態(tài)性。
[0003] 研究表明，ALDH2具有乙醛脫氫酶和酯酶活性，是人體代謝所攝入乙醇的主要功能 酶，同時(shí)也是臨床藥物硝酸甘油的主要代謝酶類。因此，ALDH2編碼基因的遺傳多態(tài)性對 于乙醇和硝酸甘油的代謝具有十分重要的影響。ALDH2基因位于人類第12號染色體上，在 該基因片段上發(fā)現(xiàn)的單核苷酸酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP)已有上百個(gè)，其中ALDH2*2(Glu504Lys， rs671)可導(dǎo)致ALDH2基因功能缺失并失去酶活性。在人體乙醇代謝過程中，突變型基因 ALDH2*2的存在可引起ALDH酶活性的大幅降低，嚴(yán)重阻礙乙醇在體內(nèi)的代謝進(jìn)程，導(dǎo)致大 量乙醛在人體內(nèi)蓄積，從而導(dǎo)致肝損傷的出現(xiàn)；因此，CFDA頒布的《藥物代謝酶和藥物作用 靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南（試行）》指出"攜帶ALDH2*2等位基因的心絞痛患者盡可能改用其 他急救藥物，避免硝酸甘油舌下含服無效。"
[0004] 另外有研究結(jié)果顯示，與歐美及其它國家地區(qū)人群相比，亞洲人群攜帶ALDH突變 型基因的頻率相對較高，約為35% -40%。因此，在亞洲國家和地區(qū)開展ALDH基因多態(tài)性 檢測，對于預(yù)防乙醇代謝障礙造成的肝損傷以及硝酸甘油的臨床用藥指導(dǎo)，具有很重要的 現(xiàn)實(shí)意義。
[0005] 目前，市場是針對ALDH突變型基因的檢測技術(shù)手段主要包括基因芯片法、一代測 序法、熒光定量PCR法等。其中，基因芯片法技術(shù)步驟繁瑣，樣本處理時(shí)間較長，大批量處理 操作困難，單次檢測成本高，還需要購置額外的檢測設(shè)備；一代測序法同樣存在成本高和操 作復(fù)雜、檢測周期長等不利因素；而熒光定量PCR則存在臨床檢測假陽性率較高等缺點(diǎn)。CN 104894256 A公開了一種檢測乙醛脫氫酶2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)的引物、試劑盒及其PCR 方法，其中包括：野生型特異性上游引物、突變型特異性上游引物和野生型特異性上游引物 與突變型特異性上游引物共用的下游引物。然而，從目前來看，這種方法仍然需要通過變溫 PCR技術(shù)，過程復(fù)雜，檢測耗時(shí)長。因此，開發(fā)一種成本較低，操作簡易且檢測效率高，利于臨 床大范圍普及推廣的試劑盒，對于ALDH基因多態(tài)性檢測具有十分重要的意義。
[0006] 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)是日本科學(xué)家于2000年提出的一種等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)，其主要特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生IO9-IOlti數(shù)量級的產(chǎn)物。具 有敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結(jié)果易于判定的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種ALDH2基因的檢測引物組、其構(gòu)成的 反應(yīng)體系及應(yīng)用，所述檢測引物組具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供一種ALDH2基因的檢測引物組，所述檢測引物組如下：
[0010] 正向外側(cè)引物 F3 :SEQ ID N0:1 :CGGGAGTTGGGCGAGTAC ;
[0011] 反向外側(cè)引物 B3 :SEQ ID N0:2 :AGCAGGTCCTGAACTTCCA ;
[0012] 正向內(nèi)側(cè)引物 FIP :SEQ ID NO: 3 :CAAGCCCCAACAGGCCCTGGGGCTGCAGGCATACAATA ;
[0013] 反向內(nèi)側(cè)引物 BIP :SEQ ID N0:4 :TCGGAGCCTGCTGGGGGATTGCAGGTCCTGAACCTCTGG。
[0014] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:3所示的序列是用于檢測ALDH2*2的特異性引物。
[0015] 本發(fā)明中，4條引物的外側(cè)引物記為正向外側(cè)引物F3和反向外側(cè)引物B3，內(nèi)側(cè)引 物記為正向內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包含了 Flc和F2, BIP包含了 Blc 和B2。本發(fā)明在普通LAMP的基礎(chǔ)上，針對ALDH2*2特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異引物，特異 引物位于F2的3'端，同時(shí)為進(jìn)一步加強(qiáng)引物的特異性，在F2的3'端倒數(shù)第三位再引進(jìn)一 個(gè)突變，進(jìn)一步降低非特異性擴(kuò)增的可能性。
[0016] 第二方面，本發(fā)明提供一種檢測ALDH2基因的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括如第 一方面所述的引物組，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍(lán)，甜菜堿，Bst DNA聚合酶，待檢樣品 基因組DNA和去離子水。
[0017] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括 Tris-HCl，KC1，（NH4)2SO4, MgSOjP Tween-20。
[0018] 優(yōu)選地，所述 Tris-HCl 的濃度為 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM 或 30mM，優(yōu)選為 15-25mM，進(jìn)一步優(yōu)選 為 20mM。
[0019] 優(yōu)選地，所述 KCl 的濃度為 10-60mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM 或 60mM，優(yōu)選 為50-55mM，進(jìn)一步優(yōu)選為50mM。
[0020] 優(yōu)選地，所述（順4)#04的濃度為5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、 10禮、111111、121111或131111，優(yōu)選為8-121111，進(jìn)一步優(yōu)選為1〇1111。
[0021] 優(yōu)選地，所述MgSOj^濃度為2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或 8mM，優(yōu)選為3_6mM，進(jìn)一步優(yōu)選為4mM。
[0022] 優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分?jǐn)?shù)為0. 1-1%，例如可以是0. 1%、0. 2%、0. 3%、 0· 4%、0· 5%、0· 6%、0· 7%、0· 8%、0· 9%或 1%，優(yōu)選為 0· 1%。
[0023] 優(yōu)選地，所述 dNTPs 的濃度為 l-2mM，例如可以是 lmM、l. lmM、l. 2mM、l. 3mM、l. 4mM、 I. 5mM、I. 6mM、I. 7mM、I. 8mM、I. 9mM 或 2mM，優(yōu)選為 I. 2-1. 8mM，進(jìn)一步優(yōu)選為 I. 4mM。
[0024] 優(yōu)選地，所述羥基萘酚藍(lán)的濃度為108-130 μΜ，例如可以是108 μΜ、109μΜ、 110 μ M、111 μ Μ、112 μ Μ、115 μ Μ、116 μ Μ、118 μ Μ、120 μ Μ、122 μ Μ、125 μ Μ、126 μ Μ、128 μ M 或130 μ Μ，優(yōu)選為115-123 μ Μ，進(jìn)一步優(yōu)選為120 μ Μ。
[0025] 優(yōu)選地，所述甜菜堿的濃度為0. 3-1. 2Μ，例如可以是0. 3Μ、0. 4Μ、0. 6Μ、0. 8Μ、1Μ或 I. 2Μ，優(yōu)選為0. 5-1Μ，進(jìn)一步優(yōu)選為1Μ。
[0026] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中每25 μ L反應(yīng)體系含有以下組分：
[0027] 緩沖液：
[0028] Trxs-MCI 2ΘιηΜ KCl 50 mM
[0029] (NH4)2SO4 IOmM MgSO4 4 mM Tween-20 0.1% (體積分?jǐn)?shù)) dNTPs 1.4 mM 羥基萘酚藍(lán) LO μΜ 甜菜堿 IM F3 0.4 μ.Μ B3 0.4 uM ( FIP 1.6 μΜ BiP 1.6 μΜ Bst DNA聚合酶 8 U ?寺檢測樣品基因組 0.8-4 ng/pL 上離T水加至25 μ U
[0030] 第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的反應(yīng)體系的使用方法，所述方法包 括如下步驟：
[0031] 將反應(yīng)體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后升溫進(jìn)行 滅活處理，再根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果。
[0032] 優(yōu)選地，所述恒溫水浴鍋的溫度為55-70 °C，例如可以是55 °C、56°C、57 °C、58 °C、 59 °C、60 °C、61°C、62 °C、63 °C、64°C、65 °C、68 °C、69 °C 或 70 °C，優(yōu)選為 58-65 °C，進(jìn)一步優(yōu)選 為 63°C。
[0033] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時(shí)間為15_90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min 或 90min，優(yōu) 選為55_62min，進(jìn)一步優(yōu)選為60min。
[0034] 優(yōu)選地，所述升溫后的溫度為78-90°C，例如可以是78°C、79°C、80°C、81 °C、82°C、 83 °C、84°C、85 °C、86 °C、87 °C、88 °C、89 °C 或 90 °C，優(yōu)選為 80-85 °C，進(jìn)一步優(yōu)選為 80 °C。
[0035] 優(yōu)選地，所述升溫后的反應(yīng)時(shí)間為15_30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28min 或 30min，優(yōu)選為 18_26min，進(jìn)一步優(yōu)選為 20min〇
[0036] 優(yōu)選地，所述根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果為：
[0037] 所述反應(yīng)體系為天藍(lán)色，則攜帶ALDH2*2基因；
[0038] 所述反應(yīng)體系為紫羅蘭，則未攜帶ALDH2*2基因。
[0039] 第四方面，本發(fā)明提供一種檢測ALDH2基因的檢測試劑盒，所述試劑盒包含如第 二方面所述的反應(yīng)體系。
[0040] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：<