一種靶向dna納米探針及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提出一種靶向DNA四面體納米探針的近紅外成像的制備及應(yīng)用，具體涉及將標(biāo)記有特定焚光分子的DNA單鏈，自組裝成DNA四面體，并進(jìn)一步修飾上腫瘤穿透肽，從而實(shí)現(xiàn)具有腦腫瘤靶向性檢測的DNA四面體納米探針。
【背景技術(shù)】
[0002]目前所存在的針對腫瘤檢測的納米探針主要有以下幾類:基于磁性材料的納米探針，這類納米探針主要以鐵或鐵的化合物為基體；基于納米金及其復(fù)合物的檢測探針；以及基于其他無機(jī)納米材料，如碳納米管及其復(fù)合物的納米探針等。這類物質(zhì)通常具有一定的生物毒性，組織相容性較差，代謝困難。因此，制備一種新型的安全的納米檢測探針就成為了當(dāng)務(wù)之急。已有研究將DNA材料作為探針用于腫瘤檢測，通過靶分子與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，提高納米探針的靈敏度(中國發(fā)明專利:一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，公開號:CN102234679A ;中國發(fā)明專利:基于納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基因突變的方法，公開號:CN101392286A)。
[0003]將DNA四面體材料納米探針用于靶向腫瘤的近紅外檢測，不僅生物相溶性好，無細(xì)胞毒性，而且熒光分子以及一些短肽類小分子能夠很容易的修飾在DNA鏈上，這就為DNA靶向納米探針的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，由于堿基的精確配對，DNA材料能夠自組裝成具有一定結(jié)構(gòu)尺寸的三維構(gòu)型，通過調(diào)控納米結(jié)構(gòu)的尺寸以及腫瘤穿透肽的修飾，該納米探針能夠更加容易到達(dá)腫瘤部位并清晰成像，具有較高的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)在腫瘤檢測中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種對腦腫瘤具有靶向作用的納米探針的制備方法及其應(yīng)用。該方法通過在DNA鏈上修飾能夠被近紅外激發(fā)的熒光分子，再設(shè)計(jì)特定的堿基序列，使DNA鏈能夠在一定條件下自組裝成DNA四面體，并進(jìn)一步修飾腫瘤穿透肽，以增強(qiáng)其穿透性和靶向性。本發(fā)明采用DNA材料作為分子探針的基體，具有非常好的生物相容性，配合腦腫瘤穿透肽，能夠有效地穿透腫瘤外圍組織進(jìn)入到腫瘤內(nèi)部，在腦部腫瘤檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種靶向DNA納米探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
步驟一、將標(biāo)記有Cy5的DNA單鏈以及另外三條具有特定堿基序列的DNA鏈加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反應(yīng)，得DNA四面體即TDN ；
步驟二、將上述DNA四面體溶液和一定濃度的腫瘤穿透肽溶液混合，利用click反應(yīng)，合成靶向DNA四面體，即靶向TDN ；
步驟三、將上述靶向DNA四面體溶液加入到濃縮離心管，離心去除反應(yīng)液中殘存的小分子，再將沉淀物重懸在TM buffer (10mM Tris base、50mM MgCl2、pH=8)中，即可得到DNA靶向納米探針。
[0006]步驟一中所述DNA單鏈為可通過堿基互補(bǔ)配對自組裝成DNA四面體三維構(gòu)型的DNA單鏈；所述DNA單鏈的濃度為50 μ M，序列包括如TDN-1、TDN_2、TDN-3、TDN_4所示的序列；所述序列TDN-3后續(xù)可以用Cy5等熒光標(biāo)記，TDN-4后續(xù)可以用N3標(biāo)記。
[0007]步驟一中所述Tris-MgCl；^.#液含 10mM Tris、50mM MgCl 2、pH=8 的水溶液。
[0008]步驟一中所述反應(yīng)具體為:在PCR儀中，反應(yīng)溫度為95°C，10分鐘后快速冷卻至4°C，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。
[0009]步驟一中所述DNA四面體最終濃度為2 μ M。
[0010]步驟二中為保證click反應(yīng)充分進(jìn)行，所述DNA四面體溶液和靶肽溶液中靶肽的摩爾量大于DNA四面體；進(jìn)一步地，所述DNA四面體和靶肽的摩爾比為1:2。
[0011]步驟二中所述反應(yīng)溶液中，PBS溶液(磷酸緩沖溶液)的pH為7.3，0.1 mM的CuS04水溶液，TCEP (三(2-羧乙基)膦)溶液為0.1mM水溶液，TBTA (叔丁基三氯乙酰亞胺酯)溶液為含10 μ Μ TBTA的DMS0 (二甲基亞砜)溶液。
[0012]步驟二中，所述恒溫反應(yīng)的條件具體為:37°C、175rpm震蕩5小時(shí)；步驟三中所述離心采用的轉(zhuǎn)速為6000rpm，采用的離心管為超濾管(0D010C35, 10k, PALL, USA)，離心的目的是去除反應(yīng)液中的殘存的小分子。
[0013]—種靶向DNA納米探針，其特征在于，根據(jù)上述任一所述方法制備得到。
[0014]一種靶向DNA納米探針作為腦腫瘤靶向DNA納米探針在近紅外成像的應(yīng)用。
[0015]由于DNA四面體的小尺寸和較好的生物相容性，本發(fā)明在腫瘤檢測領(lǐng)域有較大的應(yīng)用前景。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明采用DNA材料，通過設(shè)計(jì)不同的堿基序列，可以實(shí)現(xiàn)多種DNA三維結(jié)構(gòu)，并能精確調(diào)控該納米探針的尺寸和構(gòu)型。
[0016]2、本發(fā)明將靶向性小分子與熒光分子同時(shí)引入DNA材料中，使得納米探針能夠兼具尋革E能力和成像的能力。
[0017]3、本發(fā)明使用的DNA材料，具有非常好的生物相容性，避免了因?yàn)榧{米探針聚集可能造成的腦部功能區(qū)的損害。
【附圖說明】
[0018]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯:
圖1為DNA靶向納米探針電泳圖(L2為單鏈DNA，L3為雙鏈DNA，L4為修飾前的DNA四面體，L5-L8為修飾上不同腫瘤穿透肽的DNA四面體)；
圖2為DNA靶向納米探針粒度圖(Ds為雙鏈DNA，TDN為靶肽修飾前的DNA四面體，P-TDN為腫瘤穿透肽修飾的DNA四面體)；
圖3為DNA靶向納米探針體外細(xì)胞激光共聚焦圖；
圖4為DNA材料活體成像圖(從左往右以此是對照組，DNA雙鏈組，DNA四面體組，靶向性DNA四面體組)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]實(shí)施例1:
步驟一:各取 2 μ L 單鏈 DNA (50 yM)TDN-l、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4 加入到 42 μ LTris-MgCl2 (Tris 10mM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中。將混合溶液置于PCR儀中，反應(yīng)溫度為95°C，10分鐘后快速冷卻至4°C，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。DNA單鏈即可通過堿基互補(bǔ)配對自組裝成DNA四面體三維構(gòu)型。
[0021]步驟二:取 180 μ L 的 PBS 溶液(ρΗ7.3)，40 μ L 的 CuS04水溶液(0.1mM)，40 μ L 的TCEP水溶液(0.1mM)以及40 μ L的TBTA溶液(10 μ M，DMSO溶解)配成反應(yīng)液。取100 μ L制備好的TDN溶液(2 μ Μ)和200 μ L氨基酸序列為RGERPPR的靶肽溶液(2 μ Μ)加入到上述反應(yīng)液中，37 °C恒溫175rpm震蕩5小時(shí)后，反應(yīng)完成。
[0022]步驟三:將上述反應(yīng)液加入到超濾管(0D010C35，10k, PALL, USA)中，6000rpm離心去除游離的離子，并將離心后的沉淀物重懸于100 yL的TM buffer中，重懸后，該DNA靶向納米探針的濃度為2 μΜ。反應(yīng)產(chǎn)物的電泳和粒度數(shù)據(jù)分別見圖1和圖2。圖3為體外細(xì)胞激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該納米探針具有良好的靶向性。
[0023]實(shí)施例2:
步驟一:各取 2 μ L 單鏈 DNA(50 yM)TDN-l、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4 加入到 42 μ LTris-MgCl2 (Tris lOmM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中。將混合溶液置于P