可用于檢測(cè)與大腸癌相關(guān)的cmtm3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種輔助診斷大腸癌的檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測(cè)與大 腸癌相關(guān)的OfTM堪因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌（Colorectal Cancer，CRC)又稱結(jié)直腸癌，是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤。 目前研宄表明大腸癌是大腸黏膜上皮細(xì)胞在遺傳和環(huán)境等多種復(fù)雜的因素共同作用下，發(fā) 生遺傳和表觀遺傳的改變而獲得無限增殖，躲避凋亡程序等能力，從而在局部形成腫塊。近 年來，隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣與結(jié)構(gòu)的改變，加之人口老齡化趨勢(shì)的影響，我 國(guó)大腸癌的發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)迅速，而且發(fā)病年齡明顯提前。世界衛(wèi)生組織（WHO)發(fā)布 的《全球癌癥報(bào)告2014》顯示中國(guó)癌癥新增病例和死亡人數(shù)的絕對(duì)數(shù)值位居世界首位。其 中以胃癌、食道癌、大腸癌為代表的消化道癌癥威脅最為顯著。盡管目前手術(shù)方式和輔助治 療手段不斷改進(jìn)，大腸癌的患者的術(shù)后生存情況有了較大的改善，但是CRC患者的五年總 體生存率仍舊不高，其中最重要的一個(gè)因素就是，許多患者在疾病發(fā)生的早期沒有得到及 時(shí)的診斷和治療。因此，有必要探索其他分子指標(biāo)獨(dú)立或者聯(lián)合CEA等檢測(cè)，對(duì)大腸癌患者 做到早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療，提高大腸癌患者總體生存率。
[0003] 趨化素樣因子超家族成員 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，OiTM?)是趨化素樣因子超家族（Chemokine-Like Factor Family，OZ/^F)中的一員。趨化素樣因子超家族成員3是由位于16號(hào)染色體的趨化素樣 因子超家族成員 3 基因（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，Oi713)(chrl6:66,637,935-66,647,795)編碼而成的。國(guó)內(nèi)外已有大量研宄報(bào) 道了趨化素樣因子超家族成員 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, OiTM?)能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且也闡明趨化素樣因子 超家族成員 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, OiTM?)啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的表觀遺傳修飾與消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病的關(guān)系。但是大部分研宄均 是對(duì)甲基化定性檢測(cè)方法，靈敏性特異性均較低。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于用于定 量檢測(cè)大腸癌中趨化素樣因子超家族成員3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的檢測(cè)試劑盒相關(guān) 研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢測(cè)準(zhǔn)確率高的可 用于檢測(cè)與大腸癌相關(guān)的OiTM堪因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，其中基因 OiTM?甲基化水平與大腸癌的患病率呈正相關(guān)，可通過對(duì)樣品DNA甲基化水平測(cè)定輔助診 斷大腸癌。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種可用于檢測(cè)與大腸癌相關(guān)的 OiTM堪因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒，包括OiTM堪因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化特異性擴(kuò)增 上游引物、下游引物及其甲基化特異性測(cè)序引物，其中所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5? -Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3?； 所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3' ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -CTTCTTCTTCACCCTAATT-3'。
[0006] 一種可用于檢測(cè)與大腸癌相關(guān)的〇?ΤΜ5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒的應(yīng) 用，該試劑盒可用于大腸癌輔助檢測(cè)、診斷或藥物治療中。
[0007] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了可用于檢測(cè)與大腸癌相 關(guān)的OiTM堪因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，所述的檢測(cè)試劑盒包含趨化素樣 因子超家族成員3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化特異性上游引物、甲基化特異性下游引物及其甲 基化特異性測(cè)序引物。趨化素樣因子超家族成員3基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，影響轉(zhuǎn)錄 因子與DNA間的相互作用，或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致趨化素樣因子超家族成員3基因的 低表達(dá)，從而影響大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，趨化素樣因子超家族成員3基因啟動(dòng)子區(qū)甲 基化水平與大腸癌的患病率呈正相關(guān)，通過檢測(cè)趨化素樣因子超家族成員3基因啟動(dòng)子區(qū) 甲基化程度輔助診斷大腸癌，簡(jiǎn)單、方便，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確可靠、靈活快速 和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
[0008] 綜上所述，以基因 OiTM?啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒可以方便快 捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌的檢測(cè)，同時(shí)，以堪因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化為靶點(diǎn) 的藥物有望成為大腸癌輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。
【附圖說明】
[0009] 圖1為被檢測(cè)序列所在區(qū)域(具體位置為chrl6:66, 638, 384-66, 638, 441)，以及 所檢測(cè)的7個(gè)CpG點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0. 842,CpG2 與CpG3的相關(guān)系數(shù)為0. 933); 圖2為DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示意圖（如圖示CpGl到CpG7的甲基化程度分別為49%， 46%，51%，46%，42%，49%，42%);圖中陰影部分顯示的是對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合該位點(diǎn) 附近堿基種類可分析得到其甲基化水平（即陰影框?qū)?yīng)的上方數(shù)字)。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 具體實(shí)施例
[0011] 1、研宄對(duì)象的收集 本研宄選取寧波市某三甲醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌患者42例手術(shù)標(biāo)本作為研宄對(duì)象。 所有病例診斷，依據(jù)患者的臨床資料、影像學(xué)和結(jié)腸鏡檢查等，并得到術(shù)后病理診斷確認(rèn)。 手術(shù)切除大腸癌組織和癌旁組織(距離癌組織至少5cm以上的正常組織)立即保存于-80度 液氮，用于日后組織標(biāo)本全基因組DNA提取。所有研宄對(duì)象都簽署知情同意書。
[0012] 2、基因組DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,德國(guó)）DNA提取試劑盒提取組織全基因 組DNA，再通過NanoDr