本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種葉酸-殼聚糖-cy7聚合物（cf7）及其制備方法及用途，還涉及由該聚合物形成的納米粒及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

癌癥是當(dāng)今威脅人類健康的主要原因之一。傳統(tǒng)的藥物化療會(huì)給正常細(xì)胞和組織帶來(lái)?yè)p害，成為腫瘤治療的最大難關(guān)。由于腫瘤組織和正常組織間在病理及生理特征方面存在著顯著的不同，腫瘤部位血管滲透性增強(qiáng)，大分子藥物、納米載體等很容易穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，又由于清除障礙，可長(zhǎng)時(shí)間、高濃度蓄積在腫瘤部位，這種作用稱為滲透和滯留增強(qiáng)（epr）效應(yīng)（ghaz-jahanian,m.a.;abbaspour-aghdam,f.;anarjan,n.;berenjian,a.;jafarizadeh-malmiri,h.,applicationofchitosan-basednanocarriersintumor-targeteddrugdelivery.molecularbiotechnology2015,57,(3),201-218.）。另外一方面，腫瘤組織細(xì)胞膜上存在多種特異性受體，如葉酸受體。腫瘤細(xì)胞的靶向治療是利用腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原和受體作為靶點(diǎn)的治療方法。大部分腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體（fr），而正常細(xì)胞表面低表達(dá)葉酸受體。我們可以利用葉酸偶聯(lián)抗癌藥物從而達(dá)到主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞的目的。

近紅外（nir）熒光染料由于具有了良好的組織滲透性，吸收的近紅外光在生物組織中的穿透深度較大，而激發(fā)的熒光受生物組織本身的影響較小，所以可檢測(cè)到深層組織的熒光信號(hào)。該類染料作為非侵入性的分子影像試劑在癌癥的早期檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。其中最具代表性的為近紅外菁染料。七甲川花菁染料（heptamethinecyanine，cy7）是其中一種性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的，已廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)（xiao,l.;zhang,y.;berr,s.s.;chordia,m.d.;pramoonjago,p.;pu,l.;pan,d.,anovelnear-infraredfluorescenceimagingprobeforinvivoneutrophiltracking.molecularimaging2012,11,(5),372-82.）。光動(dòng)力療法（photodynamictherapy，pdt）是利用光動(dòng)力效應(yīng)進(jìn)行疾病診斷和治療的一種新技術(shù)。其作用基礎(chǔ)是光動(dòng)力效應(yīng)。其過(guò)程是，特定波長(zhǎng)的激光照射使組織吸收的光敏劑受到激發(fā)，而激發(fā)態(tài)的光敏劑又把能量傳遞給周圍的氧，生成活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡。目前已有許多研究將cy7作為光敏劑用于光動(dòng)力治療。所以我們選擇cy7用作近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

殼聚糖（化學(xué)名：β-(1→4)-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖）是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)（chitin）經(jīng)過(guò)脫乙酰作用得到的。殼聚糖具有很好的生物相容性，生物降解性及低毒性等特點(diǎn)。其結(jié)構(gòu)中既有氨基又有羥基，易于化學(xué)修飾，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的新型藥物載體。此外殼聚糖還廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如組織工程、傷口愈合、生物成像和藥物輸送等。但是由于殼聚糖溶解度差，所以要對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾。因此目前大多數(shù)文獻(xiàn)均在其2位上引入官能團(tuán)，增加其溶解度。

2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者sharpless提出“click”化學(xué)反應(yīng)。其代表反應(yīng)為將末端帶有炔基和疊氮基團(tuán)的單體反應(yīng)形成帶有三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。該反應(yīng)快速、高效且具有高選擇性，已被廣泛應(yīng)用于合成各種材料。

基于以上背景，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種聚合物，該聚合物由疊氮化的殼聚糖衍生物與炔基化的葉酸（alk-fa）以及炔基化的cy7（alk-cy7）通過(guò)click化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)，并可通過(guò)自組裝形成納米粒。通過(guò)連接fa和cy7，使其不僅具有高效地識(shí)別靶腫瘤細(xì)胞的能力，并能用于近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上研究背景，本發(fā)明人利用“click”反應(yīng)將alk-fa和alk-cy7與6-疊氮-6-脫氧-n-鄰苯二甲酰亞胺基-殼聚糖反應(yīng)，合成葉酸-殼聚糖-cy7聚合物（cf7）。本發(fā)明的聚合物cf7能自組裝形成納米粒，可用做腫瘤的納米診療劑，其骨架上偶聯(lián)的葉酸分子可靶向識(shí)別葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，cy7分子可用于近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

因此本發(fā)明的目的是為了提供一種聚合物cf7及其制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供該聚合物形成的納米粒及其制備方法和用途。

本發(fā)明提供了一種聚合物cf7，其結(jié)構(gòu)式為：

其中n為殼聚糖衍生物重復(fù)單元的個(gè)數(shù)。

本發(fā)明的聚合物cf7可以通過(guò)以下方法制備，反應(yīng)式如下：

其中n為殼聚糖衍生物重復(fù)單元的個(gè)數(shù)。

反應(yīng)式中，1為殼聚糖；2為n-鄰苯二甲亞胺基殼聚糖；3為6-溴-6-脫氧-n-鄰苯二甲酰亞胺基-殼聚糖；4為6-疊氮-6-脫氧-n-鄰苯二甲酰亞胺基-殼聚糖；5為聚合物cf7。

本發(fā)明的cf7的合成方法，包括以下步驟：

步驟a：稱取殼聚糖1，與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)取代氨基，得到n-鄰苯二甲亞胺基殼聚糖2；

步驟b：將產(chǎn)物2上的6位羥基進(jìn)行溴取代反應(yīng)，得到產(chǎn)物6-溴-6-脫氧-n-鄰苯二甲酰亞胺基-殼聚糖3；

步驟c：將產(chǎn)物3上的6位溴進(jìn)行疊氮基取代反應(yīng)，得到6-疊氮-6-脫氧-n-鄰苯二甲酰亞胺基-殼聚糖4；

步驟d：將產(chǎn)物4與alk-fa和alk-cy7在無(wú)水硫酸銅和維生素c鈉鹽的催化作用下進(jìn)行click反應(yīng)，得到產(chǎn)物5；其中alk-fa是由葉酸和丙炔胺反應(yīng)得到（guo,z.;zhang,p.;song,m.;wu,x.;liu,c.;zhao,z.;lu,j.;zhang,x.,synthesisandpreliminaryevaluationofnoveltc-99m-labeledfolatederivativeviaclickreactionforspectimaging.appliedradiationandisotopes2014,91,24-30），alk-cy7是由苯肼和3-甲基-2-丁酮經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到（yang,z.;lee,j.h.;jeon,h.m.;han,j.h.;park,n.;he,y.;lee,h.;hong,k.s.;kang,c.;kim,j.s.,folate-basednear-infraredfluorescenttheranosticgemcitabinedelivery.jamchemsoc2013,135,(31),11657-11662）。

本發(fā)明中用到的殼聚糖1（cs）的重均分子量為10-1000千道爾頓。

本發(fā)明的聚合物cf7具體的反應(yīng)步驟如下：

步驟a：稱取殼聚糖1，溶于無(wú)水dmf，加入鄰苯二甲酸酐，氮?dú)獗Ｗo(hù)，120℃油浴攪拌加熱。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)液倒入冰水中，析出黃白色沉淀。抽濾，固體用乙醚、丙酮洗滌，干燥，得到n-鄰苯二甲亞胺基殼聚糖2；

步驟b：稱取產(chǎn)物2，溶于n-甲基吡咯烷酮（nmp），加入n-溴代丁二酰亞胺（nbs）和三苯基膦（tpp）。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，80℃反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入乙醇中，析出固體。離心，收集產(chǎn)物，并用乙醇、丙酮各清洗三遍并干燥，得到棕紅色固體3；

步驟c：稱取3，將其溶于n-甲基吡咯烷酮。加入疊氮化鈉（nan3），氮?dú)獗Ｗo(hù)，80℃反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入乙醇中，析出固體。離心，收集產(chǎn)物，產(chǎn)物先后用乙醇、二次水、丙酮各洗滌三遍。干燥得到棕色固體4；

步驟d：將產(chǎn)物4溶于二甲基亞砜（dmso），然后加入alk-fa和alk-cy7，氮?dú)獗Ｗo(hù)，然后將無(wú)水硫酸銅和維生素c鈉鹽溶于水，慢慢滴加入燒杯。80℃反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加到透析袋中，用純水透析72h，凍干，得到產(chǎn)物5（cf7）；其中alk-fa是由葉酸和丙炔胺反應(yīng)得到，alk-cy7是由苯肼和3-甲基-2-丁酮經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到。

本發(fā)明中所述聚合物cf7的分子量為100-1000千道爾頓。

步驟d中，產(chǎn)物4和alk-fa和alk-cy7的質(zhì)量比為：2∶1∶1。透析袋截留分子量為10000~14000。

本發(fā)明中所述的該聚合物可以形成納米粒及其制備方法。該方法為將聚合物cf7溶于二甲基亞砜中，然后用注射器將其慢慢滴加入裝有純水的燒杯中，攪拌混合，室溫靜置。該聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒。具體步驟為：將本發(fā)明中所述的聚合物用二甲基亞砜配成0.1~1毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，將其慢慢滴加入裝有20~50毫升純水的燒杯中，攪拌，室溫靜置0.5~1小時(shí)，聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒。

本發(fā)明的聚合物cf7用于腫瘤細(xì)胞的近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

本發(fā)明的作用原理為：1，改善殼聚糖的溶解度；2，將cy7靶向輸送到癌細(xì)胞，并用于近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

本發(fā)明的有益效果在于：

1，本發(fā)明的聚合物通過(guò)自組裝形成的納米粒，粒徑小于300納米，可以通過(guò)靜脈給藥，靶向輸送到腫瘤部位。

2，本發(fā)明的聚合物及其形成的納米粒，即克服了殼聚糖溶解度差的缺陷，同時(shí)利用納米載體表面的葉酸與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體的主動(dòng)靶向作用選擇性地濃集于腫瘤細(xì)胞，而且還可利用納米粒中的cy7分子進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的近紅外熒光成像和光動(dòng)力治療。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例1，實(shí)施例2制備的cs-n3，c7和cf7的紅外圖譜。

圖2實(shí)施例1，實(shí)施例3制備的cs-n3，cf7和cf的紫外圖譜。

圖3實(shí)施例1，實(shí)施例2制備的cs-n3，cf7和c7的熒光圖譜。

圖4實(shí)施例4，實(shí)施例5制備的納米粒cf7ns和c7ns的共聚焦成像圖。

圖5實(shí)施例4，實(shí)施例5制備的納米粒cf7ns和c7ns的體外細(xì)胞毒性。

具體實(shí)施方式

下面，將通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，在本發(fā)明權(quán)利要求所闡明的范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種改變或等同替換。

殼聚糖1購(gòu)于上海伯奧生物科技有限公司，分子量為60千道爾頓，脫乙酰度為90%。

實(shí)施例1

聚合物cf7的合成：

步驟a：稱取800mg殼聚糖溶于60ml無(wú)水dmf中，隨后加入1.6g鄰苯二甲酸酐，氮?dú)獗Ｗo(hù)，120℃油浴攪拌加熱。當(dāng)反應(yīng)液變澄清時(shí)，終止反應(yīng)。將反應(yīng)液倒入適量冰水中，析出白色沉淀。抽濾，固體用乙醚、丙酮分別洗滌3次，除去多余的鄰苯二甲酸酐，干燥得產(chǎn)物2。

步驟b：稱取100mg產(chǎn)物2，加入10mln-甲基吡咯烷酮（nmp），加熱攪拌溶解。當(dāng)溶液冷卻后置于冰水中，加入616mgn-溴代丁二酰亞胺（nbs），902mg三苯基膦（tpp）。氮?dú)獗Ｗo(hù)下80℃反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物倒入100ml乙醇中，析出固體。通過(guò)離心（5000r/min），收集產(chǎn)物，并用乙醇、丙酮各清洗三遍。干燥后得到棕色固體3。

步驟c：稱取50mg產(chǎn)物3溶于5mln-甲基吡咯烷酮，加入50mg疊氮化鈉（nan3），氮?dú)獗Ｗo(hù)，80℃下攪拌加熱4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒在50ml乙醇中，析出固體。通過(guò)離心（8000r/min）收集產(chǎn)物，產(chǎn)物先后用乙醇、二次水、丙酮各洗滌三遍。干燥后得到棕色固體4（cs-n3）。通過(guò)紅外譜圖分析，產(chǎn)物3上6位溴被疊氮基取代。通過(guò)紅外譜圖分析，如圖1所示，產(chǎn)物4（cs-n3）在2100cm^-1有紅外吸收峰，表明疊氮基已經(jīng)成功取代6位溴。

步驟d：稱取20mg產(chǎn)物4，溶于5ml二甲亞砜，加入10mgalk-fa，10mgalk-cy7。燒瓶用橡膠塞密封，抽真空后，用氮?dú)獗Ｗo(hù)。用1ml注射器往燒瓶先滴加2.5mg五水硫酸銅（溶于100μl二次水中），后滴加2mg抗壞血酸鈉（溶于100μl二次水中）。反應(yīng)物在50℃下，避光反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用規(guī)格為14000的透析袋透析72h。透析后，將透析袋中的固體凍干。通過(guò)紅外譜圖分析，產(chǎn)物4中6位疊氮基與alk-fa和alk-cy7中的炔基反應(yīng)，生成三唑環(huán)。通過(guò)紅外譜圖分析，如圖1所示，cf7在2100cm^-1沒(méi)有紅外吸收峰，表明疊氮基已經(jīng)成功與炔基反應(yīng)生成三唑環(huán)。而且在1531cm^-1、1638cm^-1有兩個(gè)吸收峰，表明葉酸成功的連接到殼聚糖骨架上。將產(chǎn)物溶于二甲基亞砜測(cè)紫外吸收，如圖2所示，cf7在280nm處有紫外吸收，表明葉酸已成功連接到殼聚糖骨架上。將產(chǎn)物溶于二甲基亞砜，激發(fā)波長(zhǎng)633nm，測(cè)其熒光強(qiáng)度。如圖3所示，cf7在801nm處有alk-cy7的特征峰，表明alk-cy7也已成功連接到殼聚糖骨架上。

實(shí)施例2

殼聚糖-cy7聚合物（c7）的合成：

稱取10mg實(shí)施例1的產(chǎn)物4，溶于5ml二甲亞砜，加入10mgalk-cy7。燒瓶用橡膠塞密封，抽真空后，用氮?dú)獗Ｗo(hù)。用1ml注射器往燒瓶先滴加2.5mg五水硫酸銅（溶于100μl二次水中），后滴加2mg抗壞血酸鈉（溶于100μl二次水中）。反應(yīng)物在50℃下，避光反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用規(guī)格為14000的透析袋透析72h。透析后，將產(chǎn)物凍干。通過(guò)紅外譜圖分析，產(chǎn)物4中6位疊氮基與alk-cy7中的炔基反應(yīng)，生成三唑環(huán)。如圖1所示，殼聚糖-cy7聚合物（c7）在2100cm^-1沒(méi)有紅外吸收峰，表明疊氮基已經(jīng)成功與alk-cy7中的炔基反應(yīng)生成三唑環(huán)。將產(chǎn)物溶于二甲基亞砜，激發(fā)波長(zhǎng)633nm，測(cè)其熒光光譜。如圖3所示，cf7在801nm處有alk-cy7的特征峰，表明alk-cy7也已成功連接到殼聚糖骨架上。

實(shí)施例3

殼聚糖-fa聚合物（cf）的合成：

稱取10mg實(shí)施例1的產(chǎn)物4，溶于5ml二甲亞砜，加入10mgalk-fa。燒瓶用橡膠塞密封，抽真空后，用氮?dú)獗Ｗo(hù)。用1ml注射器往燒瓶先滴加2.5mg五水硫酸銅（溶于100μl二次水中），后滴加2mg抗壞血酸鈉（溶于100μl二次水中）。反應(yīng)物在50℃下，避光反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用規(guī)格為14000的透析袋透析72h。透析后，將產(chǎn)物凍干。通過(guò)紅外譜圖分析，產(chǎn)物4中6位疊氮基與alk-fa中的炔基反應(yīng)，生成三唑環(huán)。如圖1所示，殼聚糖-fa聚合物（cf）在2100cm^-1沒(méi)有紅外吸收峰，表明疊氮基已經(jīng)成功與alk-fa中的炔基反應(yīng)生成三唑環(huán)。而且在1531cm^-1、1638cm^-1有兩個(gè)吸收峰，這表明alk-fa成功的連接到殼聚糖骨架上。將產(chǎn)物溶于二甲基亞砜測(cè)紫外吸收，如圖2所示，cf7在280nm處有紫外吸收，表明alk-fa已成功連接到殼聚糖骨架上。

實(shí)施例4

聚合物cf7用于藥物納米粒的制備方法：

將實(shí)施例1制得的cf7溶于二甲基亞砜中，然后用注射器將其慢慢滴加入裝有純水的燒杯中，攪拌混合，室溫靜置。該聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒。具體步驟為：將cf7用二甲基亞砜配成0.1~1毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，將其慢慢滴加入裝有20~50毫升純水的燒杯中，攪拌，室溫靜置0.5~1小時(shí)，聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒（cf7ns）。

實(shí)施例5

殼聚糖-cy7聚合物（c7）用于藥物納米粒的制備方法：

將c7溶于二甲基亞砜中，然后用注射器將其慢慢滴加入裝有純水的燒杯中，攪拌混合，室溫靜置。該聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒。具體步驟為：將c7用二甲基亞砜配成0.1~1毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，將其慢慢滴加入裝有20~50毫升純水的燒杯中，攪拌，室溫靜置0.5~1小時(shí)，聚合物通過(guò)自組裝形成納米粒（c7ns）。

實(shí)施例6

以人宮頸癌細(xì)胞系hela細(xì)胞（葉酸受體過(guò)表達(dá)細(xì)胞）和人肝癌細(xì)胞系hepg2細(xì)胞（葉酸受體低表達(dá)）為測(cè)試細(xì)胞系（細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：從液氮罐中取出hela細(xì)胞保種管，在37℃水浴鍋中快速溶化解凍，然后1000rpm離心5min，吸棄上清液，取1mldmem完全培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀吹打均勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中使得瓶中培養(yǎng)基為4ml，置于37℃，5%（v/v）co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出液氮中凍存的hepg2細(xì)胞，在37℃的水中解凍，將細(xì)胞懸液移入1.5ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入1mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移發(fā)到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置于5%（v/v）co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

共聚焦成像實(shí)驗(yàn)：將hela細(xì)胞與hepg2細(xì)胞消化后鋪到24孔板中，過(guò)夜，細(xì)胞完全貼壁后，pbs洗滌2遍，分別與20μg/ml實(shí)施例4和實(shí)施例5的cf7ns和c7ns在37℃下孵育4h。然后用pbs洗滌2遍，用4wt%多聚甲醛孵育固定10min，pbs洗滌2遍，然后加入dapi，室溫避光孵育10min，然后pbs洗滌2遍。激光共聚焦成像。

納米粒共聚焦成像結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，在hela細(xì)胞中，cf7ns的熒光強(qiáng)度比c7ns強(qiáng)，而在hepg2細(xì)胞中，cf7ns的熒光強(qiáng)度和c7ns效果相當(dāng)，表明葉酸的修飾可增加葉酸受體過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞株對(duì)納米藥物的攝取。而且cf7ns可以靶向輸送到葉酸受體高表達(dá)的細(xì)胞株成像，為腫瘤治療提供有效的手段。

實(shí)施例7

以人宮頸癌細(xì)胞系hela細(xì)胞（葉酸受體過(guò)表達(dá)細(xì)胞）和人肝癌細(xì)胞系hepg2細(xì)胞（葉酸受體低表達(dá)）為測(cè)試細(xì)胞系（細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：從液氮罐中取出hela細(xì)胞保種管，在37℃水浴鍋中快速溶化解凍，然后1000rpm離心5min，吸棄上清液，取1mldmem完全培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀吹打均勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中使得瓶中培養(yǎng)基為4ml，置于37℃，5%（v/v）co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出液氮中凍存的hepg2細(xì)胞，在37℃的水中解凍，將細(xì)胞懸液移入1.5ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入1mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移發(fā)到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置于5%（v/v）co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的hela或hepg2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，使得細(xì)胞濃度為0.5-1×10⁵個(gè)/ml，配制成細(xì)胞懸液。按每孔100μl細(xì)胞懸液的量接種到96孔板，培養(yǎng)24h后，分別加入實(shí)施例1中的40μg/mlcs-n3，40μg/ml的實(shí)施例4和實(shí)施例5的cf7ns和cfns，另設(shè)溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，，為了考察光動(dòng)力治療效果，本發(fā)明將加入cf7ns和cfns的實(shí)驗(yàn)組分為四組，有兩組用紅外光照射（nir），另外兩組不用紅外光照射。孵育24h后，吸棄舊培養(yǎng)基，pbs洗3遍，并于每孔中加入90μl無(wú)血清、無(wú)酚紅的1640培養(yǎng)基和10μlmtt溶液，繼續(xù)孵育4h后，小心吸棄上清液，于每孔中加入150μl二甲基亞砜，避光振蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解，用多功能酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸收度，并按下式計(jì)算細(xì)胞的存活率。存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸收值-溶劑對(duì)照組吸收值）/（空白組吸收值-溶劑對(duì)照組吸收值）。

納米粒的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，cs-n3對(duì)兩種細(xì)胞毒性較小，cf7ns和c7ns均可以在不同程度上殺死細(xì)胞。在hela細(xì)胞中，cf7ns的毒性比c7ns強(qiáng)，當(dāng)細(xì)胞暴露在紅外燈下時(shí)，cf7ns+nir（紅外光照射）的毒性比cf7ns的毒性強(qiáng)，c7ns+nir的毒性也比c7ns的毒性強(qiáng)；而在hepg2細(xì)胞中，c7ns與cf7ns毒性相當(dāng)，cf7ns+nir的毒性和c7ns+nir相當(dāng)。這表明葉酸的修飾可增加納米藥物對(duì)葉酸受體過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞的毒性，從而提高抗腫瘤選擇性。同時(shí)也表明光動(dòng)力治療會(huì)增強(qiáng)抗腫瘤效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。