一種載阿霉素的主動(dòng)靶向白蛋白納米載體的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤的靶向藥物研究領(lǐng)域，具體涉及一種載阿霉素的主動(dòng)靶向白蛋白納米粒的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥治療的主要目標(biāo)是研制能夠高效殺死腫瘤細(xì)胞的藥物，但對(duì)正常組織產(chǎn)生盡可能小的毒性。其中一個(gè)提高選擇性和效能的方法就是提高藥物對(duì)腫瘤的靶向性?？乖?抗體系統(tǒng)介導(dǎo)的靶向治療主要是利用抗原和抗體之間的特異性識(shí)別機(jī)制將藥物主動(dòng)靶向到特定細(xì)胞從而發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞作用。許多抗體對(duì)大多數(shù)腫瘤如肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等的特異性抗原都具有識(shí)別作用，主要原因在于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的高表達(dá)特點(diǎn)。單克隆抗體作為一種靶向性配體，可以有效識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的受體。將單克隆抗體與納米粒進(jìn)行修飾連接之后可利用其特異性的親和力來(lái)達(dá)到靶向的作用。
[0003]藥物抗體偶聯(lián)物(Antibody Drug Conjugate，ADC)是新一代抗體革E向治療藥物，主要通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法將細(xì)胞毒性藥物連接到單克隆抗體上，可以靶向到血液系統(tǒng)惡性腫瘤和上皮腫瘤表面抗原，主要用于癌癥和腫瘤的治療。藥物抗體偶聯(lián)物(ADC)的優(yōu)勢(shì)是可以有效提高藥物在腫瘤部位的濃度，這樣可以在增強(qiáng)抗腫瘤活性的同時(shí)降低對(duì)正常組織的毒性和免疫反應(yīng)。目前，已有至少25種藥物抗體偶聯(lián)物(ADC)進(jìn)入臨床研究，6種用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療，10種用于固體瘤，2種可以靶向到CD70抗原，用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)和腎細(xì)胞癌。
[0004]盡管目前ADC中所用到的單抗為人源性或嵌合抗體，但仍然存在免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。ADC是一種典型的半抗原-載體抗原，細(xì)胞毒藥物作為其中的半抗原雖然本身沒(méi)有免疫原性，但一旦連接到單抗上，會(huì)引起動(dòng)物的一系列免疫反應(yīng)。此外單個(gè)的抗體-藥物偶聯(lián)物在腫瘤內(nèi)富集低，化學(xué)偶聯(lián)的藥物在血液循環(huán)中不夠穩(wěn)定，釋放出來(lái)的細(xì)胞毒分子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒副作用也使得抗體-藥物偶聯(lián)物達(dá)不到臨床預(yù)期目標(biāo)。
[0005]本發(fā)明的載阿霉素的主動(dòng)靶向白蛋白納米粒利用白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀空隙、靜電力及疏水作用將抗體或抗體-阿霉素偶聯(lián)物吸附連接在納米粒表面，既保有其抗體的主動(dòng)靶向功能和阿霉素的腫瘤殺傷能力，又利用白蛋白納米粒的生物相容性降低載藥系統(tǒng)的免疫原性和毒性，延長(zhǎng)作用時(shí)間，降低藥物的毒副作用。本發(fā)明中用到的制備白蛋白納米粒的方法為去溶劑化法，抗體或抗體-阿霉素偶聯(lián)物與白蛋白納米粒的吸附連接來(lái)達(dá)到主動(dòng)靶向的載藥系統(tǒng)未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供了一種抗體修飾的具有主動(dòng)靶向功能的載阿霉素的白蛋白納米粒的制備方法，在白蛋白納米粒表面吸附連接具有靶向性的抗體或抗體偶聯(lián)阿霉素，已克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明載阿霉素的主動(dòng)靶向白蛋白納米載體的制備，包括如下步驟:
[0008]1)制備濃度為1?5%的白蛋白水溶液，過(guò)0.22 μ m濾膜；
[0009]2)將白蛋白水溶液和0.25?2%鹽酸阿霉素溶液混合，調(diào)節(jié)pH8.0?10.0，室溫調(diào)節(jié)下攪拌1?4 ;所述的白蛋白水溶液與鹽酸阿霉素體積比為1: 1?0.2;
[0010]3)以0.3?lml/min速度滴加無(wú)水乙醇，水溶液與滴加的無(wú)水乙醇的總量的體積比為1: 2?10 ;
[0011]4)加入戊二醛溶液固化12?24h，加入戊二醛與白蛋白的質(zhì)量比為1: 5?20，旋蒸除去乙醇，蒸餾水分散，離心純化，即得載阿霉素的白蛋白納米粒；
[0012]5)不同比例抗體或抗體偶聯(lián)藥物與白蛋白納米?；旌希{(diào)節(jié)pH6.0?10.0，室溫下攪拌3?24h，離心純化，得到的混懸液即為主動(dòng)靶向的載阿霉素白蛋白納米粒。
[0013]所述的白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、重組人血清白蛋白或它們的組合；
[0014]步驟2)和5)中調(diào)節(jié)溶液的pH值，優(yōu)選地，通過(guò)向水溶液中加入的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀中的任意一種或兩種以上的混合物；
[0015]步驟4)和5)中所述離心純化條件為10000?15000rpm，離心時(shí)間10?20min，
離心溫度4°C ;
[0016]所述的抗體偶聯(lián)阿霉素，其特征在于，包括下述步驟:
[0017]1) 1 ?10mg/ml 抗體中加入 100 ?500 μ 1 250mM 硼砂/250mM 氯化鈉和 300 μ LlOOmM二硫蘇糖醇(pH 8.0)，37°C孵育30?60min，超濾離心脫鹽，純化還原的抗體，調(diào)整抗體濃度1?4mg/ml ；
[0018]2)向抗體溶液中加入5mg/ml的6-馬來(lái)酰亞胺基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對(duì)氨基苯甲酯-阿霉素(MC-Val-Cit-PAB-DOX) /DMF (0.1?1ml，冰上靜置0.5?2h，加入490 μ 1半胱氨酸(10mg/ml，二乙烯三胺五乙酸/PBS)，再靜置45min。超濾離心脫鹽，即得到抗體偶聯(lián)阿霉素；
[0019]所述單克隆抗體為抗EGFR、Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13 或 CD22 單抗；優(yōu)選為抗EGFR或⑶20單抗；
[0020]所述的超濾離心純化條件為3000?5000rpm，離心時(shí)間10?60min，離心溫度
4°C ；
[0021]所述的納米粒子在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞RK0生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0023]1)本發(fā)明用無(wú)毒無(wú)刺激的白蛋白納米粒包裹阿霉素可以起到緩釋作用，并在其外部吸附連接抗體或抗體偶聯(lián)藥物，增加了其靶向性和對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力；
[0024]2)本發(fā)明通過(guò)白蛋白的疏水作用和靜電力吸附抗體，不僅可以提高靶向性，還降低了抗體的免疫原性，同時(shí)不會(huì)阻礙抗體與特異性抗原的結(jié)合位點(diǎn)，保證了抗體的活性。使其能夠持續(xù)高效的進(jìn)行基因治療作用，這也是本課題的創(chuàng)新之一。
[0025]3)我們選擇了已經(jīng)商品化的并已應(yīng)用于臨床的單克隆抗體，如西妥昔單抗與白蛋白納米球吸附連接，既能起到靶向癌組織的作用，又能競(jìng)爭(zhēng)性抑制配體與特異性抗原結(jié)合起到治療作用。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為實(shí)施例2步驟⑴所得白蛋白納米粒粒徑分布圖
[0027]圖2為實(shí)施例2步驟(2)所得西妥昔單抗-二肽阿霉素-白蛋白納米粒粒徑分布圖
[0028]圖3為實(shí)施例2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0029]圖4為實(shí)施例2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但需要指出的是，以下實(shí)施例不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0031]實(shí)施例1
[0032](1)制備載阿霉素納米粒:40mg白蛋白溶于2ml水中，過(guò)0.22 μ m濾膜；加入800 μ 1 0.5%鹽酸阿霉素溶液中，再加入0.05mo