一種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。本發(fā)明將甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶作為催化劑，氬氣保護下室溫反應，然后減壓除去溶劑，將剩余的物料進行柱色譜分離，收集洗脫液，除去洗脫劑得紅色固體即為具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。本發(fā)明所述探針結構簡單，易于分離與純化，對過氧化氫的檢測具有操作簡便、選擇性好、靈敏度高、檢測限低等特點，可以用于體外過氧化氫的檢測、活體細胞線粒體內(nèi)外源和內(nèi)生過氧化氫的檢測以及細胞線粒體的熒光定位分析。
【專利說明】
一種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針及應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針及其在體外過氧化氫的檢測、活體細胞線粒體內(nèi)外源和內(nèi)生過氧化氫的檢測以及細胞線粒體的熒光定位分析中的應用。
【背景技術】
[0002]線粒體是一種廣泛存在于動物和植物細胞中的亞細胞器，是細胞有氧呼吸和制造能量的主要場所。過氧化氫(H2O2)是一種重要活性氧類物質(R0S)，主要產(chǎn)生于細胞線粒體有氧呼吸電子傳遞鏈，參與了生物體內(nèi)氧化還原和信號轉導過程。過氧化氫可以激活NF-kappaB等因子(調節(jié)炎癥反應重要的轉錄因子)，這些信號途徑與哮喘、炎癥性關節(jié)炎、動脈硬化以及神經(jīng)退行性疾病等許多疾病相關。過氧化氫在細胞內(nèi)過量積聚會引起生物體代謝紊亂，導致一系列人類疾病，如癌癥，糖尿病，帕金森癥等。同時，過氧化氫和細胞凋亡、細胞增殖等密切相關。因此發(fā)展高選擇性、高靈敏度、具有生物兼容性的過氧化氫檢測與分析技術對于相關疾病的研究具有十分重要的意義。
[0003]過氧化氫的檢測主要包括熒光法、光度法、電化學法及化學發(fā)光法等。其中，熒光法具有非侵入性、高靈敏性和高信號特異性的特點，與激光掃描共聚焦顯微鏡技術結合為過氧化氫的檢測和活體示蹤開辟了一條新的途徑。近年來用于檢測過氧化氫的熒光探針主要有:(I)基于過氧化氫的氧化作用而設計的探針，如二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFDA)、二氫羅丹明123等；(2)基于過氧化氫水解切斷熒光團的保護基團，使熒光團熒光恢復的探針，如單五氟苯磺酸酯二氟熒光素、二硼酸酯基熒光素等。然而，部分探針存在易光漂白、發(fā)射波長短、選擇性差以及生物相容性差等問題，尤其能夠精準定位于細胞線粒體，實現(xiàn)對過氧化氫特異性檢測的熒光探針還十分匱乏。因此，發(fā)展新型用于過氧化氫檢測的高選擇性、高靈敏度熒光探針以及對生物活性物質的實時-動態(tài)-可視化的成像技術在生物、醫(yī)療、臨床診斷等諸多領域有著廣泛的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的就是提供一種用于過氧化氫及生物活性氧類物質檢測與成像分析的具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。
[0005]本發(fā)明將甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶作為催化劑，氬氣保護下室溫反應，然后減壓除去溶劑，將剩余的物料進行柱色譜分離，收集洗脫液，除去洗脫劑得紅色固體即為具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。
[0006]本發(fā)明所述的探針結構簡單，易于分離與純化，對過氧化氫的檢測具有操作簡便、選擇性好、靈敏度高、檢測限低等特點。由于良好的生物相容性，探針可用于活體細胞線粒體內(nèi)外源和內(nèi)生過氧化氫的快速、高靈敏、特異性檢測與熒光成像分析。
[0007]—種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針，其特征在于該探針通過以下方法制備得到: 將甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶(作為催化劑)，氬氣保護下室溫反應I?2 h，然后減壓除去溶劑，將剩余的物料進行柱色譜分離，收集洗脫液，除去洗脫劑得紅色固體，即為具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。
[0008]所述甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉、卩卡卩坐醛和呢啶的用量比為1.00 mmol:1.00 mmol:0.05 mLo
[0009]所述柱色譜分離的條件:體積比為20:1?5:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，100?300目硅膠為固定相。
[0010]上述具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針，細胞滲透性好，細胞毒性低，可以用于體外過氧化氫的檢測、活體細胞線粒體內(nèi)外源和內(nèi)生過氧化氫的檢測以及細胞線粒體的熒光定位分析。具體應用時，方法如下:
一種利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測體外過氧化氫的方法:將探針加入含有質量百分數(shù)為0.5 %?1.5 °/c^DMS0溶液的待檢測物中，反應5?20 min，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測物中具有過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測物中不具有過氧化氫。優(yōu)選的，所述加入的探針的濃度為5?15 μΜ，檢測過氧化氫的濃度范圍為0.2?10 μΜ。
[0011]—種利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測細胞外源過氧化氫的方法:首先在待檢測細胞的培養(yǎng)液中加入探針，在37 °C生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，然后加入過氧化氫繼續(xù)培養(yǎng)60?120 min，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)具有外源過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)不具有外源過氧化氫。所述探針的濃度為2?10 μΜ。
[0012]進一步地，還可設置陽性對照，以過氧化氫組作為陽性對照。
[0013]所述待檢測細胞可以是各種病變細胞(比如人宮頸癌細胞，肝癌細胞)，也可以是正常細胞(可以作為陰性對照)。
[0014]一種利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測細胞內(nèi)生過氧化氫的方法:首先在待檢測細胞的培養(yǎng)液中加入探針，在37 °C生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，然后用佛波醇乙酯(PMA)對細胞進行刺激，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)具有內(nèi)生過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)不具有內(nèi)生過氧化氫。所述探針的濃度為2?10 μΜ。
[0015]所述用佛波醇乙酯刺激待檢測細胞的具體方式為:Iyg/mL佛波醇乙酯培養(yǎng)孵育待檢測細胞60?120 min。佛波醇乙酯是活性氧自由基誘導劑，會導致活性氧的過量產(chǎn)生，由于佛波醇乙酯的細胞毒性大，低濃度的即可引起細胞凋亡等異?，F(xiàn)象，優(yōu)選I yg/mL佛波醇乙酯對細胞處理未發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)異常變化及細胞凋亡等現(xiàn)象。
[0016]—種利用具有線粒體靶向功能的熒光探針定位細胞線粒體的方法:在待檢測細胞的培養(yǎng)液中同時加入探針和線粒體深紅色熒光探針(Mito Tracker Deep Red)，在37 °(:生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，進行熒光檢測及成像;在熒光顯微鏡下觀察，若488 nm波長激發(fā)下細胞的綠色熒光圖像與638 nm波長激發(fā)下細胞的紅色熒光圖像相似度大于95%，則表明該熒光探針具有細胞線粒體定位功能。所述探針的濃度為2?10 μΜ，線粒體深紅色熒光探針濃度為50 ηΜ。
[0017]細胞線粒體定位的原理為:線粒體深紅色熒光探針是一種商業(yè)化的遠紅外熒光染料(吸收波長/發(fā)射波長為640/662 nm)，用于對活細胞線粒體進行染色。在共染實驗中，若本發(fā)明所合成的熒光探針與線粒體深紅色熒光探針具有相似的熒光染色效果，則表明本發(fā)明所合成的熒光探針就有細胞線粒體定位功能，可用于活細胞線粒體的熒光染色。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點:
1.合成路線簡單，反應產(chǎn)物易分離純化。
[0019]2.所制備化合物細胞滲透性好，細胞毒性低。
[0020]3.可用于細胞線粒體的熒光標記與染色。
[0021]4.可用于細胞外源、內(nèi)生過氧化氫的高靈敏、特異性檢測與熒光成像分析。
【附圖說明】
[0022]圖1:A為探針與過氧化氫反應前后的紫外吸收圖，其中I為探針的紫外吸收圖，2為探針與過氧化氫反應后的紫外吸收圖；B為探針與過氧化氫反應前后的熒光發(fā)射圖，其中I為探針的熒光發(fā)射圖，2為探針與過氧化氫反應后的熒光發(fā)射圖。反應條件:探針5 μΜ，過氧化氫50 yM，DMS0 1%，反應5 min。
[0023]圖2:A為探針與過氧化氫反應體系熒光強度隨時間變化圖，反應條件:探針5μΜ,過氧化氫50 yM，DMS0 1%，反應時間O?10 min;B為探針與過氧化氫反應體系熒光強度隨加入過氧化氫濃度變化圖，反應條件:探針5 μΜ，過氧化氫O?10 yM，DMS0 1%，反應時間5
mino
[0024]圖3:人宮頸癌細胞外源、內(nèi)生過氧化氫的檢測和探針的線粒體染色。A、F為人宮頸癌細胞加入10 μΜ探針培養(yǎng)30 min后成像;B為探針孵育的細胞繼續(xù)加入100 μΜ過氧化氫培養(yǎng)90 min后成像;G為探針孵育的細胞繼續(xù)加入I yg/mL佛波醇乙酯培養(yǎng)90 min后成像;C和H為探針孵育的細胞加入50 ηΜ線粒體深紅色熒光探針90 min后成像;D為B和C的疊加圖；I為G和H的疊加圖$和】分別為相應明場成像圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0026]下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。
[0027]實施例1具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針的合成依次包括以下3個步驟:
1、將甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉(1.00mmol)和等量咔唑醛加入到反應溶劑20 mL乙醇中，加入哌啶(0.05 mL)作為催化劑，氬氣保護下室溫反應I h;
2、上述反應結束后，在減壓下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，加熱溫度低于500C0
[0028]3、以二氯甲烷/甲醇=10/l(v/v)為洗脫劑，200目硅膠為固定相，進行柱色譜分離。收集洗脫液，溶劑旋干，得紅色固體。
[0029]實施例2體外過氧化氫的檢測實驗
體外對過氧化氫的檢測原理主要是基于探針與過氧化氫的專一性反應:探針由于自身分子內(nèi)電荷轉移作用熒光淬滅。當探針與過氧化氫作用，探針分子被氧化，分子內(nèi)發(fā)生重排、消去反應，得到的反應產(chǎn)物具有很強的熒光，從而導致反應體系熒光恢復達到檢測的目的。在過氧化氫檢測試劑中，探針的濃度為5 μΜ，過氧化氫濃度為0.2?10 μΜ。并且探針在含有濃度為I %(質量百分數(shù))的DMSO溶液的檢測體系中對于過氧化氫具有良好的選擇性。
[0030]體外過氧化氫檢測結果見附圖1、附圖2及【附圖說明】。探針自身的紫外吸收峰在490nm，相應的溶液顏色為淺紅色。當探針與過氧化氫反應后，反應體系的紫外吸收峰在376nm，溶液顏色變?yōu)闊o色(如圖1A所示)。因此，本發(fā)明可通過比色法和肉眼觀測的方法實現(xiàn)對體外過氧化氫的檢測，檢測方法簡單易行，靈敏度高。同時，探針在與過氧化氫反應前熒光強度很弱，而與過氧化氫反應后527 nm處熒光強度明顯增強(如圖1B所示)。在365 nm紫外燈照射下，反應后溶液呈現(xiàn)明顯的黃綠色熒光。探針對過氧化氫的檢測，反應時間較短，在5分鐘內(nèi)反應達到平衡(如圖2A所示)，有利于復雜體系中對過氧化氫的快速檢測。探針對過氧化氫的檢測，線性范圍較寬(0.2?10 μΜ)，檢測限較低達到0.04 μΜ(如圖2Β所示)。該結果說明，探針對過氧化氫的檢測具有較高的靈敏度，適用于體外微量過氧化氫檢測。
[0031]實施例3細胞內(nèi)過氧化氫的檢測實驗
主要通過兩種方式對細胞內(nèi)過氧化氫進行檢測，一種是外加過氧化氫培養(yǎng)細胞，一種是用佛波醇乙酯刺激待檢測細胞產(chǎn)生內(nèi)生過氧化氫的方式。在細胞外源過氧化氫檢測試劑中，在細胞培養(yǎng)液中首先加入10 μΜ探針孵育30 min，然后加入過氧化氫繼續(xù)培養(yǎng)90 min,進行熒光檢測及成像。在細胞內(nèi)生過氧化氫檢測試劑中，在細胞培養(yǎng)液中首先加入10 μΜ探針孵育30 min，然后加入I yg/mL佛波醇乙酯繼續(xù)培養(yǎng)90 min，進行熒光檢測及成像。
[0032]細胞內(nèi)過氧化氫檢測結果見附圖3和【附圖說明】。如圖3A和圖3F所示，用探針孵育的細胞有微弱熒光，說明細胞內(nèi)過氧化氫含量較低，不足以與探針反應。而在探針孵育的細胞中繼續(xù)加入適量過氧化氫后，細胞呈現(xiàn)顯著黃綠色熒光(如圖3B所示)，說明探針在細胞內(nèi)與外源過氧化氫反應生成強熒光物質，探針可在細胞內(nèi)檢測外源性過氧化氫。如圖3G所示，當在探針孵育的細胞中加入適量佛波醇乙酯培養(yǎng)，細胞的熒光強度明顯增強，這主要是由于佛波醇乙酯能刺激細胞的氧化呼吸代謝，產(chǎn)生大量的活性氧類物質包括過氧化氫，細胞內(nèi)生性的過氧化氫與探針反應生成強熒光物質。該實驗證明探針對細胞內(nèi)生性過氧化氫的檢測具有很好的效果。同時如圖3E和圖3 J所示，細胞明場實驗表明細胞在用探針孵育和對過氧化氫檢測的過程中始終保持良好的細胞形態(tài)，說明該探針具有較好的生物相容性和較低的細胞毒性。
[0033]實施例4細胞線粒體的熒光染色和定位實驗
細胞線粒體的熒光染色和定位實驗主要采取共染的方式確定探針的線粒體靶向功能。具體方法如下:在細胞的培養(yǎng)液中加入10 μΜ探針和50 ηΜ線粒體深紅色熒光探針，37 °(:生物搖床中培養(yǎng)孵育30 min,進行熒光檢測及成像。
[0034]細胞內(nèi)線粒體熒光染色和定位結果見附圖3和【附圖說明】。如圖3B和圖3C所示，當用該發(fā)明合成探針和商品化線粒體深紅色熒光探針同時孵育細胞而后加入外源過氧化氫時，488 nm波長激發(fā)下細胞呈現(xiàn)的綠色熒光為合成探針染色的結果，638 nm波長激發(fā)下細胞呈現(xiàn)的紅色熒光為線粒體深紅色熒光探針染色的結果。將兩圖疊加(如圖3D所示)，我們發(fā)現(xiàn)在細胞內(nèi)兩種探針染色和定位的區(qū)域基本一致，相似度大于95 %，結果表明該發(fā)明合成探針具有細胞線粒體染色和定位功能。如圖3G和圖3H所示，當用該發(fā)明合成探針和商品化線粒體深紅色熒光探針同時孵育細胞而后加入佛波醇乙酯刺激細胞產(chǎn)生內(nèi)生過氧化氫時，488 nm波長激發(fā)的綠色熒光圖與638 nm波長激發(fā)的紅色熒光圖基本重合，結果同樣表明該發(fā)明合成探針具有細胞線粒體染色和定位功能。
【主權項】
1.一種具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針，其特征在于該探針通過以下方法制備得到: 將甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶，氬氣保護下室溫反應I?2 h，然后減壓除去溶劑，將剩余的物料進行柱色譜分離，收集洗脫液，除去洗脫劑得紅色固體，即為具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針。2.如權利要求1所述的熒光探針，其特征在于所述甲基苯硼酸頻哪酯基喹啉、咔唑醛和呢啶的用量比為1.00 mmol:1.00 mmol:0.05 mLo3.如權利要求1所述的熒光探針，其特征在于所述柱色譜分離的條件:體積比為20:1?5:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，100?300目硅膠為固定相。4.如權利要求1至3中任一項所述具有線粒體靶向功能的過氧化氫熒光探針在體外過氧化氫的檢測、活體細胞線粒體內(nèi)外源和內(nèi)生過氧化氫的檢測以及細胞線粒體的熒光定位分析中的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特征在于利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測體外過氧化氫的方法:將探針加入含有質量百分數(shù)為0.5 %?1.5 °/4^DMS0溶液的待檢測物中，反應5?20 min，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測物中具有過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測物中不具有過氧化氫。6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述加入的探針的濃度為5?15μΜ，檢測過氧化氫的濃度范圍為0.2?10 μΜ。7.如權利要求4所述的應用，其特征在于利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測細胞外源過氧化氫的方法:首先在待檢測細胞的培養(yǎng)液中加入探針，在37 °(:生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，然后加入過氧化氫繼續(xù)培養(yǎng)60?120 min，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)具有外源過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)不具有外源過氧化氫。8.如權利要求4所述的應用，其特征在于利用具有線粒體靶向功能的熒光探針檢測細胞內(nèi)生過氧化氫的方法:首先在待檢測細胞的培養(yǎng)液中加入探針，在37 °(:生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，然后用佛波醇乙酯對細胞進行刺激，進行熒光檢測及成像;若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)具有內(nèi)生過氧化氫，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內(nèi)不具有內(nèi)生過氧化氫。9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述用佛波醇乙酯刺激待檢測細胞的具體方式為:1 ug/mL佛波醇乙酯培養(yǎng)孵育待檢測細胞60?120 min。10.如權利要求4所述的應用，其特征在于利用具有線粒體靶向功能的熒光探針定位細胞線粒體的方法:在待檢測細胞的培養(yǎng)液中同時加入探針和線粒體深紅色熒光探針，在37°C生物搖床中培養(yǎng)孵育20?40 min，進行熒光檢測及成像;在熒光顯微鏡下觀察，若488 nm波長激發(fā)下細胞的綠色熒光圖像與638 nm波長激發(fā)下細胞的紅色熒光圖像相似度大于95%，則表明該熒光探針具有細胞線粒體定位功能。11.如權利要求10所述的應用，其特征在于所述線粒體深紅色熒光探針的濃度為50nMo12.如權利要求7、8或10所述的應用，其特征在于所述探針的濃度為2?10μΜ。
【文檔編號】G01N21/64GK105924427SQ201610322293
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐健, 邵士俊, 梁卿, 劉紅
【申請人】中國科學院蘭州化學物理研究所