本發(fā)明屬于納米醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤作為一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，是全球疾病致死的重要原因之一。惡性腫瘤發(fā)展較快，容易造成侵襲或轉(zhuǎn)移。目前手術(shù)、放療與化療仍然是治療腫瘤的三種常規(guī)手段，但這些治療手段存在諸多不足，損傷正常組織，系統(tǒng)毒副反應(yīng)大，二次復(fù)發(fā)率高等。因此，亟需開發(fā)一種新型非傳統(tǒng)治療方法來提高癌癥的治療效果，減少系統(tǒng)毒副作用，降低二次復(fù)發(fā)率。

腫瘤光學(xué)治療是一種精確靶向治療腫瘤的方法，是近年來興起的腫瘤非侵入性治療新方法。光學(xué)治療的基本原理是系統(tǒng)或局部給予的光敏劑在各組織中的半衰期不同，腫瘤組織中光敏劑濃度明顯高于正常組織，形成光敏劑在腫瘤組織的選擇性滯留，因此具有選擇性高，療效顯著，對(duì)正常組織傷害小及無全身毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。腫瘤光學(xué)治療包括光熱治療(photothermaltherapy,ptt)和光動(dòng)力治療(photodynamictherapy,pdt)，ptt主要通過具有近紅外光吸收能力的物質(zhì)在激光照射下產(chǎn)生熱量而殺死腫瘤細(xì)胞；pdt則利用激光與聚集在腫瘤組織中的光敏劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)達(dá)到治療作用。pdt對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率受多種因素的影響：光敏劑的種類，激光的波長(zhǎng)，細(xì)胞類型等。在以上同等條件下，光敏劑的亞細(xì)胞定位則成為了影響pdt效率的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼪Q定光動(dòng)力損傷的最初位點(diǎn)。很多研究證實(shí)線粒體是光動(dòng)力治療的重要靶點(diǎn)，且定位在線粒體的光敏劑比定位在其它細(xì)胞器的光敏劑能更有效地殺死腫瘤細(xì)胞。光照后起始反應(yīng)是在線粒體上形成單態(tài)氧，接著線粒體上的活性氧直接誘導(dǎo)線粒體通透性改變進(jìn)而導(dǎo)致線粒體去極化，變形，細(xì)胞色素c的釋放，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或者間接損傷腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞腫瘤組織中的微血管，造成局部缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞死亡。光療作為一種局部治療手段，對(duì)原位腫瘤具有很好的療效，但對(duì)于轉(zhuǎn)移性腫瘤療效甚微，而腫瘤轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的最主要的原因。因此，理想的腫瘤治療方法應(yīng)該不僅能清除原發(fā)的腫瘤病灶同時(shí)還對(duì)轉(zhuǎn)移病灶具有良好治療作用。

有研究發(fā)現(xiàn)：在引起腫瘤組織不可逆損傷的同時(shí)，ptt和pdt還能夠進(jìn)一步刺激機(jī)體夠釋放各種炎癥和急性響應(yīng)調(diào)節(jié)因子，有效地刺激固有和獲得性免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致治療部位大量聚集中性細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞，改變腫瘤微環(huán)境，在增強(qiáng)腫瘤療效、對(duì)抗局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞方面顯示巨大的潛能。腫瘤光療的獨(dú)特免疫刺激效應(yīng)受到研究者的極大重視，然而腫瘤的免疫逃逸機(jī)制如誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制性細(xì)胞，分泌抑制因子等會(huì)阻礙機(jī)體自身抗腫瘤免疫系統(tǒng)的建立，故大多腫瘤患者的免疫功能處于抑制狀態(tài)，僅由光療產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)作用是有限的。機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，而放療和化療等惡性腫瘤常規(guī)治療手段又會(huì)進(jìn)一步抑制機(jī)體的免疫功能。因此，免疫療法作為一種新型腫瘤治療方法，通過針對(duì)機(jī)體腫瘤的發(fā)生機(jī)制，采用生物學(xué)干預(yù)策略調(diào)控機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別、撲捉、殺滅殘余的腫瘤細(xì)胞，最終達(dá)到治愈目的。因此大量的研究集中在利用pdt或ptt體外誘導(dǎo)制備腫瘤細(xì)胞全抗原，并致敏離體分離的樹突狀細(xì)胞，制備腫瘤疫苗。這種方法雖然具有原理可行、操作直接的特點(diǎn)，但是最終臨床響應(yīng)率低(僅有7％)，離體產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞在淋巴結(jié)中的遷移率較低(只有3～5％)；更為繁瑣的是，制備基于樹突狀細(xì)胞的腫瘤疫苗需要根據(jù)每一個(gè)病人個(gè)體進(jìn)行制作，耗時(shí)較長(zhǎng)，過程復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，目前仍缺乏生產(chǎn)臨床級(jí)疫苗的標(biāo)準(zhǔn)方案，因此質(zhì)量不可控。

因此，如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)治療和免疫治療相結(jié)合綜合治療腫瘤，并產(chǎn)生腫瘤特異性免疫力，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建基于納米載體的具有協(xié)同效應(yīng)的多功能復(fù)合藥物對(duì)于腫瘤治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明構(gòu)建了一種聯(lián)合光學(xué)治療和免疫治療的線粒體靶向型復(fù)合藥物及其制備方法和應(yīng)用，在腫瘤原位治療中運(yùn)用本發(fā)明納米復(fù)合藥物，能夠高效靶向原位腫瘤的亞細(xì)胞器——線粒體，進(jìn)而產(chǎn)生單態(tài)氧以及引發(fā)光熱反應(yīng)，單態(tài)氧誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非特異性抗腫瘤免疫響應(yīng)，并在免疫佐劑作用下進(jìn)一步激發(fā)機(jī)體免疫抵抗腫瘤，最終達(dá)到特異性地抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

技術(shù)方案1：

一種線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物，包括納米載體，以及分別與納米載體連接的線粒體靶向共聚物、免疫佐劑共聚物和光敏劑，所述納米載體為水溶性碳基納米粒子，所述線粒體靶向共聚物為由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的親脂性陽(yáng)離子共聚物，所述免疫佐劑共聚物是由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的cpgodn共聚物，所述光敏劑為近紅外光激發(fā)下具有光動(dòng)力及光熱效應(yīng)的有機(jī)染料，其中：磷脂的疏水脂肪鏈與水溶性碳基納米粒子之間通過疏水作用力結(jié)合使得線粒體靶向共聚物和免疫佐劑共聚物負(fù)載于水溶性碳基納米粒子上，光敏劑通過π-π堆積作用自組裝于水溶性碳基納米粒子表面。

本技術(shù)方案中水溶性碳基納米粒子包括：納米氧化石墨烯、單臂碳納米管、多臂碳納米管或者富勒烯；優(yōu)選為納米氧化石墨烯，因?yàn)榧{米氧化石墨烯表面易于修飾，能夠?qū)⑴c磷脂聚乙二醇衍生物(以下簡(jiǎn)寫為磷脂-peg)共價(jià)結(jié)合的分子組裝到氧化石墨烯表面，同時(shí)氧化石墨烯具有免疫刺激性。

作為優(yōu)選實(shí)施方式，水溶性碳基納米粒子的粒徑為150nm～500nm。

本技術(shù)方案中在近紅外光(波長(zhǎng)620～1100nm)激發(fā)下具有光動(dòng)力及光熱效應(yīng)的有機(jī)染料包括：二氟化硼二吡咯甲川染料及其衍生物類(bodipy)，羅丹明類，菁類(優(yōu)選為：icg、ir820、ir825)或者苝類。

本技術(shù)方案中免疫佐劑共聚物優(yōu)選為由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸共聚物(以下簡(jiǎn)稱為dp-cpg共聚物)，非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(以下簡(jiǎn)稱為cpgodn)能夠模擬非甲基化cpg二核苷酸片段的免疫刺激活性。當(dāng)其被樹突狀細(xì)胞(dc)、b細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞內(nèi)化后，會(huì)與toll樣受體9(tlr-9)結(jié)合，有效增強(qiáng)相應(yīng)細(xì)胞的活性和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，進(jìn)而在抵抗機(jī)體腫瘤方面發(fā)揮免疫佐劑的作用。

本技術(shù)方案中dp-cpg共聚物中cpgodn部分硫化，即部分具有硫代磷酸酯鍵，能夠耐受核酸酶——dnase酶。

本技術(shù)方案采用的cpgodn包括：a型cpgodn、b型cpgodn、c型cpgodn和p型cpgodn，優(yōu)選為含有20～24個(gè)堿基對(duì)，其中：a型cpgodn中包括cpgodn1585，cpgodn2216和cpgodn2336，b型cpgodn中包括cpgodn1668，cpgodn1826，cpgodn2006，cpgodn2007，cpgodn7909，cpgodnbw006和cpgodnd-sl01；c型cpgodn中包括cpgodn2395，cpgodnm362和cpgodnd-sl03；p型cpgodn中包括cpgodn21798；

本技術(shù)方案中cpgodn優(yōu)選為cpgodn1826。

本技術(shù)方案中線粒體靶向共聚物優(yōu)選為由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的親脂性陽(yáng)離子共聚物，上述共聚物中陽(yáng)離子基團(tuán)具有較高的脂溶性和正電性能，能利用線粒體外膜與間隙、內(nèi)膜與基質(zhì)之間膜電位負(fù)電勢(shì)的差異靶向線粒體；本技術(shù)方案中親脂性陽(yáng)離子基團(tuán)優(yōu)選為苯基膦基團(tuán)，提供苯基膦基團(tuán)的物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)：三苯基膦分子(tpp)、四苯基膦分子；另外，本技術(shù)方案中提供親脂性陽(yáng)離子基團(tuán)物質(zhì)還包括但不限于羅丹明類。

本技術(shù)方案中磷脂為本領(lǐng)域技術(shù)術(shù)語(yǔ)，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)常識(shí)，磷脂是指整個(gè)分子具有零電荷且具有疏水性脂肪鏈的中性磷脂乙醇氨；本技術(shù)方案中磷脂包括但不限于以下物質(zhì)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油烯基磷脂酰乙醇胺(dope)、雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(dmpe)和二月桂?；字Ｒ掖及?dlpe)；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例，磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)。

進(jìn)一步地，本技術(shù)方案中親脂性苯基膦陽(yáng)離子共聚物是由氨基修飾的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-nh2)與末端含有羧基的三苯基膦化合物通過酰胺化反應(yīng)所制得；

進(jìn)一步地，本技術(shù)方案中dp-cpg共聚物是由馬來酰亞胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-mal)中磷脂為疏水端，而馬來酰亞胺(maleinimide，mal)為親水端，與標(biāo)記有巰基(-sh)的cpgodn進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)生成cpgodn共聚物。

上述親脂性陽(yáng)離子共聚物中疏水端磷脂和dp-cpg共聚物中疏水端磷脂均可通過疏水作用組裝到所述納米載體表面。

本技術(shù)方案中聚乙二醇(peg)的分子量范圍為500～5000da，優(yōu)選分子量為2000，分子量的單位為道爾頓。

技術(shù)方案2：

一種線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物的制備方法，包括如下步驟：

步驟a：分別制備親脂性陽(yáng)離子共聚物及免疫佐劑共聚物，具體操作如下：

制備親脂性陽(yáng)離子共聚物：

將含有苯基膦基團(tuán)和羧基基團(tuán)的親脂性化合物溶解于氯仿中，攪拌條件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、n-羥基丁二酰亞胺和三乙胺，室溫下反應(yīng)2～6小時(shí)，再加入氨基功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-nh2)，攪拌均勻，室溫下反應(yīng)18～24小時(shí)，待反應(yīng)完成后，將混合溶液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度28～39℃，待旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完成得到樣品，然后用蒸餾水溶解樣品得到親脂性陽(yáng)離子共聚物溶液；

制備免疫佐劑共聚物：

將巰基功能化的cpgodn和馬來酰亞胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-mal)分別溶解于tris-hcl緩沖液制得濃度為8～15mg/ml的cpgodn溶液和濃度為0.5～1mg/ml的馬來酰亞胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-mal)溶液，上述所用tris-hcl緩沖液的ph在為6.8～8.5范圍內(nèi)，然后將巰基功能化的cpgodn溶液與馬來酰亞胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-mal)溶液混合均勻，得到的混合溶液中巰基功能化的cpgodn與磷脂-peg-mal的質(zhì)量比為1∶1～1∶10，將混合溶液在室溫下避光反應(yīng)4～8小時(shí)，反應(yīng)完成后進(jìn)行離心處理，離心處理完成后通過清洗操作去除多余的反應(yīng)物，制得免疫佐劑共聚物溶液；

步驟b：將水溶性碳基納米粒子超聲溶解于水中，調(diào)節(jié)溶液的ph值為6.8～8.5，制得納米載體溶液，然后將步驟a制得的親脂性陽(yáng)離子共聚物和免疫佐劑共聚物分別與所述納米載體溶液中反應(yīng)進(jìn)行吸附，其中：親脂性陽(yáng)離子共聚物與水溶性碳基納米載體的質(zhì)量比為：1∶1，免疫佐劑共聚物與水溶性碳基納米載體的質(zhì)量比為：1∶40～1∶60，制得負(fù)載有親脂性陽(yáng)離子共聚物和免疫佐劑共聚物的納米載體溶液；

步驟c：在避光條件下，將光敏劑溶解于水或二甲亞砜(dmso)制得光敏劑溶液，然后將光敏劑溶液加入到完成步驟b后負(fù)載有親脂性陽(yáng)離子共聚物和免疫佐劑共聚物的納米載體溶液中，充分混合后，在室溫下振蕩培養(yǎng)10～18小時(shí)，反應(yīng)完成后，將溶液離心處理后清洗以除去多余光敏劑，制得負(fù)載有親脂性陽(yáng)離子共聚物、免疫佐劑共聚物和光敏劑的納米載體溶液，經(jīng)冷凍干燥即可得到線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物。

本技術(shù)方案中水溶性碳基納米粒子包括：納米氧化石墨烯、單臂碳納米管、多臂碳納米管或者富勒烯；優(yōu)選為納米氧化石墨烯；

作為優(yōu)選實(shí)施方式，水溶性碳基納米粒子的粒徑為150nm～500nm。

本技術(shù)方案中在近紅外光(波長(zhǎng)620～1100nm)激發(fā)下具有光動(dòng)力及光熱效應(yīng)的有機(jī)染料包括：二氟化硼二吡咯甲川染料及其衍生物類(bodipy)，羅丹明類菁類(優(yōu)選為：icg、ir820、ir825)或者苝類。

本技術(shù)方案中免疫佐劑共聚物優(yōu)選為由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸共聚物(以下簡(jiǎn)稱為dp-cpg共聚物)，非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(以下簡(jiǎn)稱為cpgodn)能夠模擬非甲基化cpg二核苷酸片段的免疫刺激活性。當(dāng)其被樹突狀細(xì)胞(dc)、b細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞內(nèi)化后，會(huì)與toll樣受體9(tlr-9)結(jié)合，有效增強(qiáng)相應(yīng)細(xì)胞的活性和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，進(jìn)而在抵抗機(jī)體腫瘤方面發(fā)揮免疫佐劑的作用。

本技術(shù)方案中dp-cpg共聚物中cpgodn部分硫化，即部分具有硫代磷酸酯鍵，能夠耐受核酸酶——dnase酶。

本技術(shù)方案采用的cpgodn包括：a型cpgodn、b型cpgodn、c型cpgodn和p型cpgodn，優(yōu)選為含有20～24個(gè)堿基對(duì)，其中：a型cpgodn中包括cpgodn1585，cpgodn2216和cpgodn2336，b型cpgodn中包括cpgodn1668，cpgodn1826，cpgodn2006，cpgodn2007，cpgodn7909，cpgodnbw006和cpgodnd-sl01；c型cpgodn中包括cpgodn2395，cpgodnm362和cpgodnd-sl03；p型cpgodn中包括cpgodn21798；

本技術(shù)方案中cpgodn優(yōu)選為cpgodn1826。

本技術(shù)方案中線粒體靶向共聚物優(yōu)選為由磷脂聚乙二醇衍生物修飾的親脂性陽(yáng)離子共聚物，上述共聚物中的陽(yáng)離子基團(tuán)具有較高的脂溶性和正電性能，能利用線粒體外膜與間隙、內(nèi)膜與基質(zhì)之間膜電位負(fù)電勢(shì)的差異靶向線粒體；本技術(shù)方案中親脂性陽(yáng)離子基團(tuán)優(yōu)選為苯基膦基團(tuán)，提供苯基膦基團(tuán)的物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)：三苯基膦分子(tpp)、四苯基膦分子。

本技術(shù)方案中磷脂為本領(lǐng)域技術(shù)術(shù)語(yǔ)，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)常識(shí)，磷脂是指整個(gè)分子具有零電荷且具有輸水性脂肪鏈的中性磷脂聚乙二醇氨；本技術(shù)方案中磷脂包括但不限于以下物質(zhì)：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油烯基磷脂酰乙醇胺(dope)、雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(dmpe)和二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(dlpe)；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例，磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)；

進(jìn)一步地，本技術(shù)方案中親脂性苯基膦陽(yáng)離子共聚物是由氨基修飾的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-nh2)與末端含有羧基的三苯基膦化合物通過酰胺化反應(yīng)所制得；

進(jìn)一步地，本技術(shù)方案中dp-cpg共聚物是由馬來酰亞胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-peg-mal)中磷脂為疏水端，而馬來酰亞胺(maleinimide，mal)為親水端，與標(biāo)記有巰基(-sh)的cpgodn進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)生成cpgodn共聚物。

上述親脂性陽(yáng)離子共聚物中疏水端磷脂和dp-cpg共聚物中疏水端磷脂均可通過疏水作用組裝到所述納米載體表面。

本技術(shù)方案中聚乙二醇(peg)的分子量范圍為500～5000da，優(yōu)選分子量為2000，分子量的單位為道爾頓。

本技術(shù)方案中步驟b中制得的納米載體負(fù)載親脂性陽(yáng)離子共聚物和免疫佐劑共聚物的順序不做限定，即可以先吸附親脂性陽(yáng)離子共聚物，待親脂性陽(yáng)離子共聚物負(fù)載于納米載體上后，再吸附免疫佐劑共聚物，使得免疫佐劑共聚物也負(fù)載于納米載體上，或者也可以先吸附免疫佐劑共聚物，待免疫佐劑共聚物負(fù)載于納米載體上后，再吸附親脂性陽(yáng)離子共聚物，使得親脂性陽(yáng)離子共聚物也負(fù)載于納米載體上；

具體地，納米載體負(fù)載親脂性陽(yáng)離子共聚物和免疫佐劑共聚物的方式如下：

納米載體負(fù)載親脂性陽(yáng)離子共聚物：將一定質(zhì)量的親脂性陽(yáng)離子共聚物加入一定濃度的納米載體溶液中，在室溫條件下攪拌10～18小時(shí)后，然后將混合溶液經(jīng)過離心處理，并采用三蒸水充分洗滌沉淀，洗去未負(fù)載到納米載體上的親脂性陽(yáng)離子共聚物，經(jīng)過上述操作將親脂性陽(yáng)離子共聚物負(fù)載于納米載體上。

納米載體吸附免疫佐劑共聚物：將一定質(zhì)量的免疫佐劑共聚物加入一定濃度的納米載體溶液中，在室溫條件下，搖床培養(yǎng)12～18小時(shí)，然后將混合溶液經(jīng)過離心處理，并采用三蒸水充分洗滌沉淀，洗去未載到納米載體上的免疫佐劑共聚物，經(jīng)過上述操作將免疫佐劑共聚物負(fù)載于納米載體上。

技術(shù)方案3：

線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物的應(yīng)用，通過瘤內(nèi)給藥或者靜脈給藥至生物體內(nèi)，瘤內(nèi)給藥2～6小時(shí)或者靜脈給藥18～24小時(shí)后，采用任一種波長(zhǎng)在620～1100nm范圍內(nèi)的激光中照射腫瘤部位，照射時(shí)間優(yōu)選為5～20分鐘，照射激光的功率密度優(yōu)選為0.25～2w/cm²。

作為優(yōu)選實(shí)施方式，近紅外激光的波長(zhǎng)為808nm；

通過上述操作可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)光學(xué)治療(釋放單態(tài)氧和產(chǎn)生光熱效應(yīng))的效果，極大提高腫瘤治療效率。

本發(fā)明提供的納米復(fù)合藥物可用于治療的癌癥包括但不限于生物體器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，包括：皮膚癌、惡性黑色素瘤、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、喉癌、甲狀腺癌，舌癌，前列腺癌、陰莖癌、睪丸腫瘤，陰道惡性腫瘤、外陰惡性腫瘤等。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明利用碳基納米粒子的平面結(jié)構(gòu)和極大的比表面積，通過π-π共軛和疏水作用對(duì)光敏劑、免疫佐劑共聚物和親脂性陽(yáng)離子共聚物高效共載，構(gòu)建了一種集光學(xué)治療和免疫治療于一體的線粒體靶向型復(fù)合藥物。通過納米載體的增強(qiáng)滲透和epr效應(yīng)滯留在生物體腫瘤部分，進(jìn)一步地，親脂性陽(yáng)離子賦予納米復(fù)合藥物亞細(xì)胞器定位功能，進(jìn)而在近紅外激光刺激下，光敏劑啟動(dòng)活性氧自由基介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，顯著提高了光動(dòng)力治療效應(yīng)、光熱效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞的免疫原性，并在免疫佐劑發(fā)揮治療作用下，能夠進(jìn)一步有效激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫響應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移并清除腫瘤的目的。

本發(fā)明納米復(fù)合藥物具有高效、低毒、釋藥可控的優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合光學(xué)治療和免疫治療綜合高效治療腫瘤，并原位刺激機(jī)體免疫抗腫瘤應(yīng)答，使得機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫力，也有利于減少光敏劑的劑量，進(jìn)一步降低其毒副作用。

本發(fā)明納米復(fù)合藥物給藥具有時(shí)空可控性，治療時(shí)采用波長(zhǎng)在生物組織近紅外透明窗口范圍內(nèi)的激光，能夠使用較低劑量光敏劑即可實(shí)現(xiàn)激光猝發(fā)下良好的腫瘤細(xì)胞殺傷效果，從而進(jìn)一步降低激光對(duì)正常組織造成危害的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明納米復(fù)合藥物制備條件溫和，在治療原位腫瘤甚至轉(zhuǎn)移腫瘤具有廣闊的前景，將會(huì)成為腫瘤聯(lián)合增敏治療的重要策略之一。

附圖說明

圖1為本發(fā)明納米復(fù)合藥物的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例制備得到dp-cpgodn共聚物在反應(yīng)物不同重量比下的非變性聚丙烯凝膠電泳結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例制備得到線粒體靶向型納米載體(以下簡(jiǎn)寫為gt)的熱重分析曲線。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例制得gt的水力粒徑表征圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例制得負(fù)載有dp-cpg共聚物的線粒體靶向型納米復(fù)合物(以下簡(jiǎn)寫為gt/dp-cpg納米復(fù)合物)的紫外-可見光吸收光譜圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例制得負(fù)載有dp-cpg共聚物和光敏劑ir820的線粒體靶向型納米復(fù)合物(以下簡(jiǎn)寫為gt/dp-cpg/ir820)的紫外-可見光吸收光譜圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例制得gt/dp-cpg/ir820的載藥率和包封率。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例分別制得gt/dp-cpg納米復(fù)合物和負(fù)載有cpgodn的線粒體靶向型納米復(fù)合物(以下簡(jiǎn)寫為gt/cpgodn納米復(fù)合物)的載藥率及包封率對(duì)比圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例制得gt/dp-cpg/ir820和光敏劑ir820的體外單態(tài)氧產(chǎn)率對(duì)比圖，其中：圖a為光敏劑ir820激光照射不同時(shí)間下的單態(tài)氧熒光圖譜，圖b為本實(shí)施例制得gt/dp-cpg/ir820光敏劑激光照射不同時(shí)間下的單態(tài)氧熒光圖譜。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例制得gt、光敏劑ir820、靶向型納米光敏藥物(以下簡(jiǎn)寫為gt/ir820)、gt/dp-cpg和gt/dp-cpg/ir820)的光熱曲線。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例制得gt/dp-cpg/ir820的細(xì)胞攝取及亞細(xì)胞器定位的共聚焦熒光圖。

圖12為本發(fā)明采用elisa法檢測(cè)dp-cpg、gt和制得gt/dp-cpg的免疫刺激活性檢測(cè)結(jié)果圖；其中，圖(a)為dp-cpg、gt和gt/dp-cpg分別與raw264.7細(xì)胞孵育后檢測(cè)所得tnf-α的分泌水平對(duì)比圖；圖(b)為dp-cpg、gt和gt/dp-cpg分別與raw264.7細(xì)胞孵育后檢測(cè)所得tnf-γ的分泌水平對(duì)比圖。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例制得gt/ir820與非靶向性納米光敏藥物(以下簡(jiǎn)寫為gp/ir820)的體外光療結(jié)果對(duì)比圖；其中，圖(a)為激光照射條件的細(xì)胞存活率結(jié)果圖，圖(b)為無光照條件的細(xì)胞存活率結(jié)果圖。

圖14為本發(fā)明實(shí)施例制得gt/dp-cpg/ir820的體內(nèi)抗腫瘤測(cè)試結(jié)果；其中，圖(a)為空白對(duì)照組、光照組、光敏劑ir820組、dp-cpg組、gt組、gt/ir820組+光照和gt/dp-cpg/ir820+光照組腫瘤的生長(zhǎng)曲線，圖(b)為療程結(jié)束后空白對(duì)照組、光照組、光敏劑ir820組、dp-cpg組、gt組、gt/ir820+光照組和gt/dp-cpg/ir820+光照組小鼠腫瘤重量比較結(jié)果圖；圖(c)為療程中空白對(duì)照組、光照組、光敏劑ir820組、dp-cpg組、gt組、gt/ir820+光照組和gt/dp-cpg/ir820+光照組的小鼠體重變化結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述：

如圖1所示為本發(fā)明納米光敏免疫復(fù)合藥物的結(jié)構(gòu)示意圖，采用片狀具有巨大表比面積的納米氧化石墨烯作為納米載體，同時(shí)納米氧化石墨烯自身具有免疫刺激效應(yīng)，能夠顯著激活巨噬細(xì)胞并引發(fā)促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)，具有免疫佐劑的作用；通過采用由磷脂聚乙二醇衍生物分別對(duì)親脂性陽(yáng)離子和cpgodn共修飾形成親脂性陽(yáng)離子共聚物和dp-cpg共聚物，其中疏水端磷脂通過疏水作用與納米載體結(jié)合，使得親脂性陽(yáng)離子和cpgodn負(fù)載于納米載體表面，并且通過π-π堆積作用將光敏劑自組裝于水溶性碳基納米粒子表面。

實(shí)施例1：

一種線粒體靶向的納米光敏免疫復(fù)合藥物的制備方法：

本實(shí)施中磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(以下簡(jiǎn)寫為dspe)，親脂性陽(yáng)離子基團(tuán)采用苯基膦基團(tuán)，具體地，含有苯基膦基團(tuán)的親脂性化合物采用5-羧基戊基三苯基溴化磷，光敏劑采用ir820，免疫佐劑采用cpgodn1826；

本實(shí)施中先將親脂性陽(yáng)離子共聚物負(fù)載于納米載體上制得靶向型納米載體(以下簡(jiǎn)寫為gt)，然后再將免疫佐劑共聚物負(fù)載于gt上，最后負(fù)載光敏劑制得光敏免疫復(fù)合藥物；

以下為本實(shí)施例的具體操作：

步驟1：合成親脂性陽(yáng)離子共聚物dspe-peg-tpp及dp-cpg共聚物；

制備親脂性陽(yáng)離子共聚物：

精確稱取20.0mg5-羧基戊基三苯基溴化磷溶解于0.5ml氯仿中，磁力攪拌使得5-羧基戊基三苯基溴化磷充分溶解，然后加入29.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)、17.5mgn-羥基丁二酰亞胺(nhs)和0.05ml三乙胺，在室溫下反應(yīng)4小時(shí)，再加入25.0mg氨基修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及肪垡叶佳苌?以下簡(jiǎn)稱為dspe-peg-nh2)，磁力攪拌均勻，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，待反應(yīng)完成后，將混合溶液轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中，在37℃下旋蒸蒸干，然后用2ml三蒸水溶解樣品，并置于2kda透析袋內(nèi)透析三天后，取出溶液，冷凍干燥，稱重，密封保存，得到親脂性陽(yáng)離子共聚物；

本實(shí)施例通過紫外分光光度表征并計(jì)算dspe-peg的tpp的接枝率約為80％(w/w％)；

制備dp-cpg共聚物：

采用10mmph為8的tris-hcl緩沖液分別溶解巰基功能化的cpgodn1826和馬來酰亞胺功能化的二硬脂?；字Ｒ掖及肪垡叶佳苌?以下簡(jiǎn)稱dspe-peg-mal)制得濃度為0.66mg/ml的cpgodn1826溶液和濃度為10.0mg/ml的dspe-peg-mal溶液；

分別取四份均為100μl的cpgodn1826溶液分別與6.6μl、13.2μl、33.0μl和66.0μldspe-peg-mal溶液混合于2ml棕色離心管，得到四組混合溶液；將四份混合溶液置于轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床在室溫下反應(yīng)4小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，使用3kd超濾管在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心分離5分鐘，然后除去未反應(yīng)的cpgodn1826，超濾過后定容至100μl；

本實(shí)施例采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳表征邁克爾加成反應(yīng)得到由二硬脂?；字Ｒ掖及肪垡叶佳苌镄揎椀腸pgodn1826(以下簡(jiǎn)稱dp-cpg共聚物)，如附圖2所示，當(dāng)cpgodn1826與dspe-peg-mal的質(zhì)量比為1：10時(shí)dp-cpg共聚物的產(chǎn)率為90％。

步驟2：合成gt；

取2.0ml濃度為0.5mg/ml分散均勻的納米氧化石墨烯(go)溶液，用1mnaoh溶液和1mhcl溶液調(diào)節(jié)上述溶液ph至7左右，然后加入1.0mg步驟1制得的dspe-peg-tpp，在室溫下攪拌過夜反應(yīng)，然后將上述混合溶液在轉(zhuǎn)速為15000rpm的條件下離心分離30分鐘，然后用三蒸水洗滌三次去除未反應(yīng)物，再定容至2ml；

本實(shí)施例采用熱重分析法分析go和gt的重量變化，二者的差值則dspe-peg-tpp在go載體上的質(zhì)量百分比，如圖3所示，dspe-peg-tpp在溫度區(qū)間300～400攝氏度間，gt發(fā)生顯著失重，由此估算dspe-peg-tpp在gt中所占的質(zhì)量百分比為34％，經(jīng)過計(jì)算得到tpp負(fù)載率為12％；本實(shí)施例采用動(dòng)態(tài)光散射對(duì)gt粒徑進(jìn)行表征，如圖4所示，gt的水力直徑為200nm左右。

步驟3：負(fù)載免疫佐劑及光敏劑；

取0.5ml步驟2制得的濃度0.5mg/ml的gt溶液于棕色離心管中，加入20μl濃度為0.22mg/mldp-cpg共聚物溶液，然后將混合溶液置于轉(zhuǎn)速為200rpm恒溫?fù)u床，在室溫反應(yīng)12小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移到10.0ml離心管中，在轉(zhuǎn)速為15000rpm的條件下離心分離30分鐘，然后采用超純水反復(fù)洗滌三次以除去未負(fù)載上的dp-cpg共聚物，再用超純水定容至500ml，4℃儲(chǔ)存，得到納米氧化石墨烯上負(fù)載有dp-cpg共聚物和dspe-peg-tpp的納米復(fù)合物(以下簡(jiǎn)稱gt/dp-cpg納米復(fù)合物)；

本實(shí)施例通過熒光探針fam標(biāo)記cpg，然后采用紫外可見光譜對(duì)gt/dp-cpg納米復(fù)合物表征，通過熒光發(fā)射光譜分別檢測(cè)上清中cpg的熒光強(qiáng)度，表征結(jié)果如圖5所示：通過紫外-可見吸收光譜檢測(cè)得納米復(fù)合藥物顯示有自由dspe-peg-cpg的熒光標(biāo)記探針fam在480nm處的特征吸收峰，表明dspe-peg-cpg的成功負(fù)載。

取4.0ml上述操作配制所得濃度為0.5mg/ml的gt/dp-cpg溶液，均分為八組，各組均置于10ml棕色離心管中，再向八組棕色離心管中分別加入體積分別為5μl、12.5μl、25μl、50μl、75μl、100μl、125μl和150μl濃度為1.0mg/ml的ir820溶液進(jìn)行混合，通過超聲分散使各組溶液充分混合均勻，將八組混合溶液均放置于轉(zhuǎn)速為200rpm的恒溫培養(yǎng)振蕩器中，在25℃下反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將所得的八組溶液分別轉(zhuǎn)移至八個(gè)1.5ml的棕色離心管中，均放置于同一高速離心機(jī)中，在15000rpm的條件下離心30分鐘，然后用超純水反復(fù)洗滌三次以除去未負(fù)載的光敏劑分子，最后用超純水定容至500l，4℃下儲(chǔ)存，即得到八組納米氧化石墨烯上負(fù)載有dp-cpg、dspe-peg-tpp和光敏劑ir820的納米復(fù)合物溶液(以下簡(jiǎn)稱gt/dp-cpg/ir820)。

本實(shí)施采用紫外可見光譜對(duì)gt/dp-cpg/ir820進(jìn)行表征，如圖6所示，可以看出：納米復(fù)合藥物的光譜圖中不但顯示有自由dspe-peg-dp-cpg的熒光標(biāo)記探針fam在480nm處的特征吸收峰，同時(shí)還顯示有ir820在近紅外區(qū)(680～980nm)的吸收峰，表明ir820的成功負(fù)載。

通過紫外光譜檢測(cè)所得八組納米復(fù)合藥物上清液中自由ir820的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算上清液中ir820的量，通過差減法得到連接至納米復(fù)合藥物上ir820的量，結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出最大載藥率可達(dá)到25％。

實(shí)施例2：

取0.5ml步驟2制得的濃度0.5mg/ml的gt溶液于棕色離心管中，加入20μl濃度為0.22mg/mlcpgodn1826溶液，然后將混合溶液置于轉(zhuǎn)速為200rpm恒溫?fù)u床，在室溫反應(yīng)12小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，在轉(zhuǎn)速為15000rpm的條件下離心分離30分鐘，然后采用超純水反復(fù)洗滌三次以除去未負(fù)載上的cpgodn1826，再用超純水定容至0.25ml，4℃儲(chǔ)存，得到納米氧化石墨烯上負(fù)載有cpgodn1826的納米復(fù)合物(以下簡(jiǎn)稱gt/cpgodn納米復(fù)合物)；

為對(duì)比本實(shí)施例制得gt/cpgodn納米復(fù)合物和實(shí)施例1中步驟3制得gt/dp-cpg納米復(fù)合物的包封率(ee)和載藥率(dlr)，本實(shí)施例通過熒光探針fam分別標(biāo)記兩種納米復(fù)合物溶液中的cpg，通過熒光發(fā)射光譜分別檢測(cè)兩種納米復(fù)合物溶液上清液中cpg的熒光強(qiáng)度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算得到兩種納米復(fù)合物上清液中cpg的殘余量，通過差減法分別得到連接在gt/dp-cpg納米復(fù)合物和gt/cpgodn納米復(fù)合物上cpg的量，將測(cè)得的熒光強(qiáng)度值代入cpg的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算cpg的濃度，分別通過以下公式計(jì)算gt/dp-cpg納米復(fù)合物和gt/cpgodn納米復(fù)合物上cpg的包封率(ee)和載藥率(dlr)：

ee(％)＝(起始投藥量-上清未負(fù)載藥物的量)/起始投藥量×100％

dlr(％)＝(起始投藥量-上清未負(fù)載藥物的量)/納米復(fù)合物的量×100％

結(jié)果如圖8所示，gt/dp-cpg納米復(fù)合物的載藥率和包封率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于gt/cpgodn納米復(fù)合物的載藥率。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1制得gt/dp-cpg/ir820進(jìn)行光動(dòng)力-光熱性質(zhì)測(cè)試，主要通過以下方法進(jìn)行測(cè)評(píng)：

(1)體外單線態(tài)氧產(chǎn)率測(cè)定：

本實(shí)施例采用綠色單線態(tài)氧探針(sosg)檢測(cè)gt/dp-cpg/ir820和光敏劑ir820的單線態(tài)氧產(chǎn)率；

檢測(cè)原理如下：無單線態(tài)氧存在時(shí)，sosg分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移淬滅了生色團(tuán)的熒光，而存在單線態(tài)氧時(shí)，sosg形成內(nèi)過氧化物，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移發(fā)生改變，生色團(tuán)的熒光在530nm處得到恢復(fù)。因此，sosg在530nm處的熒光強(qiáng)度的上升量直接反映了單線態(tài)氧的產(chǎn)量。

單線態(tài)氧產(chǎn)率測(cè)定的具體操作如下：向1ml濃度為10μg/ml的gt/dp-cpg/ir820水溶液中，加入1μl單線態(tài)氧熒光探針sosg母液，混合均勻，混合溶液中sosg終濃度為2.5μm，測(cè)量混合溶液在530nm處的熒光強(qiáng)度；

然后采用波長(zhǎng)為808nm的激光以功率密度為0.5w/cm²的光強(qiáng)持續(xù)照射20分鐘，測(cè)量混合溶液經(jīng)光照后在530nm處的熒光強(qiáng)度；

通過分析圖9所示結(jié)果可以得到gt/dp-cpg/ir820和光敏劑ir820的單線態(tài)氧產(chǎn)生情況：光敏劑ir820和納米復(fù)合藥物gt/dp-cpg/ir820產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，但在相同光照時(shí)長(zhǎng)下，納米復(fù)合藥物gt/dp-cpg/ir820的單線態(tài)氧產(chǎn)率相較于自由光敏劑ir820低，這是由于石墨烯載體與光敏劑ir820之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移所致，但本實(shí)施納米復(fù)合物gt/dp-cpg/ir820仍可進(jìn)一步用于光動(dòng)力治療。

(2)體外光熱性能檢測(cè)：

將實(shí)施例1制得的gt配制成濃度為100μg/ml的溶液，將光敏劑ir820配制成濃度為10μg/ml的溶液，然后通過實(shí)施例1方法制備gt濃度為100μg/ml、光敏劑ir820濃度為10μg/ml的線粒體靶向型復(fù)合物gt/ir820；gt濃度為100μg/ml、dp-cpg濃度為2μg/ml的免疫復(fù)合物gt/dp-cpg；光敏劑ir820濃度為10μg/ml、dp-cpg濃度為2μg/ml的光敏免疫gt/dp-cpg/ir820；然后分別取上述制得溶液各一份，每一份均為0.2ml，加入到96孔板中，使用波長(zhǎng)為808nm的近紅外激光，在功率密度0.5w/cm²照射5分鐘，采用與計(jì)算機(jī)連接的熱電偶測(cè)試溶液溫度上升情況，并設(shè)置一組超純水的溫度上升作為對(duì)照；

如圖10所示，由于gt和光敏劑ir820在波長(zhǎng)范圍為700～1100nm的近紅外區(qū)域具有較強(qiáng)的吸收，所以兩者的光熱效應(yīng)均顯示出明顯地濃度依賴；在相同光照時(shí)長(zhǎng)下，復(fù)合藥物gt/ir820顯示出比載體和ir820增強(qiáng)的光熱效應(yīng)，可進(jìn)一步用于光熱治療。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例通過以下操作檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制得gt/dp-cpg/ir820的亞細(xì)胞器定位能力：

采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞emt-6(以下簡(jiǎn)稱emt6)，將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的emt6細(xì)胞接種于35mm的玻璃底培養(yǎng)皿(密度為6.5×10⁴個(gè)/孔)，培養(yǎng)24小時(shí)；然后將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制得濃度為200μg/ml的gt/dp-cpg/ir820納米復(fù)合藥物加至兩組培養(yǎng)皿，兩組培養(yǎng)皿中相應(yīng)的dp-cpg的終濃度均為4μg/ml，相應(yīng)的ir820的終濃度均為35μg/ml，然后將兩組培養(yǎng)皿置于二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)和4小時(shí)；

孵育結(jié)束后采用pbs溶液將細(xì)胞洗滌三遍，細(xì)胞加入溶酶體探針(lyso-trackergreen，ltg)工作液(200nm)或線粒體探針(mito-trackergreen，mtg)染色工作液(200nm)，孵育30分鐘；去除染液，用pbs洗滌三次，室溫條件用4％的多聚甲醛溶液固定20分鐘，再用pbs洗滌三次，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1.0ml的細(xì)胞核染液(dapi染液)，室溫下進(jìn)行避光染色5分鐘后，棄掉dapi染液，用pbs緩沖液再次反復(fù)清洗三次；最后加入1mlpbs緩沖液浸沒細(xì)胞，將其置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，設(shè)置dapi的激發(fā)波長(zhǎng)為405nm，在該激發(fā)波長(zhǎng)下dapi呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，ir820的激發(fā)波長(zhǎng)分別為630nm，在該激發(fā)波長(zhǎng)下dapi呈現(xiàn)紅色熒光，lysotrackergreen和mito-trackergreen激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，在該激發(fā)波長(zhǎng)下dapi呈現(xiàn)綠色熒光，得到如圖11(a)所示結(jié)果gt/dp-cpg/ir820與細(xì)胞孵育2小時(shí)后，ir820的紅色熒光和ltg的綠色熒光重合成黃色熒光，而孵育4小時(shí)后，ir820的紅色熒光和ltg的綠色熒光不重合，表明gt/dp-cpg/ir820在2小時(shí)存在與細(xì)胞溶酶體中，而在4小時(shí)逃離溶酶體；如圖12(b)所示gt/dp-cpg/ir820與細(xì)胞孵育2小時(shí)后，ir820的紅色熒光和mtg的綠色熒光不重合，而孵育4小時(shí)后，ir820的紅色熒光和mtg的綠色熒光重合成黃色熒光,表明gt/dp-cpg/ir820在2小時(shí)未位于線粒體上，而4小時(shí)則與線粒體共定位。

上述結(jié)果顯示了納米復(fù)合物的細(xì)胞攝取和亞細(xì)胞器定位情況，可以看出：gt/dp-cpg/ir820能夠較好的被細(xì)胞攝取，并且具有較好的溶酶體逃逸能力，2小時(shí)內(nèi)分布在細(xì)胞的溶酶體，4小時(shí)后逃離溶酶體定位于線粒體中。本實(shí)施例能夠說明納米復(fù)合藥物gt/dp-cpg/ir820具有很好的線粒體靶向定位作用。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例通過以下操作檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制得gt/dp-cpg納米免疫復(fù)合物的免疫刺激能力：

將小鼠單核巨噬細(xì)胞raw264.7接種于96孔板(密度為1×10⁵個(gè)/孔)，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制得濃度為1mg/ml的gt/dp-cpg納米復(fù)合物至[gt]為100μg/ml，[dp-cpg]為2.0μg/ml，然后加入孔中，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)后收集上次清液，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)試劑盒測(cè)定tnf-α的分泌水平；與細(xì)胞孵育24小時(shí)后再次收集上次清液，用elisa試劑盒測(cè)定ifn-γ的分泌水平；

如圖12所示為gt/dp-cpg納米復(fù)合物在細(xì)胞攝取后誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素tnf-α、ifn-γ的結(jié)果。結(jié)果顯示：石墨烯納米載體本身和do-cpg會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定水平的促炎細(xì)胞因子，而根據(jù)實(shí)施例1制得的中g(shù)t/dp-cpg納米復(fù)合物則顯示出非常顯著的促炎細(xì)胞因子分泌水平。

實(shí)施例6：

本實(shí)施例通過以下操作測(cè)定gt/ir820與gp/ir820體外靶向腫瘤光療效果：

將小鼠乳腺癌emt6細(xì)胞接種在96孔板中，細(xì)胞密度為10⁴個(gè)/孔，取負(fù)載有相同質(zhì)量光敏劑的gp/ir820和gt/ir820分別分散于相同體積dmem培養(yǎng)液，加入96孔板中，gt終濃度為100μg/ml，ir820終濃度分別為0，2.5，5，10，15μg/ml，共培養(yǎng)4小時(shí)后，棄去孔板中含有納米復(fù)合物的舊培養(yǎng)液，用pbs緩沖液反復(fù)清洗三次，向孔板中加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液；

采用波長(zhǎng)為808nm激光在功率密度為0.5w/cm²下分別照射每個(gè)孔5分鐘，激光處理結(jié)束后，將培養(yǎng)板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；吸出孔板中舊培養(yǎng)液，用pbs緩沖液反復(fù)清洗三次，再向每孔中加入100μlcck8工作液，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)45分鐘；打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置參數(shù)后將孔板放置于酶標(biāo)儀中，檢測(cè)細(xì)胞在450nm處的吸光度(od值)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

通過納米光敏復(fù)合物處理過的細(xì)胞的活細(xì)胞與空白對(duì)照液的活細(xì)胞相比的百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞毒性。

如圖13為靶向性光敏復(fù)合藥物gt/ir820和非靶向性gp/ir820的體外抗腫瘤效應(yīng)圖，兩者對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力具有濃度依賴性，與自由ir820相比，靶向性光敏復(fù)合藥物gt/ir820比非靶向性gp/ir820具有更強(qiáng)的體外抗腫瘤效應(yīng)；例如，結(jié)合ir820(10μg/ml)的gp/ir820復(fù)合物可將細(xì)胞存活率由自由ir820的58％降低到30％；而ir820(10μg/ml)攜載到靶向性載體上后，細(xì)胞的存活率進(jìn)一步下降到19％，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這充分說明線粒體靶向性載體能夠顯著增強(qiáng)腫瘤光療效果。

實(shí)施例7：

本實(shí)施例通過以下操作研究納米光敏免疫復(fù)合藥物體內(nèi)聯(lián)合抗腫瘤效果，包括以下步驟：

步驟1：選用多只5～6周齡，體重18～22g的雌性balb/c小鼠，將emt6細(xì)胞接種于balb/c小鼠右腿后背部，接種大約一周左右，待接種腫瘤長(zhǎng)到一定大小時(shí)得到所需異種移植荷瘤小鼠模型；

步驟2：將接種腫瘤成功的小鼠隨機(jī)分為7組，分別記為1～7組，標(biāo)記第1組為生理鹽水組，第2組為生理鹽水加激光照射組，第3組為gt組，第4組為ir820組，第5組為dp-cpg組，第6組為gt/ir820加激光照射組，第7組為gt/dp-cpg/ir820加激光照射組；

步驟3：標(biāo)記3～7組的藥物采用實(shí)施例1制得藥物，將其分別溶解分散于生理鹽水中制成各組所用藥品溶液，給藥方式采用瘤內(nèi)注射，生理鹽水的劑量為50μl/只，cpgodn的劑量為10μl/只，ir820劑量為50μl/只，gt/ir820和gt/cpg/ir820的劑量為100μl；

將小鼠脫毛，暴露出光照區(qū)，給藥后2小時(shí)，使用功率密度為0.5w/cm²，波長(zhǎng)為808nm的近紅外激光照射第2組、第6組和第7組小鼠的腫瘤部位10分鐘，同時(shí)用紅外熱像儀檢測(cè)腫瘤部位的溫度變化，隔日通過游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤兩個(gè)維度的大小，檢測(cè)荷瘤鼠的體重；

本實(shí)驗(yàn)各組小鼠給藥為每周給藥一次，一共給3次藥，觀察記錄各組腫瘤大小、小鼠體重變化情況，第22天，處死小鼠，分離出瘤塊并稱重。

腫瘤體積計(jì)算公式如下：

v＝wl²/2

其中，w代表腫瘤的長(zhǎng)徑，l代表腫瘤的短徑。

圖14顯示了實(shí)施例六的體內(nèi)聯(lián)合抗腫瘤結(jié)果，從圖中可以看出：與gt/ir820處理組和dp-cpg處理組相比，納米光敏免疫復(fù)合物gt/dp-cpg/ir820表現(xiàn)出極為明顯的腫瘤抑制效果，最終腫瘤體積和重量最?。徊⑶以谡麄€(gè)治療過程中，小鼠的體重?zé)o明顯變化，表明gt/dp-cpg/ir820具有很好的生物安全性。

以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了闡述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，上述具體實(shí)施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。