用于檢測人類cyp2e1基因分型的引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測人類CYP2E1基因分型的試劑 盒（PCR-SSP 法)。
【背景技術(shù)】
[0002] 人的CYP2E1的相對分子質(zhì)量為56900,主要分布在成人肝臟，并且富集于肝小葉 中心區(qū)域。CYP2E1基因位于第10號染色體上，其大小為11. 4 kb，有9個外顯子和一個典型 的TATA盒子。CYP2E1的基因多態(tài)性導(dǎo)致了藥物代謝的個體差異，CYP2E1的活性在人群中 呈正態(tài)分布，而不像CYP2D6和CYP2C19那樣呈多態(tài)性分布。中國人中主要有兩種突變體， CYP2E1*2和CYP2E1*3。CYP2E1*2是由于外顯子2上第1168位的G - A突變引起氨基酸第 76位由Arg(R)變?yōu)镠is (H)，導(dǎo)致酶活性的降低。而CYP2E1*3則是由于cDNA第10059位的 G - A突變引起氨基酸第389位Val (V)變成lie (I)，但酶活性并無明顯改變。CYP2E1*1C含 有6個重復(fù)序列，罕見的CYP2E1*1D具有8個重復(fù)序列，西方人群中僅為1%，而中國人中則 為23%。研宄發(fā)現(xiàn)在酒精和尼古丁依賴者中，CYP2E1*1D的突變頻率要更高。CYP2E1是一類 具有較高個體差異、毒理學(xué)上非常重要的酶，它不僅參與了藥物的代謝，還能催化許多前致 癌物和前毒物的活化過程。CYP2E1的底物多達(dá)75種，主要有氯唑沙宗、乙醇、醋氨酚、茶堿、 氨苯砜、吸入性的含氟麻醉藥（氟烷、甲氧氟烷、異氟烷等），還有各種工業(yè)和家庭常用的化 學(xué)溶劑與環(huán)境污染物。CYP2E1的探針底物有3種：對位硝基酚（para-nitrophenol，P-NP)、 N-亞硝基雙甲胺（N-nitrosodimethylamine，ND-MA)和氯挫沙宗。它們都可以用于體外試 驗，其中前兩者對人體有害只用于體外研宄。氯唑沙宗為中樞性肌松藥，低劑量對人體無 毒。它主要在肝臟經(jīng)6-羥化代謝生成6-羥氯唑沙宗，該代謝途徑主要由CYP2E1催化，所 以可以作為CYP2E1的探針?biāo)幬锊⒎从称浠钚?，是目前唯一對人體無損害的CYP2E1體內(nèi)探 藥。影響CYP2E1活性的因素很多，已經(jīng)明確可以誘導(dǎo)CYP2E1的物質(zhì)有：乙醇、丙酮、吡啶、 咪唑和異煙肼等，主要通過減少CYP2E1的降解和代謝，延長其作用而起誘導(dǎo)作用。能抑制 CYP2E1的物質(zhì)有：氫辣椒素、異硫氫酸苯乙酯、二乙基二硫代氨基甲酸鹽、戒酒硫、氯甲噻 唑等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是：克服血清學(xué)檢測試劑的價格昂貴，試劑不好購買等不足，提供一 種用于檢測CYP2E1基因分型的引物組。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、簡便、快速的用于檢測 CYP2E1基因分型的試劑盒。
[0005] -種用于檢測人類CYP2E1基因的引物組，其特征是包括CYP2E1*1引物對， CYP2E1*5引物對及內(nèi)參引物對。
[0006] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0007] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0008] -種用于檢測人類CYP2E1基因的試劑盒，其特征是包括包被有CYP2E1*1引物對， CYP2E1*5引物對，及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer。
[0009] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0010] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
【附圖說明】
[0011] 圖1為人類CYP2E1基因特異引物孔位圖。
[0012] 圖2為實驗結(jié)果陰陽性判讀圖。
[0013] 圖3人類CYP2E1基因測定結(jié)果分型讀板紙。
[0014] 圖4人類CYP2E1基因測定試劑盒電泳結(jié)果膠圖。 具體實施方案
[0015] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0016] 實施例1。
[0017] 依據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫（NCBI Gene Bank)公開的CYP2E1等位 基因序列，設(shè)計出用于檢測人類CYP2E1基因的引物組，該引物組包括CYP2E1*1引物對， CYP2E1*5引物對及內(nèi)參引物對。
[0018] 實施例2。
[0019] 一種用于檢測人類CYP2E1基因的試劑盒，包括包被有CYP2E1 * 1引物對，CYP2E1 *5 引物對，及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buf f er。
[0020] 用于檢測人類CYP2E1基因的試劑盒的制備方法是。
[0021] 1.據(jù)人類CYP2E1基因特異引物孔位圖（見圖1)，分別將CYP2E1*1引物對， CYP2E1 *5引物對及內(nèi)參引物對包被至引物板的相應(yīng)位置上，干燥處理。
[0022] 2.依據(jù)配220mM dNTP、3. 5mM Mg2+、500mM KCUlOOmM Tris-HCL、1% TritonX-IOO 制備出 440 μ I 濃縮 dNTP-Buffer。
[0023] 3.包被有引物對的引物板每人份檢測包括2孔特異性引物孔，濃縮dNTP-Buffer 組成一種用于檢測人類CYP2E1基因的試劑盒。
[0024] 實施例3。
[0025] 使用操作流程。
[0026] -、2. 5%瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備。
[0027] L將加入2. 5g瓊脂糖加入100ml IXTBE溶液（Tris-硼酸鹽-EDTA溶液)，加熱 直到形成均勻的凝膠溶液。再加入適量電泳染色劑，混合均勻。
[0028] 2.將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳。前后水平 移動凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻。
[0029] 3.待凝膠完全凝固后，豎直拔出電泳梳。
[0030] 二、PCR循環(huán)參數(shù)見表1。
[0031] 表1擴(kuò)增參數(shù)特征表。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測人類CYP2E1基因分型的引物組，其特征是包括CYP2E1*1引物對， CYP2E1*5引物對及內(nèi)參引物對； 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383.I:6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列； 所述CYP2E1*5的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383. 1:6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.3、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列。
2. -種用于檢測人類CYP2E1基因分型的的試劑盒，其特征是包括包被有CYP2E1*1引 物對，CYP2E1*5引物對，及內(nèi)參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer; 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383.I:6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列； 所述CYP2E1*5的上、下游引物位于CYP2E1的DNA參考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383. 1:6414-66434位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.3、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測CYP2E1基因分型的引物組及試劑盒。用于檢測CYP2E1基因分型的引物組包括CYP2E1*1引物對，CYP2E1*5引物對及內(nèi)參引物對。本發(fā)明的試劑盒的應(yīng)用實現(xiàn)了對CYP2E1基因的良好分型，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床參考價值。在臨床應(yīng)用中，對實現(xiàn)個體化使用特定藥物和安全使用特定藥物具有很好的指導(dǎo)作用。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104726588
【申請?zhí)枴緾N201510127339
【發(fā)明人】趙衛(wèi)軍
【申請人】天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月24日