一類(lèi)雜合型腫瘤靶向納米膠束及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類(lèi)基于肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l(PepTl)、雌激素受體(ER)靶向的雜合型腫瘤靶 向納米膠束，以及其在腫瘤靶向治療領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部數(shù)據(jù)顯示，癌癥已成為僅次于心血管疾病 的第二大致死病因，到2020年，我國(guó)每年僅新發(fā)病人數(shù)量就會(huì)超過(guò)300萬(wàn)人。與癌癥肆虐相 應(yīng)的卻是目前臨床治療手段的差強(qiáng)人意。手術(shù)和化療是癌癥患者對(duì)抗疾病的主要武器，遺 憾的是，目前臨床上應(yīng)用的化療藥物如阿霉素、順鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、喜樹(shù)堿、5-氟尿嘧 啶等治療效果均不盡如人意，其主要缺陷在于選擇性差，且有較嚴(yán)重的毒副作用。因此，開(kāi) 發(fā)腫瘤靶向性好、安全性高的新型抗癌藥物已是迫在眉睫。
[0003] 納米膠束抗癌藥物給藥系統(tǒng)具有毒性低、適用范圍廣、改善藥物的水溶性、延長(zhǎng)藥 物作用時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，此外，由于EPR效應(yīng)，納米膠束還能實(shí)現(xiàn)被動(dòng)腫瘤靶向。本世紀(jì)以來(lái)納米 膠束抗癌藥物給藥系統(tǒng)研究取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，多個(gè)納米膠束抗癌藥物如NC-6004(順鉑納 米膠束）、NK105(紫杉醇納米膠束）以及SP1049C(阿霉素納米膠束)等已處于臨床研究階段， 展現(xiàn)出了良好的開(kāi)發(fā)前景。
[0004] 納米膠束給藥系統(tǒng)研究方興未艾，但也存在一些不足，其中典型問(wèn)題有：i)部分膠 束給藥系統(tǒng)在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定性不足，存在突釋、滲漏以及提前酶解等現(xiàn)象，致使到達(dá)病灶 部位藥物濃度不足，并對(duì)正常組織或器官造成損傷;i i)藥物主動(dòng)靶向性不足。依賴(lài)EPR效應(yīng) 納米膠束給藥系統(tǒng)雖然可以部分實(shí)現(xiàn)藥物的腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)，但是不可忽視的是被動(dòng)靶向給 藥系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)后易被巨噬細(xì)胞吞噬，在肝、脾、肺、骨髓、淋巴結(jié)等處富集，從而造成 藥物分布分散，并引起相應(yīng)的器官損傷。
[0005] 針對(duì)上述難題，近來(lái)納米膠束給藥系統(tǒng)研究逐漸聚焦于主動(dòng)靶向性及長(zhǎng)循環(huán)穩(wěn)定 性。通過(guò)在載體表面連接特定抗體或配體，通過(guò)抗原-抗體、受體-配體之間高特異性和高親 和性的作用，可以使治療藥物主動(dòng)靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至病灶部位。目前，研究較多的腫瘤靶向受體有 葉酸受體、生物素受體、整合素受體等。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體(ER)在乳腺、結(jié)腸、子 宮、胃、前列腺等多類(lèi)腫瘤細(xì)胞上過(guò)表達(dá)，例如，臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約2/3乳腺癌呈ER陽(yáng)性。ER在 腫瘤發(fā)生、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演這重要作用，研究表明，ER如長(zhǎng)期受雌二醇、雌激素酮 等內(nèi)源配體激活會(huì)顯著引發(fā)乳腺、子宮、結(jié)腸等多個(gè)部位發(fā)生癌變，其機(jī)制可能是ER激活后 會(huì)形成ER-Src-PELP-I復(fù)合體并上調(diào)下游Erkl/Erk2的表達(dá)。而ER拮抗劑可以通過(guò)和ER競(jìng)爭(zhēng) 性結(jié)合阻斷內(nèi)源配體的活化作用，從而抑制ER通道介導(dǎo)的癌變及轉(zhuǎn)移。例如，ER拮抗劑他莫 昔芬、雷洛昔芬等已成功應(yīng)用于乳腺癌的治療，是當(dāng)前乳腺癌內(nèi)分泌治療的一線(xiàn)藥物。上述 研究提示，利用腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)的ER，設(shè)計(jì)對(duì)ER具有高親和力和拮抗活性的藥物分子， 有望獲得兼具ER靶向性和內(nèi)分泌治療效果的抗癌藥物。
[0006] 近來(lái)，肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l(Peptide transporter l，PepTl)介導(dǎo)的腫瘤革巴向也日益受到 關(guān)注。PepTl能特異性識(shí)別、吸收氨基酸、小肽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在健康人體中PepTl主要分布于 小腸上皮細(xì)胞，而其他正常組織/器官少見(jiàn)表達(dá)。腫瘤組織由于在快速生長(zhǎng)過(guò)程中需要大量 的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而在多類(lèi)腫瘤細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)有PepTl表達(dá)，如人結(jié)腸腺癌細(xì)胞caco-2、轉(zhuǎn)移 胰腺癌細(xì)胞AsPC-I、人胰腺癌細(xì)胞Capan-2、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549以及人纖維肉瘤細(xì)胞 HT-1080等。Endter等利用RT-PCR方法分析多類(lèi)肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)在所有測(cè)試細(xì)胞膜上P印Tl表 達(dá)均為陽(yáng)性，提示PpeTl在腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)可能是普遍現(xiàn)象。PetTl這種在正常細(xì)胞及 腫瘤細(xì)胞上分布的差異性為實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療提供了可能。之前有研究發(fā)現(xiàn)，部分氨基 酸/小肽前藥如氨基酸阿昔洛韋前藥可被PetTl特異性識(shí)別并吸收，Amidon等合成了氨基酸 去氧氟尿苷前藥，發(fā)現(xiàn)其對(duì)PepTl表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株的毒性顯著高于無(wú) PepTl表達(dá)的腫瘤細(xì) 胞株。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，PetTl能夠特異性識(shí)別、吸收某些齊墩果酸二肽前藥特別 是L-Val-L-Val二肽前藥，且該前藥對(duì)PepTl表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株均顯示出了選擇性毒性，提 示L-Val-L-Val二肽前藥是實(shí)現(xiàn)PepTl介導(dǎo)的腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的有效策略。
[0007] 穩(wěn)定性及藥物突釋/滲漏問(wèn)題是納米膠束給藥系統(tǒng)面臨的又一難題。對(duì)親水端進(jìn) 行PEG化修飾可以一定程度提升膠束在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性;對(duì)于疏水端，以雜化交聯(lián)多聚 氨基酸為內(nèi)核可以有效提升膠束的穩(wěn)定性。雜化交聯(lián)多聚氨基酸內(nèi)核可通過(guò)兩種途徑實(shí) 現(xiàn)：1)通過(guò)含兩個(gè)乃至多個(gè)不同"疏水臂"單一兩親性聚合物分子通過(guò)自組裝得到；2)通過(guò) 兩種或多種含不同疏水端的兩親性聚合物分子按不同比例混合自組裝獲得。前者由于聚合 物分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，合成制備難度較大，質(zhì)量也較難控制，而后者制備較為簡(jiǎn)便。同時(shí)，申 請(qǐng)人前期研究發(fā)現(xiàn)，利用多種不同的兩親性聚合物分子自組裝不僅有助于形成雜化交聯(lián)的 疏水內(nèi)核，同時(shí)也為不同功能基團(tuán)的引入及組合提供了可能，從而為開(kāi)發(fā)多功能納米膠束 給藥系統(tǒng)開(kāi)辟了一條新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明的主要目的是提供一類(lèi)基于肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(PepTl)、雌激素受體 (ER)為靶向的雜合型腫瘤靶向納米膠束和制備方法，及其在腫瘤靶向治療方面的用途。
[0009] 技術(shù)方案:一類(lèi)雜合型腫瘤靶向納米膠束，由聚合物1和聚合物2按物質(zhì)的量比例 1:10~10:1混合自組裝而得，聚合物1和聚合物2的親水端分別為L(zhǎng)-纈氨酸-L-纈氨酸二肽、 雷洛昔芬修飾的聚乙二醇嵌段，疏水端為多聚組氨酸或多聚丙氨酸，結(jié)構(gòu)通式分別如式 (1)、式⑵所示：
[0010]
[0011] 療會(huì)物1結(jié)始誦式
[0012]
[0013] 聚合物2結(jié)構(gòu)通式
[0014] 其中，R為-CH3B
[0015] 聚合物1的制備方法為
先進(jìn)行縮合反應(yīng)，然后 催化加氫將疊氮基還原為胺基，再與L-丙氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐或2,4-二硝基苯基保護(hù)的 組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合，最后脫保護(hù)基得到;RS-Ofei
[0016] 縮合反應(yīng)是在DMAP XH2Cl2存在下，氮?dú)獗Ｗo(hù)中反應(yīng)。
[0017] 催化加氫時(shí)溶劑是CH2C12、乙醇，催化劑為Pd/C。
[0018] 與L-丙氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐保護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合是以DMF為溶劑，氮 氣保護(hù)下反應(yīng);脫保護(hù)基是以CF3COOH為溶劑，CH 2Cl2存在下反應(yīng)得到。
[0019] 與2，4-二硝基苯基保護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合是Na2CO3和無(wú)水DMF，犯保護(hù)下反 應(yīng);脫保護(hù)基是在2 -疏基乙酸和DMF存在下反應(yīng)得到。
[0020] 聚合物2的制備方法為
指化反應(yīng)，再催 化加氫還原后與L-丙氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐或2,4_二硝基苯基保護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán) 聚合得到。
[0021] 2,4_二硝基苯基保護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合是在2-巰基乙酸和DMF存在下反應(yīng) 得到。
[0022] 所述的一類(lèi)雜合型腫瘤靶向納米膠束在制備基于肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、雌激素受體靶向 的雜合型腫瘤靶向藥物中的用途。
[0023]有益效果:雜合型腫瘤靶向納米膠束給藥系統(tǒng)穩(wěn)定性比非雜合型膠束給藥效果顯 著提升，該類(lèi)膠束粒徑在PBS以及血清培養(yǎng)液中96h未見(jiàn)明顯變化;具有酸敏感特性，酸性條 件下藥物釋放率顯著高于正常生理?xiàng)l件下釋放率，提示該給藥系統(tǒng)可于腫瘤酸性微環(huán)境下 靶向釋放治療藥物;該類(lèi)給藥系統(tǒng)對(duì)PepTUER高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株顯現(xiàn)出選擇性細(xì)胞毒 性，而對(duì)正常細(xì)胞以及P印Tl、ER陰性細(xì)胞毒性較低，因而主動(dòng)靶向性及較好的安全性。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明由下述實(shí)施例得到進(jìn)一步說(shuō)明，但這些說(shuō)明并不限制本發(fā)明的實(shí)施。
[0025] 聚合物1和聚合物2按不同的比例混合自組裝而得膠束系統(tǒng)，其中，聚合物1和聚合 物2的親水端分別為L(zhǎng)-纈氨酸-L-纈氨酸二肽、雷洛昔芬修飾的聚乙二醇嵌段，疏水端為多 聚組氨酸或多聚丙氨酸，其結(jié)構(gòu)通式分別如式(1)、式(2)所示：
[0026]
[0027]
[0028] 其中，R為-013或^? m=40~230;n = 5~25。 H ；
[0029] 本發(fā)明的聚合物1和聚合物2的制備方法為反應(yīng)式(I)、（II)所示：

[0034] 反應(yīng)式（II)
[0035] 聚合物1的合成方法包括以下步驟：
[0036]步驟1:將疊氮基保護(hù)的PEG與Boc保護(hù)的L-纈氨酸-L-纈氨酸二肽在縮合劑存在的 條件下反應(yīng)得到二肽修飾的PEG中間體1;
[0037]步驟2:中間體1經(jīng)催化氫化還原得到中間體2;
[0038]步驟3:中間體2與10-40當(dāng)量的L-丙氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐或2,4-二硝基苯基保 護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合得到中間體3或4;
[0039]步驟4:中間體3、4脫保護(hù)基得聚合物1。
[0040]聚合物2的合成方法包括以下步驟：
[0041 ]步驟1:將疊氮基保護(hù)的PEG與原料5反應(yīng)得中間體6;
[0042] 步驟2:中間體6經(jīng)催化氫化還原得到中間體7;
[0043]步驟3:中間體7與10-40當(dāng)量的L-丙氨酸-N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐或2,4-二硝基苯基保 護(hù)的組氨酸內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合得到聚合物2。
[0044]本發(fā)明的雜合型腫瘤靶向納米膠束給藥系統(tǒng)的用途是，該納米膠束系統(tǒng)可包裹疏 水性抗腫瘤藥物，體外研究顯示，該類(lèi)膠束穩(wěn)定性明顯優(yōu)于非雜合型膠束，同時(shí)，相比于單 獨(dú)藥物給藥及非雜合型膠束給藥系統(tǒng)給