一種腫瘤藥物靶向載體及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物靶向載體及這種載體與抗腫瘤藥物的偶聯(lián)，以及所形成的一種抗腫瘤藥物。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤已經成為當今威脅人類身體健康的重要疾病之一，全世界每年新增癌癥病人在1000萬以上，控制癌癥已成為全球性衛(wèi)生戰(zhàn)略重點?；瘜W治療方法依然是治療惡性腫瘤的主要手段之一，傳統(tǒng)的化學治療方法主要是使用化學藥物，如抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin, D0X)，來抑制腫瘤細胞的增殖并殺死腫瘤細胞，但大多數的化療藥物都沒有專一性，會在抑制腫瘤組織的同時也損傷正常組織，所以，具有不可忽視的毒副作用，如造成免疫功能下降、骨髓抑制、心臟和肝臟毒性等。
[0003]為了克服化學藥物治療方面存在的不足，提高化學治療藥物的靶向性一一增加腫瘤組織的藥物積累，降低藥物在正常組織周圍的分布一一是提高抗腫瘤效果的有效途徑之一。為了提高抗腫瘤藥物的靶向性，目前常用的方法是將抗腫瘤藥物和不同的藥物載體相結合，通過對藥物載體進行適當的修飾，來提高藥物載體靶向運輸的能力，從而達到靶向治療的目的。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明提供一種腫瘤藥物靶向載體，同時本發(fā)明也提供了這種藥物載體與其它抗腫瘤藥物偶聯(lián)的方式，以及由這一載體與一種具體的現(xiàn)有抗腫瘤藥物偶聯(lián)形成的抗腫瘤藥物。
[0005]本發(fā)明所述的這種腫瘤藥物靶向載體為口蹄疫病毒樣顆粒。
[0006]本發(fā)明的腫瘤藥物靶向載體與抗腫瘤化學藥物的化學偶聯(lián)方法是:用碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)化學偶聯(lián)試劑活化腫瘤藥物載體，然后再與其它抗腫瘤藥物偶聯(lián)。
[0007]本發(fā)明所用的腫瘤藥物靶向載體與抗腫瘤化學藥物的化學偶聯(lián)方法是:將口蹄疫病毒樣顆粒加入到由2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液溶解的碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合物中，在規(guī)定的時間內加入抗腫瘤藥物進行偶聯(lián)，偶聯(lián)后將混合物轉入組裝緩沖液中，在組裝緩沖液進行透析處理，所用的緩沖液為pH=8.0，由40 mM Tris-HCl,500 mM NaCl和10 mM CaCl2組成，經處理后偶聯(lián)上抗腫瘤藥物的口蹄疫病毒樣顆粒滯留在透析袋內。
[0008]本發(fā)明的腫瘤藥物靶向載體與抗腫瘤化學藥物的一種具體化學偶聯(lián)方法是:配制0.2 mol/L MES, I mol/L NaCl，pH 6.0 的 2_(N_ 嗎啉)乙磺酸溶液；取0.5 ml 的 2_(N_ 嗎啉)乙磺酸溶液在其中溶入0.4 mg碳二亞胺，另取0.5 ml的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液在其中溶入0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺，依次將溶入碳二亞胺的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液和溶入N-羥基琥珀酰亞胺的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液加入到Iml濃度為2mg/ml的口蹄疫病毒樣顆粒溶液中，室溫下活化15分鐘，然后加入30 μ?濃度為5 mg/ml的D0X，調節(jié)pH=8.0，室溫偶聯(lián)15分鐘，隨后將反應物轉入8000 MWCO的透析袋中進行透析，除去未偶聯(lián)的物質得到目標物。
[0009]在眾多藥物載體中，病毒樣顆粒(virus/virus-like particles，VLPsMtS—種自組裝的天然納米級生物材料，除了具有較大的表面積確保載藥量的最大化、可通過緩釋承載藥物發(fā)揮持續(xù)治療效果之外，由于病毒樣顆粒在結構上和病毒粒子相同或相近，能夠模擬自然病毒粒子利用特異受體與宿主細胞結合，而這些特異受體在腫瘤細胞中的表達水平顯著提高，這為病毒樣顆粒作為腫瘤藥物載體的靶向優(yōu)勢提供了前提條件，從而保證攜帶的藥物選擇性進入細胞內部、發(fā)揮理想藥效。
[0010]本發(fā)明以口蹄疫病毒樣顆粒作為藥物載體，通過優(yōu)化的化學方法將其與抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)偶聯(lián)，形成口蹄疫病毒樣顆粒-阿霉素(FMD VLP-DOX)偶聯(lián)物，借助于口蹄疫病毒樣顆粒VPl中的RGD基序和腫瘤細胞表面過量表達的整合素受體結合，基于腫瘤細胞表面受體革E向定位于腫瘤細胞，可參考Mehra NK, Mishra V, Jain NK.,et al.Receptor-based targeting of therapeutics.Therapeutic delivery, Mar2013; 4 (3):369-394.，減小抗腫瘤藥物對正常細胞的毒副作用。
[0011]為了提高抗腫瘤藥物的靶向治療作用，首次將抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)和口蹄疫病毒樣顆粒(FMDVLP)體外偶聯(lián)，利用病毒樣顆粒和口蹄疫病毒粒子在結構和生物特性上的相似性，借助口蹄疫病毒樣顆粒表面的保守肽段一RGD和腫瘤細胞表面過量表達的整合素受體(integrin receptors)特異性結合，充分發(fā)揮FMDV-VLP雙功能分子的作用--既是藥物運載功能，又有靶向定位腫瘤細胞的功能。
[0012]其次本發(fā)明對偶聯(lián)的方法進行了摸索和改進，通過提高溫度，縮短了偶聯(lián)時間，本發(fā)明在室溫下半小時就可以完成全部偶聯(lián)反應，而之前的偶聯(lián)要在4°C過夜才能完成偶聯(lián)反應(參見 Aljabali AA, Shukla S，Lomonossoff GP, Steinmetz NF, Evans DJ (2013)CPMV-DOX delivers.Mol Pharm 10: 3-10 和 Ashley CE, Carnes EC, Phillips GK,Durfee PN, Buley MD, et al.(2011) Cell-specific delivery of diverse cargos bybacter1phage MS2 virus-like particles.ACS Nano 5: 5729-5745.)。
[0013]將口蹄疫病毒樣顆粒作為阿霉素的藥物載體，可用于腫瘤細胞治療。整合素受體已經被廣泛修飾在各種腫瘤藥物載體表面，從而來介導靶向運輸抗腫瘤藥物到腫瘤細胞，關于整合素受體在癌癥治療中的應用可以參考Mehra，N.K., Mishra, V., Jain,N.K., 2013.Receptor-based targeting of therapeutics.Therapeutic delivery 4,369-394.由于組裝口蹄疫病毒樣顆粒的VPl蛋白中有RGD基序，能夠和腫瘤細胞表面過量表達的整合素受體特異性結合，從而發(fā)揮口蹄疫病毒樣顆粒的藥物載體作用，且無須對其表面進行靶向修飾，以此有效提高阿霉素的靶向治療作用。在本發(fā)明中，利用口蹄疫病毒樣顆粒自身所含有的RGD基序，作為靶向識別腫瘤細胞表面過量表達的整合素受體，這樣就只需要一步偶聯(lián)就可以得到靶向藥物運載體，簡化了其他藥物運載體先偶聯(lián)藥物再對載體進行表面修飾的復雜過程，而且病毒樣顆粒作為一種納米級生物材料，綜合了納米材料和生物材料的優(yōu)勢，能夠靶向運載藥物并且可以起到藥物緩釋的作用。
【附圖說明】
[0014]附圖1電泳圖，其中:A圖，SDS-PAGE，Ianel純化前蛋白，lane2切除HIS標簽的衣殼蛋白，lane3偶聯(lián)DOX后的衣殼蛋白，lane4標準蛋白maker。B圖為紫外下圖像，由于偶聯(lián)了 D0X，所以在紫外下有條帶。C圖核酸電泳，未進行考馬斯亮藍染色，紫外下觀察，Ianel為DOX，lane2為偶聯(lián)前的病毒樣顆粒，lane3為偶聯(lián)后的病毒樣顆粒。D圖是考馬斯亮藍染色后，只有l(wèi)ane2和lane3有條帶。說明病毒樣顆粒偶聯(lián)DOX后，分子量變大，在核酸電泳中和未偶聯(lián)DOX的相比，位置后移。
[0015]附圖2紫外連續(xù)光譜掃描結果曲線圖，圖中可見偶聯(lián)物在270nm處和495nm有吸收峰。
[0016]附圖3電鏡照片，顯示偶聯(lián)DOX后，病毒樣顆粒的組裝情況。
[0017]附圖4不同梯度濃度下，進行的細胞毒性試驗，偶聯(lián)物中含有的DOX和單獨使用DOX的濃度一樣。
[0018]附圖5偶聯(lián)物進入細胞情況進行示蹤的熒光照片，從30min到2h，DAPI是核染料4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚對細胞核進行染色，560nm處激發(fā)的是FMDV-VLP 二抗FITC的熒光，用于示蹤口蹄疫病毒樣顆粒，495nm處是DOX激發(fā)后發(fā)出的紅光，merge是三者的合并后的情況。
[0019]附圖6對照組DOX進入細胞的情況。DAPI是核染料4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚對細胞核進行染色，495nm是DOX激發(fā)后發(fā)出的紅光，merge是兩者合并后的圖片。
[0020]附圖7偶聯(lián)物與腫瘤細胞作用48h后，腫瘤細胞狀況照片，DAPI是核染料4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚對細胞核進行染色，495nm處是DOX激發(fā)后發(fā)出的紅光，merge是三者的合并后的情況。
【具體實施方式】
[0021]以下結合實施例對本發(fā)明進行解說。
[0022]1.FMDV-VLP 與 DOX 的化學偶聯(lián)。
[0023]將0.4 mg碳二亞胺和0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺分別溶解到各0.5 ml 2- (N-嗎啉)乙磺酸溶液中(0.2 mol/L MES, I mol/L NaCl，pH 6.0)，依次加入到Iml濃度為2mg/ml的口蹄疫病毒樣顆粒溶液中，室溫下活化15分鐘，然后加入30 μ?濃度為5 mg/ml的D0X,調節(jié)pH=8.0，室溫下偶聯(lián)15分鐘，隨后將混合物轉入8000 MWCO的透析袋中進行透析，4° C過夜并換2-3次透析液，除去未偶聯(lián)的物質得到目標物。所使用的透析緩沖液為:40mM Tris-HCl，500mM NaCl,1mM CaCl2, pH=8.0。
[0024]2.FMDV-VLP-DOX偶聯(lián)物性質的測定。
[0025]用12% 的 SDS-PAGE 和 0.8% 的 Agarose gel electrophoresis 分別檢測偶聯(lián)物是否獲得，用紫外連續(xù)吸收光譜來檢測偶聯(lián)物的吸光率變化，并用電鏡對偶聯(lián)物的形態(tài)進行觀測，結果表明，帶