專利名稱：：減毒的遺傳修飾腫瘤靶向細菌的制作方法本申請是1997年9月10日提交的申請系列號No．08／926，636的部分繼續(xù)申請，該申請在此全文引入作為參考。1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種沙門氏菌基因的分離，該基因在被遺傳破壞時，能同時降低由這種生物引起的毒性和敗血癥休克，并提高其對促進這種細菌消除的試劑如螯合劑的敏感性。本發(fā)明提供這種基因的序列和對其進行遺傳破壞的方法，并介紹使用在該基因中有破壞的腫瘤靶向細菌來抑制癌癥(包括但不限于黑素瘤、結(jié)腸癌和其他實體瘤)生長的例子。本發(fā)明還提供該基因遺傳破壞與一種營養(yǎng)缺陷型基因破壞的組合。2．發(fā)明背景第2部分或本申請的其他部分對任何參考文獻的引用或注明并不意味著這些參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。實體瘤癌癥的化學療法中的一個主要難題是，傳遞足夠濃度的治療試劑例如藥物來消除腫瘤細胞，同時減少對正常細胞的損傷。因此，許多實驗室的研究都針對生物傳遞系統(tǒng)的設計，例如用來將藥物、藥物前體轉(zhuǎn)化酶、和／或基因靶向轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞的抗體、細胞因子、和病毒。Houghton和Colt，癌癥診斷和治療的新視角165-70；dePalazzo，eta1．，1992a，細胞免疫142338-347；dePalazzoetal．，1992b，癌癥研究525713-5719；Weiner，eta1．，1993a，免疫治療雜志13110-116；Weinereta1．，1993b，免疫學雜志1512877-2886；Adamsetal．，1993，癌癥研究534026-4034；Fangeretal．，1990，F(xiàn)ASEBJ．42846-2849；Fangeretal．，1991，今日免疫學1251-54；Segal，etal．，1991，紐約科學院年評636288-294；Segaletal．，1992，免疫生物學185390-402；Wunderlichetal．，1992；Intl．J．Clin．Lab．Res．2217-20；Georgeetal．，1994，免疫學雜志1521802-1811；Hustonetal．，1993，Intl．Rev．Immunol．10195-217；Staffordetal．，1993，癌癥研究534026-4034；Haberetal．，1992，紐約科學院年評667365-381；FelonerandRhodes，1991，自然349351-352；SarverandRossi，1993，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒9483-487；LevineandFriedmann，1993，美國兒童病學雜志1471167-1176；Friedmann，1993，分子遺傳醫(yī)學31-32；GilboaandSmith，1994，遺傳學趨勢10139-144；Saitoetal．，1994，癌癥研究543516-3520；Lietal．，1994，血液833403-3408；Viewegetal．，1994，癌癥研究541760-1765；Linetal．，1994，科學265666-669；Luetal．，1994，人類基因治療5203-298；Gansbacheretal．，1992，血液802817-2815；Gastletal．，1992，癌癥研究526229-6236．2．1細菌感染和癌癥關(guān)于細菌和癌癥，一篇歷史綜述揭示了大量的臨床觀察，這些臨床病例報告，在患有細菌感染的病人體內(nèi)，腫瘤萎縮了。Nautsetal．，1953，ActaMedica．Scandinavica1451-1-2，(Suppl．276)陳述道通過注射細菌產(chǎn)物來治療癌癥基于以下事實，200多年來，已經(jīng)觀察到腫瘤在急性感染主要是鏈球菌感染后萎縮。如果這些病例不是過于晚期，并且感染足夠嚴重和持久，腫瘤將完全消失，病人將不會再復發(fā)。Shear，1950，J．A．M．A．142383-390(Shear)觀察到，在Boston兒童醫(yī)院中，未經(jīng)治療而自發(fā)緩解的白血病例中，75％發(fā)生在急性細菌感染事件之后。Shear提出了以下問題病原性和非病原性生物是自然控制惡性疾病的顯微病灶之一嗎在控制感染性疾病取得進步的過程中，我們是否正在解除癌癥的一種自然控制隨后來自大量研究實驗室的證據(jù)指出，至少某些抗癌效應是通過刺激宿主免疫系統(tǒng)介導的，導致對癌細胞免疫排斥的增強。例如，革蘭氏陰性細菌如沙門氏菌釋放脂多糖(LPS)內(nèi)毒素會激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的細胞如巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子---TNF，Christetal．，1995，Science26880-83。TNF水平的升高接著引發(fā)細胞因子介導的級聯(lián)反應，最終導致腫瘤細胞的死亡。關(guān)于這一點，Carswelletal．，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA723666-3669，證明，用細菌卡介苗(BCG)注射小鼠能提高TNF的血清水平，并且TNF陽性血清能導致小鼠中肉瘤MethA和其他移植腫瘤的壞死。而且，Klimpeletal．，1990，免疫學雜志145711-717，顯示，體外感染志賀氏菌或沙門氏菌的成纖維細胞對TNF的敏感性提高。由于上面介紹的這些觀察結(jié)果，用注射BCG來為癌癥病人進行免疫接種目前正用于某些癌癥的治療過程。見，Sosnowski，1994，Compr．Ther．20695-701；BarthandMorton，1995，Cancer75(Suppl．2)726-734；Friberg，1993，Med．Oncol．Tumor．Pharmacother．1031-36的對BCG療法的綜述。2．寄生物和癌細胞雖然寄生物的天然生物特異性和進化上的適應性已經(jīng)被認識了一段時間，并且已有人建議將它們的特殊系統(tǒng)用作新治療方法的模型，但很少有報告或建議真正將寄生物用作載體。Leeetal．，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA891847-1851(Leeetal．)和Joneetal．，1992，Infect．Immun．602475-2480(Jonesetal．)分離了傷寒沙門氏菌的突變體，這類突變體能在體外以比野生型菌株大得多的數(shù)量入侵HEp-2細胞(人表皮樣癌)?！案咔忠u性”突變體是在細菌的有氧生長條件下分離的，這種條件通常抑制野生型菌株侵入HEp-2動物細胞的能力。但是，Lee等人和Jone等人并沒有提出使用這種突變體作為治療載體，也沒有提出，通過篩選與機體的正常細胞相比優(yōu)先感染黑素瘤或其他癌細胞的突變體，來分離腫瘤特異性的細菌。沒有腫瘤特異性或其他形式的減毒，像Lee等人和Jones等人介紹的這種高侵襲性傷寒沙門氏菌很可能是泛侵襲性的，在癌癥病人中將導致廣泛的感染。2．3腫瘤靶向的細菌已經(jīng)證明，遺傳工程改造的沙門氏菌能夠靶向腫瘤，具有抗腫瘤活性，并可用于將效應基因如單純皰疹胸苷激酶(HSVTK)傳遞至實體瘤(Paweleketal．，W096／40238)。體內(nèi)使用細菌明顯要考慮的兩個因素是它們的毒性和誘導腫瘤壞死因子α(TNFα)介導的敗血癥休克的能力。因為TNFα介導的敗血癥休克是與細菌有關(guān)的考慮中首要的東西之一，能減少這種形式免疫應答的修飾將十分有用，因為TNFα水平將不再變得有毒性，而更有效濃度和／或持續(xù)時間的治療載體將可以使用。2．4修飾的細菌類脂A對腫瘤靶向細菌的脂類組分進行修飾，通過產(chǎn)生TNFα誘導產(chǎn)量降低來改變免疫應答，這是由Pawelek等人提出的(Pawelek等，WO96／40238)。Pawelek等提供了從紅細菌中分離負責單磷酰類脂A(MLA)產(chǎn)生的基因的方法。MLA的作用是敗血癥的一種拮抗物。Pawelek等還提出類脂A生物合成途徑中遺傳修飾的使用，包括firA突變，firA編碼類脂A生物合成的第三個酶---UDP-3-O(R-30羥基豆蔻酰)-葡糖胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Kelley等，1993，J．Biol．Chem．26819866-19874)。Pawelek等人顯示，firA基因中的突變誘導低水平的TNFα。但是這些作者沒有提出修飾類脂A分子中豆蔻酸部分的酶。而且，Pawelek等人并沒有提出，對細菌脂類成分的修飾將改變它們對特定試劑如螯合劑的敏感性。在大腸桿菌中，負責類脂A末端豆蔻?；膍sbB(mlt)基因已被鑒定(Engeletal．，1992，J．Bacteriol．1746394-6403；KarowandGeorgopoulos1992，J．Bacteriol．174702-710；Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。該基因的遺傳破壞將導致穩(wěn)定的、不受環(huán)境影響的突變，這種突變可降低TNFα的誘導(Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。但是，這些參考文獻并沒有提出，腫瘤靶向的沙門氏菌載體中msbB基因的破壞將產(chǎn)生這樣一種細菌，它具有較低毒性，并對螯合劑更加敏感。與細菌用作基因傳遞載體有關(guān)的難題集中在，細菌普遍具有直接殺傷正常哺乳動物細胞的能力，并且它們具有通過TNFα過分刺激免疫系統(tǒng)的能力，這種對免疫系統(tǒng)的過分刺激對宿主具有毒性效果(Bone，1992JAMA2683452-3455；Dinarelloetal．，1993JAMA2691829-1835)。除了這些因素，對抗生素的抗性使得對付人體中細菌的存在大大復雜化(TschapE，1996，DTWDtschTierarztlWochenschr1996103273-7；Ramosetal．，1996，EnfermInfec．Microbiol．Clin．14345-51)。Hone和Powell，WO97／18837(“HomeandPowell”)公開了制備具有非致熱原類脂A或LPS的革蘭氏陰性菌的方法。雖然Hone和Powell泛泛地斷言，在多種基因包括msbB、kdsA、kdsB、kdtA和htrB等等中的條件突變，可被引入大范圍的、不同種類的革蘭氏陰性菌中，包括大腸桿菌、各種志賀氏菌、各種沙門氏菌等等，但所舉的惟一突變的例子是將一個htrB突變引入大腸桿菌中。而且，雖然Hone和Powell提出了在msbB基因中有一個突變的非致熱原沙門氏菌的治療用途，但卻沒有如何完成這種用途的介紹。而且，Hone和Powell僅提出將非致熱原細菌用于疫苗目的。疫苗載體的目標與本申請的腫瘤靶向載體有明顯的不同。因此，疫苗載體的要求與腫瘤靶向載體也明顯不同。疫苗載體的目的是引發(fā)一種免疫應答。一種優(yōu)選的細菌活疫苗應具有免疫原性，使它能引發(fā)保護性免疫；但疫苗不能在體內(nèi)過量生長，因為這樣會導致有害反應。根據(jù)Hone和Powell的技術(shù)，一種合適的細菌疫苗載體是溫度敏感型的，在機體溫度的正常生理范圍內(nèi)沒有復制能力。相反，優(yōu)選的腫瘤靶向寄生性載體，例如但不限于沙門氏菌，能被機體的正常組織安全地耐受，使免疫原性受到限制，而載體靶向腫瘤并在其中自由復制。因此，在正常機體溫度下復制最小的疫苗載體將不適合用作腫瘤靶向載體。腫瘤特異性沙門氏菌株的優(yōu)選特性包括1)血清抗性，允許寄生物在尋找腫瘤的過程中穿過血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)，2)兼性厭氧，即能在厭氧或有氧條件生長，使之能在含氧量低的大的壞死性腫瘤中以及含氧量較高的小的轉(zhuǎn)移性腫瘤中增殖，3)對宿主的防御能力敏感，這樣可限制其在正常組織中的復制，但在腫瘤中不受限制，因為腫瘤中的宿主防御能力已被損壞，4)毒性降低，這樣可提高對宿主防御的敏感性，寄生物能被宿主耐受，但不限制其在腫瘤中復制，5)針對腫瘤細胞的侵襲能力，有助于腫瘤靶向和抗瘤活性，6)運動性，有助于穿透腫瘤，7)抗生素敏感，用于在治療中控制和在治療后清除(例如對氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感)，并缺少抗生素抗性標記，諸如那些用于菌株構(gòu)建的抗性標記，以及8)較低的原養(yǎng)型回復率，有助于在接受個體中的安全性。3．發(fā)明簡述本發(fā)明提供一種提高腫瘤靶向細菌安全性的方法，例如通過類脂A分子的遺傳修飾。本發(fā)明的修飾的腫瘤靶向細菌誘導的TNFα少于野生型細菌，并且與野生型細菌相比，直接殺死正常哺乳動物細胞或引起全身性疾病的能力降低。本發(fā)明的修飾的腫瘤靶向細菌具有提高的治療效果，即由于其誘導的TNFα和全身性疾病較少，毒性低，可以使用更為有效的劑量的細菌和更長的時間。本發(fā)明提供在細菌如沙門氏菌中進行msbB基因的遺傳破壞的組合物和方法，這種破壞導致細菌如沙門氏菌與野生型細菌相比，具有較低的TNFα誘導能力和毒性。在一個實施方案中，本發(fā)明提供篩選msbB基因的遺傳破壞的改進方法。此外，與攜帶野生型msbB基因的細菌相比，遺傳修飾的細菌對螯合劑的敏感性升高。在一個優(yōu)選實施方案中，具有一種被破壞的msbB基因的沙門氏菌對腫瘤組織具有高侵襲性，它能夠在腫瘤中復制，并可用于抑制肉瘤、癌、淋巴瘤或其他實體瘤癌癥如生殖系腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤的生長和／或減少腫瘤體積，所述癌癥包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星型細胞瘤、神經(jīng)蝕質(zhì)瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。在本發(fā)明的一個實施方案中，細菌用其他方法減毒，包括但不限于導致營養(yǎng)缺陷型的生物合成途徑突變。在一個具體實施方案中，這種生物合成途徑突變是一種purⅠ基因的遺傳破壞。在另一個實施方案中，細菌表達藥物前體轉(zhuǎn)化酶，包括但不限于HSV-TK、胞嘧啶脫氨酶(CD)和p450氧化還原酶。本發(fā)明還提供用于終止治療和治療終止后增加敏感性的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，帶有遺傳修飾的類脂A的腫瘤靶向細菌對特定試劑如螯合劑的敏感性也增加。用這種方法對腫瘤靶向細菌進行修飾有更進一步的優(yōu)越性，因為這增加了用有抗生素樣效果的試劑如螯合劑去除細菌的能力，這種螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和檸檬酸鈉。因此，通過外源方法增加消除細菌的能力的修飾將非常有用，所述外源方法如給予一種遺傳修飾的細菌比相應的野生型菌株對其更為敏感的試劑。本發(fā)明進一步提供一種在msbB基因及一種營養(yǎng)缺陷型基因兩者中都有刪除突變的沙門氏菌株。在一個具體實施方案中，該營養(yǎng)缺陷型刪除突變影響purⅠ基因。在一個優(yōu)選實施方案中，這些突變導致菌株的安全性提高。在另一個優(yōu)選的實施方案中，菌株還攜帶這里介紹的其他突變，這些突變可提高菌株的效率，而對其安全性則無關(guān)緊要。4．定義用于此處，沙門氏菌包括所有種類的沙門氏菌，包括傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。此處也包括沙門氏菌的各血清型，例如鼠傷寒，它是腸炎沙門氏菌的一個亞類，通常被稱為鼠傷寒沙門氏菌?！皽p毒”減毒是一種使微生物或載體具有較低病原性的修飾。減毒的最終結(jié)果是，當微生物或載體接種給予病人時，毒性以及其他副作用的危險降低。毒性毒性是一個有相對含義的詞，用來描述導致疾病的一般能力，包括殺死正常細胞的能力或誘發(fā)敗血癥休克的能力(見下面的專門定義)。敗血癥休克敗血癥休克是一種由復雜的細胞因子級聯(lián)反應造成的體內(nèi)器官衰竭癥狀，它主要由TNFα引發(fā)。一種微生物或載體誘導TNFα的相對能力被用作一種測量指標，來說明其誘導敗血癥休克的相對能力。螯合劑敏感性螯合劑敏感性被定義為，細菌繁殖受到影響的有效濃度，或細菌存活性被降低的濃度，細菌存活性可用復蘇的菌落形成單位(c．f．u．)來確定。5．附圖簡述本發(fā)明可參考下面的詳細介紹、具體實施方案的說明性實施例以及附圖來更全面理解。圖1。沙門氏菌野生型(WT)14028的msbB基因的全DNA序列(SEQIDNO1)以及推導的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖2A-2C。用克隆的沙門氏菌WT14028msbB基因制備的敲除結(jié)構(gòu)物?？寺』蛴肧phⅠ和MluⅠ酶切來去掉大約一半的msbB編碼序列，然后將來自AatⅡ和AvaⅠ酶切的pBR322的四環(huán)素抗性基因(TET)，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段進行平端化后，插入該基因。A=敲除結(jié)構(gòu)物。B=沙門氏菌msbB的染色體拷貝。C=同源重組后沙門氏菌msbB的被破壞的染色體拷貝。圖中還顯示了起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)以及AseⅠ、BamHⅠ、SphⅠ、MluⅠ和EcoRⅤ的酶切位點。圖中還標出了產(chǎn)生野生型或破壞的msbB的不同大小PGR產(chǎn)物的兩條引物，P1和P2。圖3A-3C。染色體上被破壞的沙門氏菌WT14028msbB的Southern印跡分析。A)使用四環(huán)素基因為探針進行的Southern印跡，證明它在質(zhì)粒結(jié)構(gòu)物和兩個克隆中存在，在WT14028細菌中不存在。B)使用32-P標記的、來自克隆的msbB的AseⅠ／BamHⅠ片段為探針，用相似凝膠進行的Southern印跡。AseⅠ酶的切點在msbB的上游，在野生型中BamHⅠ在一個位置切割，但在四環(huán)素基因中，它在第二個位置上切割，這將產(chǎn)生一個更高分子量的產(chǎn)物。泳道1(K0)顯示敲除結(jié)構(gòu)物中該條帶的位置，與此相比較的是泳道2(WT)中的WT14028。泳道3和4顯示具有更高分子量產(chǎn)物的克隆YS8211和YS861。C)使用32-P標記的、來自克隆的msbB的mluⅠ片段為探針，用相似凝膠進行的Southern印跡。詳見正文章節(jié)7．2。圖4?；畹纳抽T氏菌WT14028在小鼠中的TNFα誘導。野生型或msbB-破壞菌株按溶于0．1cc磷酸緩沖鹽水中的1×108活菌的劑量經(jīng)靜脈注射于Balb／c小鼠的尾靜脈中。條形圖用誤差條表明TNFα的誘導。與沙門氏菌WT14028相比，克隆YS8211誘導32％的TNFα。圖5。Sinclair豬對活的沙門氏菌WT14028和msbB-克隆YS8212的TNFα應答。在靜脈導入1×109c．f．u．沙門氏菌WT14028和YS82121．5和6．0小時后，測量TNFα水平。在1．5小時，msbB刪除突變型與野生型相比，TNFα應答明顯低(p≤0．011)。圖6A-6B。來自WT14028和msbB-克隆YS8212的LPS誘導的呼吸水平改變。Sinclair豬用A)5ug／kg的純化LPS或B)500ug／kg的純化LPS注射，并測量呼吸速率。500ug／kg來自沙門氏菌WT14028的LPS能提高呼吸速率，比正常情況下提高4倍，而在msbB-LPS處理的動物中呼吸速率的提高則少于2倍。圖7。活的沙門氏菌WT14028對人單核細胞的TNFα誘導。將分離自外周血的人單核細胞用c．f．u．數(shù)量不斷增加的沙門氏菌處理。在1．0×105c．f．u．時，WT14028誘導的TNFα濃度比由多種msbB-克隆即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170誘導的要高3倍。圖8。人單核細胞的TNFα產(chǎn)生。分離自外周血的人單核細胞用數(shù)量不斷增加的純化LPS處理。少至1納克的來自野生型的LPS就足以誘導可以測量的TNFα應答，并在10ng達到最高。與此相對，100ug的來自每種msbB-克隆的LPS都不足以誘導任何應答。因此，在10ngLPS水平，沙門氏菌WT14028誘導的TNFα濃度至少比獨立的msbB敲除即YS7216和YS8211及其衍生物即YS1170、YS8644、YS1604、YS8212、YS8658、YS1601、YS1629誘導的TNFα濃度高105倍。圖9A-9B。分別注射了2×107或1×109活菌的小鼠和Sinclair豬的存活。A)WT14028在4天內(nèi)殺死所有的小鼠，而msbB-克隆YS862處理的小鼠在20天后有90％存活。B)與此相似，WT14028在3天內(nèi)殺死所有的豬，而msbB-克隆YS8212處理的豬在20天后100％存活。圖10。msbB-沙門氏菌YS8211在B16F10黑素瘤腫瘤中的生物分布。在5天內(nèi)，腫瘤中的msbB-沙門氏菌與肝臟中的比例超過1000∶1。圖11。msbB-沙門氏菌的腫瘤抑制作用。將B16F10黑素瘤腫瘤移植到C57BL／6小鼠的體側(cè)，并讓其生長至第8天。小鼠不接受細菌(對照)或接受msbB-菌株YS8211、YS8212、YS7216、YS1629處理。兩種菌株---YS8211和YS1629能明顯抑制腫瘤的發(fā)展，而菌株YS7216和YS8212則不能。圖12A-12B。WT14028和msbB破壞的細菌對螯合劑的敏感性。在存在或不存在1mMEDTA(圖12A)的條件下，或者在存在或不存在10mM檸檬酸鈉(圖12B)的條件下，在無氯化鈉的LB培養(yǎng)基(LB-zero)中，培養(yǎng)野生型和msbB破壞型沙門氏菌克隆YS8211和YS862。以時間為變量測量0D600并作圖。與msbB-菌株相比，msbB+菌株顯示幾乎不被EDTA或檸檬酸鈉抑制，而msbB-菌株顯示在EDTA或檸檬酸鈉處理3小時后，生長幾乎完全停止。圖13A-13B。msbB-細菌在鼠巨噬細胞中的存活。以鼠骨髓來源的巨噬細胞(圖13A)和一種小鼠巨噬細胞系---J774(圖13B)作為宿主，用于細菌內(nèi)在化和按時間進行定量。數(shù)據(jù)以原始c．f．u．的百分數(shù)形式表示。圖14。使用攜帶第二個版本的msbB-(msbB2(△)ampRsacB+)的陽性選擇性自殺載體pCV0442，進行msbB1(△)tet至tets的轉(zhuǎn)化。圖15。由野生型鼠傷寒沙門氏菌衍生出菌株YS1456的示意圖。詳見正文章節(jié)8．1。圖16。由野生型鼠傷寒沙門氏菌衍生出菌株YS1646的示意圖。詳見正文章節(jié)8．2。圖17。YS1646劑量對B16-B10小鼠黑素瘤生長的影響。圖18。致死感染后，YS1646誘導的死亡率的抗生素抑制作用。6．發(fā)明詳述本發(fā)明基于一種沙門氏菌基因即msbB的分離，這種基因在以正常形式存在時，其作用為TNFα的誘導、一般毒性、巨噬細胞內(nèi)存活，以及對特定試劑不敏感，這些特定試劑能促進細菌的消除。本發(fā)明涉及該基因的遺傳修飾以及將遺傳修飾導入腫瘤靶向細菌包括沙門氏菌來用于治療，這種修飾導致該基因產(chǎn)物的正常功能被破壞。在一個優(yōu)選實施方案中，細菌在msbB基因中有一種遺傳修飾，并在一個生物合成途徑中的一個基因例如purⅠ基因中帶有一種遺傳修飾，后者產(chǎn)生一種營養(yǎng)缺陷型菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，遺傳修飾的細菌被用于動物包括人體中實體瘤的體積減小和／或生長抑制。在另一個優(yōu)選實施方案中，對本發(fā)明來說有用的細菌顯示，相對于正常組織，它們優(yōu)先粘附至或穿透到特定的實體瘤癌癥細胞中，或在腫瘤組織中增殖的傾向提高。這些細菌包括但不限于沙門氏菌，它們具有區(qū)分癌癥或贅生細胞組織與正常細胞／組織的天然能力。此外，對本發(fā)明來說有用的腫瘤細胞特異性的細菌，可以按照Pawelek等，W096／40238介紹的方法，依腫瘤靶向能力選擇或改進，該文獻在此引入作為參考。Pawelek等人介紹了分離腫瘤特異性細菌的方法，即使用一次或多次感染循環(huán)，將一種微生物循環(huán)通過預先選擇的靶細胞，優(yōu)選使用體外的實體瘤細胞，或者在體內(nèi)通過實體瘤。6．1一種參與毒性的基因的分離／鑒定大腸桿菌基因msbB已被顯示參與類脂A的豆蔻酰化(Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。大腸桿菌msbB基因的染色體組成和編碼msbB基因的DNA序列已有介紹(Engel，etal．，1992，J．Bacteriol．1746394-6403；KarowandGeorgopoulos，1992，J．Bacteriol．174702-710；Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。如本發(fā)明所示，msb基因可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的低嚴緊性DNA／DNA雜交技術(shù)(Sambrooketal．，MolecularCloning，ColdSpringHarborPress，1989)，從非大腸桿菌的細菌菌株中分離。分離細菌包括但不限于沙門氏菌各種類的msbB基因的一個說明性的實施例，見下文章節(jié)7．1。一個細菌DNA文庫可用32P標記的來自大腸桿菌的msbB基因作為探針進行雜交。對雜交克隆進行測定，如果它們含有與已知的大腸桿菌msbB基因相似的DNA序列，它們就是正確的。6．1．1沙門氏菌msbB的遺傳改變本發(fā)明的一個實施方案提供了一種組合物，它是在msbB基因中帶有一種遺傳改變的細菌菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，該細菌是沙門氏菌。破壞或刪除形式的遺傳改變可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的幾種方法來完成，包括使用一種抗生素抗性標記來進行同源重組。這些方法涉及以質(zhì)粒為基礎的克隆的msbB基因的破壞，使用能使部分或全部該基因被破壞或去除的限制內(nèi)切酶，或使用能使正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯被干擾的限制內(nèi)切酶，并將一種用于表型篩選的抗生素標記插入到該刪除、破壞或其他改變區(qū)域。將線性化的DNA轉(zhuǎn)化至沙門氏菌中，進一步檢查攜帶抗生素抗性的細菌來證明遺傳改變。檢查遺傳改變的方法包括PCR分析和Southern印跡。沙門氏菌msbB基因遺傳破壞的說明性實施例參見章節(jié)7．2。在本發(fā)明的另一個實施例中，msbB-／抗生素抗性標記可被轉(zhuǎn)染進一種新的細菌菌株。章節(jié)7．2中提供了一個說明性的實施例。噬菌體P22和一種msbB-沙門氏菌克隆可在一種無鹽LB中培養(yǎng)，上清中的新噬菌體可用來感染一種新的沙門氏菌菌株。本發(fā)明的另一個實施方案還提供一種沙門氏菌，它以超過一種的方式被減毒，例如類脂A產(chǎn)生途徑中的一種突變?nèi)邕@里介紹的msbB突變，以及一種或多種對一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型突變，例如Bochner，1980，J．Bacteriol．143926-933介紹的尿嘧啶生物合成、嘌呤生物合成和精氨酸生物合成途徑的突變，該文獻在此引入作為參考。在一個優(yōu)選實施方案中，msbB沙門氏菌在腫瘤中集聚的能力被具有一種或多種導種營養(yǎng)缺陷型菌株的msbB-沙門氏菌保留。在本發(fā)明的該實施方案的一個更優(yōu)選的模式中，能選擇性靶向腫瘤并表達一種藥物前體轉(zhuǎn)化酶的細菌載體對尿嘧啶、芳香族氨基酸、異亮氨酸、纈氨酸營養(yǎng)缺陷，并合成一種改變的類脂A。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，msbB-沙門氏菌還含有一種生物合成途徑基因purⅠ的遺傳修飾，導致與野生型相比該菌株的毒性降低。一個說明性的實施例在章節(jié)7和8中提供。6．1．2帶有被破壞msbB的沙門氏菌的特征這里介紹的msbB-沙門氏菌的一個特征是，誘導一種TNFα應答的能力與野生型細菌載體相比降低。全菌和分離或純化的脂多糖(LPS)都能引發(fā)一種TNFα應答。在本發(fā)明的一個實施方案中，與野生型沙門氏菌株相比，msbB-沙門氏菌誘導的TNFα表達為約5％至約40％(用另一種方式表述，msbB-沙門氏菌誘導的TNFα表達為野生型沙門氏菌如WT14028誘導水平的約5％至40％)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，msbB-沙門氏菌誘導的TNFα表達是一種野生型沙門氏菌誘導水平的約10％至35％。在本發(fā)明的一個實施方案中，來自msbB-沙門氏菌的純化LPS誘導的TNFα表達水平低于或等于純化自野生型沙門氏菌的LPS誘導水平的0．001％。全菌或分離或純化的LPS誘導的TNFα應答可以用商業(yè)化的試驗系統(tǒng)如用酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)在體外或體內(nèi)進行評估。說明性的實施例見下文章節(jié)7．3．1和7．3．2。以每c．f．u．或ug／kg為基礎的TNFα產(chǎn)生的比較，被用來確定相對活性。以每單位為基礎的TNFα水平較低，說明TNFα誘導量的減少。毒性降低這里介紹的msbB-沙門氏菌的另一個特征是，與野生型細菌載體相比，對宿主癌癥病人的毒性降低。野生型沙門氏菌在某些情況下顯示能引起明顯的進行性疾病。使用動物模型可確定正常野生型活沙門氏菌和活msbB-沙門氏菌的急性致死性。一個說明性的實施例見章節(jié)7．4和章節(jié)9，表Ⅲ。對一種固定接種量的動物存活的比較，被用來確定相對毒性。具有較高存活率的菌株具有降低的毒性。巨噬細胞中的存活性降低這里介紹的msbB-沙門氏菌的另一個特征是，與野生型細菌的存活性相比，在巨噬細胞中的存活性降低。野生型沙門氏菌(例如ATCC14028)以它們能在巨噬細胞中存活而著稱(Baumler，etal．，1994，Infect．Immun．621623-1630；BuchmeierandHeffron1989，Infect．Immun．571-7；BuchmeierandHeffron1990，Science248730-732；Buchmeieretal．，1993，Mol．Microbiol．7933-936；Fieldsetal．，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA835189-93；Fieldsetal．，1989，Science2431059-62；Fiereretal．，1993，Infect．Immun．615231-5236；Lindgrenetal．，1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA3197-4201；Milleretal．，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA865054-5058；Sizemoreetal．，1997，Infect．Immun．65309-312)。巨噬細胞中生存時間的比較可以使用一種體外細胞培養(yǎng)試驗來進行。相對于時間的較低數(shù)量的c．f．u．．表明在巨噬細胞中的存活性降低。說明性的實施例見下文章節(jié)8。如同那里所顯示的，使用慶大霉素為基礎的內(nèi)在化試驗和骨髓來源的鼠巨噬細胞或小鼠巨噬細胞系J774，確定了WT14028和msbB-克隆YS8211的存活性比較。在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生的存活率是野生型菌株的約50％至約30％，優(yōu)選為約30％至約10％，更優(yōu)選為約10％至1％。敏感性增加這里介紹的msbB-沙門氏菌的一個實施方案的另一個特征是，腫瘤靶向細菌對特殊化學試劑的敏感性增加，這對體內(nèi)給藥后用于協(xié)助細菌的去除非常有優(yōu)勢。細菌對廣泛的抗生素種類敏感。但是，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所包括的某些沙門氏菌msbB-突變體對通常不被認為是抗菌試劑的特定化合物敏感。具體地說，特定的msbB-沙門氏菌突變體比WT14028對螯合劑更敏感。以前對msbB-大腸桿菌的介紹并沒有提出對這樣的螯合劑的敏感性提高。相反，這樣的報告包括對去污劑如脫氧膽酸的抗性增加(KarowandGeorgopoulos1992J．Bacteriol．174702-710)。為確定對化學試劑的敏感性，正常野生型細菌和msbB-細菌在存在或不存在螯合劑如EDTA、EGTA或檸檬酸鈉的情況下培養(yǎng)，并對其生長進行比較。生長比較用光密度的函數(shù)表示，即msbB-菌株在存在一種試劑時的光密度比該菌在沒有試劑時生長的光密度低，就表明其敏感性。而且，在存在一種試劑時，msbB-菌株生長的光密度與msbB+在存在試劑時生長的光密度相比較低，就說明是msbB突變導致敏感性。一個說明性的實施例見下文章節(jié)7．7。在本發(fā)明的一個實施方案中，在約0．25mMEDTA至約0．5mMEDTA時msbB-沙門氏菌的生長發(fā)生90％的抑制(與野生型沙門氏菌的生長比較)，優(yōu)選在約0．25mMEDTA至約0．5mMEDTA時發(fā)生99％的抑制，更優(yōu)選在約0．25mMEDTA至約0．5mMEDTA時發(fā)生大于99％的抑制。在相似濃度的EGTA時也觀察到了相似范圍的生長抑制。msbB突變體的衍生物在無鹽Luria肉湯(LB)中生長時，本發(fā)明的msbB-突變體是穩(wěn)定的，即產(chǎn)生較少的衍生物(見下文的定義)。msbB-突變體在修改的LB(每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2、及2ml1NMgS04，用1NNaOH調(diào)至pH7)中連續(xù)培養(yǎng)時也維持穩(wěn)定的突變體。相反，在普通LB中生長時，msbB-突變體提高衍生物的產(chǎn)生。用于此處，“衍生物”的意思是msbB-突變體的自發(fā)性變異體，其特征是與原來的msbB-突變體相比，毒性、腫瘤抑制活性和／或?qū)︱蟿┑拿舾行缘乃讲煌?。與原來的msbB-突變體相比，衍生物的毒性、腫瘤抑制活性和對螯合劑的敏感性的水平可能更高、相同或較低。msbB-菌株的衍生物在未修改的LB上比原來的msbB-菌株生長更快。此外，衍生物可通過其在MacConkey瓊脂(一種含有膽鹽的瓊脂)上的生長能力和通過它們對螯合劑如EGTA和EDTA的抗性來識別。衍生物可按本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法在-70℃冷凍保藏或凍干穩(wěn)定保藏(Cryzetal．，1990，《新生代疫苗》M．M．Levine(ed．)，MarcelDekker，NewYorkpp．921-932；Adams，1996，《分子醫(yī)學方法疫苗規(guī)程》，Robinsonetal．(eds)，hUMANAPress，NewJersey，pp．167-185；Griffiths，Id．pp．269-288．)。毒性通過評估造成一半動物死亡的給藥劑量(LD50)來確定。衍生物的LD50的比較可用來評價其相對毒性。與其msbB-親本相比，一種自發(fā)衍生物的LD50降低，就說明其毒性增加。在一個說明性的實施例中，生長較快的衍生物可顯示與其相應的原始突變菌株相同水平的毒性、更高水平的毒性或較低水平的毒性(見章節(jié)9，表Ⅲ)。在另一個實施例中，一種衍生物誘導TNFα的能力與原始突變菌株相同(見章節(jié)7．3，圖7)。在一個說明性的實施例中，衍生物可比其相應的原始突變菌株抑制腫瘤生長的能力高或低(見章節(jié)7．6，圖11)。章節(jié)7．6中證明，原來的msbB-突變體---YS8211能明顯抑制腫瘤生長，而該克隆的一個衍生物---YS8212具有較低的腫瘤生長抑制活性。相反，與親本msbB-克隆YS7216相比，衍生物YS1629顯示提高的腫瘤生長抑制活性。如果一種衍生物比其親本突變體具有更高的毒性，但與野生型相比，誘導較低水平的TNFα，即誘導水平為野生型誘導的約5％至40％，它就可進一步被修飾來含有一種或多種突變成為營養(yǎng)缺陷型。在一個說明性的實施例中，YS1170衍生物被突變來使之成為一種或多種芳香族氨基酸的營養(yǎng)缺陷型如aroA，這樣就能減少毒性，并且根據(jù)本發(fā)明將更加有用。在另一個說明性的實施例中，purⅠ基因(參與嘌呤生物合成)的遺傳修飾產(chǎn)生了比親本菌株毒性低的沙門氏菌株(見章節(jié)7和8)。在本發(fā)明的方法中使用一種衍生物之前，應對衍生物進行評價，確定其毒性、誘導TNFα的能力、抑制腫瘤生長的能力和對螯合劑的敏感性。6．2將帶有被破壞的msbB的沙門氏菌用于腫瘤靶向和體內(nèi)治療實體瘤根據(jù)本發(fā)明，msbB-突變體沙門氏菌優(yōu)選應用于在一種動物包括患有實體瘤癌癥的病人中產(chǎn)生腫瘤生長抑制應答或減小腫瘤體積的方法。為進行此類應用，msbB-突變體沙門氏菌優(yōu)選具有腫瘤靶向能力或優(yōu)選針對腫瘤細胞／組織而不是正常細胞／組織。此外，msbB-突變體沙門氏菌優(yōu)選具有抑制或減少腫瘤生長的能力，和／或具有傳遞一種能抑制或減少腫瘤生長的基因或基因產(chǎn)物的能力。腫瘤靶向能力可用多種本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進行評價，包括但不限于癌癥動物模型。例如，使用B16F10黑素瘤皮下動物模型，對帶有一種msbB-修飾的沙門氏菌進行了分析，以確定它們是否具有腫瘤靶向能力。腫瘤對肝臟的陽性比例表明，遺傳修飾的沙門氏菌具有腫瘤靶向能力。一個說明性的實施例見章節(jié)7．5。使用多種標準的體內(nèi)模型中的任何一種，例如B16F10黑素瘤皮下動物模型，可對帶有msbB-修飾的沙門氏菌進行分析，以確定它們是否具有抗腫瘤活性。在一個說明性而不是限制性的實施例中，腫瘤被移植到小鼠的體側(cè)，并生長至第8天，然后用細菌菌株經(jīng)腹膜內(nèi)進行注射。監(jiān)測腫瘤體積隨時間的變化。如果腫瘤在細菌攜帶組中比在未處理的腫瘤攜帶動物中小，就確定抗腫瘤活性存在。一個說明性的實施例見下文章節(jié)7．6。用于體內(nèi)治療的本發(fā)明的沙門氏菌進行了遺傳修飾，使之在對一種宿主給藥時，細菌對宿主具有較低毒性，并且容易從宿主系統(tǒng)中清除。這種沙門氏菌是超感染的、減毒的、和對一種腫瘤靶細胞具有特異性。在一個更優(yōu)選的實施方案中，這種沙門氏菌可對具有抗生素樣活性的螯合劑具有敏感性。此外，用于本發(fā)明的方法的沙門氏菌能編碼“自殺基因”，例如藥物前體轉(zhuǎn)化酶或其他基因，這些基因由沙門氏菌在靶腫瘤中或附近表達和分泌。Pawelek等的WO96／40238在34-45頁的表2中提供了一個藥物前體轉(zhuǎn)化酶的說明性的名單，這些酶可由沙門氏菌msbB-突變體分泌或表達來用于本發(fā)明的方法。表2和35-43頁在此引入作為參考。這種基因可處于組成型、誘導型或細胞種類特異型啟動子的控制之下。其他對本發(fā)明的方法中有用的突變沙門氏菌有用的啟動子等，見Pawelek等的35-43頁，該文在此引入作為參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，一種自殺基因僅在沙門氏菌已經(jīng)侵入靶腫瘤細胞的胞質(zhì)后才被表達和分泌，由于自殺基因在腫瘤位置表達，因而使產(chǎn)生的效應局限。在一個優(yōu)選的實施方案中，給予宿主的沙門氏菌能表達HSVTK基因。當同時進行TK基因的表達和將9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤給予宿主時，9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤在微生物的周質(zhì)中磷酸化，微生物的周質(zhì)對核苷酸三磷酸來說可以自由地通過。磷酸化的9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤是一種有毒的錯誤DNA前體，它易于從微生物的周質(zhì)中穿過，并進入宿主的細胞質(zhì)和核，在那里它整合進宿主細胞DNA，因而導致宿主細胞的死亡。本發(fā)明的抑制一種實體瘤生長或減小其體積的方法包括，給予一個患有一種實體瘤的病人有效劑量的一種分離的突變沙門氏菌，該菌含有一個遺傳修飾的msbB基因，所說的突變體在體內(nèi)給藥時能靶向?qū)嶓w瘤。該msbB-突變沙門氏菌還可表達一種如上面介紹的自殺基因。此外，在一個實施方案中，分析了分離的沙門氏菌對螯合劑的敏感性，以確保在成功治療后或如果病人由于給予該分離沙門氏菌而產(chǎn)生并發(fā)癥時，容易從病人的機體中清除該沙門氏菌。這樣，如果使用的沙門氏菌對一種螯合劑敏感，在抗腫瘤效果達到后，就可給予約0．25mM至1．0mM的螯合劑如EGTA、EDTA或檸檬酸鈉來幫助清除沙門氏菌。在對一個患者進行給藥時，例如對一種動物進行獸醫(yī)方面的應用或?qū)θ诉M行臨床方面的應用時，沙門氏菌突變體可單獨使用，或與任何生理載劑如水、一種含水溶液、常規(guī)鹽水或其他生理上可接受的賦形劑一起組合使用。在通常情況下，劑量范圍為約1．0c．f．u．／kg至約1×1010c．f．u．／kg；可選用的范圍有約1．0c．f．u．／kg至約1×108c．f．u．／kg；約1×102c．f．u．／kg至約1×108c．f．u．／kg；約1×104c．f．u．／kg至約1x108c．f．u．／kg。本發(fā)明的沙門氏菌突變體可通過多種途徑進行給藥，包括但不限于口、局部、注射(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、腫瘤內(nèi)即直接注射進腫瘤)等。下面的實施例系列是說明性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。7．實施例通過對沙門氏菌msbB基因的破壞，引起毒性喪失、TNFα刺激減少、以及對螯合劑的敏感性增加7．1沙門氏菌msbB基因的分離及組成首先構(gòu)建一個沙門氏菌的基因組DNA文庫。將野生型鼠傷寒沙門氏菌(ATCC菌株14028)培養(yǎng)過夜，按Sambrook等的方法(MolecularCloningALaboratoryManual2nd．，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，1989)提取基因組DNA。使用Sau3A的時間限制酶切，制備范圍為2至10kb的限制性內(nèi)切酶消化片段，并用瓊脂糖凝膠電泳進行選擇。將這些片段連接進pBluescriptSK-，并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α。對克隆進行隨機分析顯示，DNA插入≥87％，平均大小為5．1kb。文庫由1．4×104獨立克隆組成。為減少大腸桿菌來源的msbB探針與大腸桿菌中100％同源的染色體基因雜交，按下述方法從培養(yǎng)皿中收集整個文庫使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，并用一個玻棒取出克隆，對所獲得的細菌群體進行大量質(zhì)粒制備，產(chǎn)生一個擴增的沙門氏菌文庫質(zhì)粒混合物。然后將此質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)化進沙門氏菌LT2YS5010，這樣就可消除大腸桿菌背景。一種針對msbB同源物的探針用一個大腸桿菌msbB基因的克隆來制備(KarowandGeorgopoulos1992J．Bacteriol．174702-710)用BglⅡ／HincⅡ消化大腸桿菌，并分離對應于一個編碼序列部分的600bp片段。該片段用α32P-CTP標記，并在低嚴謹條件下用作探針與沙門氏菌文庫雜交，這種低嚴緊條件為6XSSC、0．1％SDS、2XDenhardts、0．5％脫脂奶粉、55℃過夜。將顯示強雜交性的克隆純化，提取質(zhì)粒，并進行限制酶切和在用于菌落雜交的相同條件下進行原位凝膠雜交(EhteshamandHasnain1991BioTechniques11718-721)。進一步的限制酶消化顯示了一個能與探針強雜交的1．5kb片段的DNA，使用熒光染料終止熱循環(huán)測序儀在耶魯大學BoyerCenter對該DNA片段進行了測序。序列分析顯示，該1．5kb片段含有一個msbB同源物，這個同源片段明顯缺少對應的大腸桿菌基因的起始甲硫氨酸。使用EcoRⅠ／XbaⅠ限制酶切并與文庫再次雜交，制備了一個含有該克隆的5’區(qū)域的探針。沙門氏菌msbB基因的全部核苷酸序列(SEQIDNO1)和推導的編碼蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO2)見圖1。該可能的沙門氏菌msbB與大腸桿菌msbB的DNA同源性為75％。蛋白同源性是98％，這證明該克隆沙門氏菌基因是一種真正的msbB。7．2沙門氏菌msbB的遺傳改變使用克隆的沙門氏菌msbB基因構(gòu)建了一個敲除結(jié)構(gòu)物。用SphⅠ和MluⅠ酶切該克隆基因，從而切除大約一半的msbB編碼序列，將用AatⅡ和AvaⅠ從pBR322中切下的四環(huán)素抗性基因，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平末端化后，插入其中(圖2A-2C)。敲除破壞用同源重組方法來完成(Russelletal．，1989，J．Bacteriol．1712609)；用SacⅠ和KpnⅠ將該結(jié)構(gòu)物線性化，凝膠純化，并用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染至沙門氏菌LT2YS501。來自轉(zhuǎn)化過程的細菌首先在四環(huán)素平板上進行選擇，接著用氨芐青霉素抗性來檢查是否有攜帶質(zhì)粒的非染色體整合的污染物，并用標準的質(zhì)粒小量制備方法檢查是否有質(zhì)粒存在(Titus，D．E．ed．PromegaProtocolsandApplicationsGuide，PromegaCorp，1991)。對具有四環(huán)素抗性但沒有質(zhì)粒的細菌克隆隨后進行以PCR為基礎的分析，分析它們的msbB基因的結(jié)構(gòu)。PCR所用的引物能產(chǎn)生一段包括四環(huán)素基因插入的片段，其中上游引物為GTTGACTGGGAAGGTCTGGAG(SEQIDNO3)，它對應于堿基586-606，下游引物為CTGACCGCGCTCTATCGCGG(SEQIDNO4)，它對應于堿基1465-1485。野生型沙門氏菌msbB+產(chǎn)生一種約900堿基對的產(chǎn)物，而具有四環(huán)素插入的破壞的基因產(chǎn)生大約1850堿基對的產(chǎn)物。獲得了數(shù)個只產(chǎn)生較大PCR產(chǎn)物的克隆，這說明msbB基因的破壞已經(jīng)發(fā)生。Southern印跡分析被用來證明沙門氏菌msbB的染色體拷貝遭到破壞。將以質(zhì)粒為基礎的敲除結(jié)構(gòu)物(K0)與由野生型和可能的破壞msbB克隆YS82、YS86、YS8211和YS861制備的基因組DNA進行比較。將DNA用AseⅠ／BamHⅠ雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳在0．9％或1．2％的瓊脂糖上分離。YS821和YS861的結(jié)果示于圖3A-3C。相似的凝膠按三個獨立的標準進行比較3A)以32P標記的四環(huán)素基因片段為探針時，四環(huán)素基因的存在；3B)以來自克隆的msbB的32P標記的AseⅠ／BamHⅠ片段為探針時的限制酶切片段的長度；3C)為破壞msbB基因而去除的msbBmluⅠ片段及插入的四環(huán)素基因的存在或無(圖3A-3C)。因為為了破壞msbB基因和插入四環(huán)素基因，mluⅠ片段已被去除，因此我們預計該探針將與野生型雜交(圖3C，泳道2WT)，但不與敲除結(jié)構(gòu)物(泳道1K0)或克隆(泳道3和4，YS8211和YS821)雜交，從而證明msbB基因的遺傳改變。每個被檢測的克隆都顯示所有預期的msbB基因被刪除(敲除)的標準。這些數(shù)據(jù)進一步證明，msbB以一個單拷貝存在于野生型沙門氏菌中，因為在用一個標記的來自克隆的DNA的寡核苷酸為探針時，沒有觀察到其他雜交帶。在證明了msbB突變之后，制備了含有msbB-突變的其他菌株。使用的沙門氏菌株包括WT14028和YS72(來自WT14028的pur-xyl-高侵襲性突變體；Pawelek等，WO96／40238)。P22轉(zhuǎn)導被用來以YS82為供體產(chǎn)生YS8211(msbBtet)和以YS86為供體產(chǎn)生YS861和YS862(msbB1tet)；它們均以WT14028為受體。通過轉(zhuǎn)導以YS82為供體制備了YS7216(來自YS72的msbB1tet)。本發(fā)明包括數(shù)種衍生物，包括但不限于YS8211(YS8212、YS1170)、YS862(YS8644、YS8658)和YS7216(YS1601、YS1604、YS1629)的衍生物。在一個優(yōu)選實施方案中，自發(fā)性的衍生物在Luria瓊脂上比WT14028或由轉(zhuǎn)導產(chǎn)生的msbB-克隆生長得快一些。msbB+菌株在LB肉湯或含有1．5％瓊脂的LB平板上在37℃培養(yǎng)。msbB-菌株在每升含有10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2和2ml1NMgSO4用1NNaOH調(diào)至pH7的修改的LB中培養(yǎng)。為轉(zhuǎn)導msbBltet，使用了含有4mg／L四環(huán)素的無NaCl的LB。液體培養(yǎng)物以225rpm振蕩培養(yǎng)。為進行腫瘤靶向試驗，細胞在LB中按1∶100稀釋，生長至OD600=0．8至1．0，在磷酸緩沖鹽(PBS)中洗滌，并重懸于PBS。7．2．1一種通過蔗糖預選擇來選擇msbB遺傳改變的改進方法我們發(fā)現(xiàn)了一種通過蔗糖預選擇來選擇msbB遺傳改變的改進方法。這種預選擇方法以選擇保留了sacB基因的克隆為基礎。sacB基因負責將蔗糖轉(zhuǎn)化為一種有毒的化學物質(zhì)---果聚糖，而果聚糖對宿主細胞具有致死作用，因此可以用來選擇重組子。只有那些sacB基因被刪除的菌株才能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中存活，并因此含有蔗糖抗性特性sucr。如下文所述，預選擇保留了sacB基因的克隆，能省去常規(guī)蔗糖選擇中稀釋和比較蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。蔗糖酶系統(tǒng)的常規(guī)選擇過程使用大腸桿菌SM10λpir作為一種供體，該菌攜帶了一種含有msbB(△)bla和sacB基因的質(zhì)粒。編碼β-內(nèi)酰胺酶的bla基因提供對氨芐青霉素的抗性。在常規(guī)選擇過程中，使用常規(guī)雜交技術(shù)將供體菌株與一種沙門氏菌株雜交，以將含有msbB(△)blasacB的質(zhì)粒導入后者。因為沙門氏菌株含有第二個抗生素抗性標記(如鏈霉素抗性)，因此接著可以用氨芐青霉素和鏈霉素對重組沙門氏菌克隆進行雙抗性選擇。為檢測單個克隆的消除，將每個克隆的稀釋物涂布于缺少蔗糖的LB或含有5％蔗糖的LB。只有那些sacB基因被刪除或改變的菌株才能在蔗糖上存活。蔗糖(+)或蔗糖(-)平板上的克隆數(shù)目的比較，表明了消除的細菌細胞的比例。接著進一步檢測蔗糖抗性克隆對氨芐青霉素和四環(huán)素的敏感性。Tets和amps表明在部分msbB基因區(qū)域交換時sacB和bla基因被切除。然后用PCR證明msbB同種型在tetsamps克隆中存在。用于蔗糖酶系統(tǒng)的預選擇方法常規(guī)蔗糖酶過程中的一種改變允許通過預選擇保留了sacB基因的克隆來篩選更多數(shù)量的克隆。這種預選擇省去了在大數(shù)量的克隆中檢測和比較蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。在上面介紹的結(jié)合程序后，將克隆(此階段不純)直接鋪于含有5％蔗糖的LB平板，并在30℃培養(yǎng)。所獲得的不純的克隆繼續(xù)生長，而蔗糖上的存活者增加。從蔗糖抗性菌落中尋找那些顯示一種“模糊”邊緣的形態(tài)變異菌落，然后將它們稀釋并鋪于蔗糖(+)或蔗糖(-)平板。然后按上面的介紹檢測菌落對四環(huán)素和氨芐青霉素的敏感性，并用PCR證實msbB同種型。這種改進方法被用來制備菌株，用于msbB(△)blasacB染色體元件的P22轉(zhuǎn)導。然后這些菌株被用來制備YS1456和YS1646菌株，它們代表了本發(fā)明的新型msbB突變體的優(yōu)選實施方案(見圖15和16)。7．3沙門氏菌msbB的破壞減少TNFα的誘導7．3．1小鼠中的TNFα誘導WT14028和msbB-克隆YS8211首先在LB培養(yǎng)基中在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至飽和。然后將這些細菌菌株按1∶100稀釋，轉(zhuǎn)移至新鮮LB中，在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=1．0。將細菌在磷酸緩沖鹽中稀釋，并用1．0×108c．f．u．(約5×109／kg)注射進Balb／c小鼠的尾靜脈中(n=4／菌株)，以PBS作為陰性對照。1．5小時后，用心臟穿刺收集三個重復的血清樣品，離心去除細胞內(nèi)含物，使用BiosourceInternationalCytoscreenELISA平板分析TNFα，用MolecularDevicesEmax微量板讀數(shù)儀讀數(shù)。結(jié)果示于圖4，并以野生型沙門氏菌誘導的TNFα水平的百分比的形式表示。如圖4中所證明的，YS8211誘導的TNFα明顯少于WT14028。因此，如圖4所示，msbB-菌株誘導的TNFα為野生型msbB+菌株誘導水平的約33％(即低3倍)。7．3．2在豬中的TNFα誘導一種msbB-沙門氏菌株---YS8212和WT14028首先在LB培養(yǎng)基中在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至飽和。然后將這些細菌菌株按1∶1000稀釋，轉(zhuǎn)移至新鮮LB中，在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0．8。細菌用磷酸緩沖鹽洗滌，并用1．0×109c．f．u．(約1×108／kg)注射進Sinclair豬的耳靜脈中(n=6／菌株)。1．5和6．0小時后，收集血清，離心去除細胞內(nèi)含物，冷凍以備后面的分析。使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度計讀數(shù)。結(jié)果示于圖5，以每毫升血清的TNFα皮克數(shù)表示。如圖5中所證明的，在第90分鐘，msbB-菌株誘導的TNFα水平明顯低于沙門氏菌WT14028。7．3．3沙門氏菌LPS在豬中誘導的呼吸作用來自沙門氏菌WT14028和msbB-克隆---YS8212的脂多糖(LPS)按Galanos等介紹的程序制備(1969，Eur．J．Biochem．9245-249)。簡而言之，LPS從已經(jīng)生長到OD600為1．0的細菌中提取。離心沉淀細菌，用蒸餾水洗滌兩次，并在-20℃冷凍。在70℃在振蕩水浴鍋中使用18．3mlH2O∶15ml酚的混合物抽提來純化LPS。將混合物在冰上冷卻，在20，000xg離心15分鐘，取出水相。加入NaCl至0．05M和2倍體積的乙醇，并在冰上溫育，然后用2000xg離心10分鐘，使LPS從水相中沉淀。將沉淀在0．05MNaCl中重新溶解后，再次沉淀，并將沉淀冷凍干燥。將LPS溶于無菌蒸餾水中，按5ug／kg或500ug／kgLPS注射進用異氟烷麻醉的Sinclair豬的耳靜脈中。1．5和6．0小時后，測定和記錄呼吸速率。結(jié)果示于圖6，并以在0時間時的呼吸的百分比來表示。如圖6所證明的，與接受來自msbB-菌株的LPS的豬相比，接受野生型LPS的豬的呼吸明顯要高。因此，沙門氏菌中msbB基因的破壞在類脂A中產(chǎn)生了修飾，這導致其提高呼吸的能力降低。7．3．4在人單核細胞中的TNFα誘導人單核細胞用離心通過Isolymph(Pharmacia)的方法從外周血中制備，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。沙門氏菌WT14028和幾種msbB-14028菌株YS8211、YS8212、YS8658和YS1170首先在LB培養(yǎng)基中在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至飽和。然后將這些細菌菌株按1∶100稀釋，轉(zhuǎn)移至新鮮LB中，在37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0．8。將細菌加入細胞培養(yǎng)孔中，2，0小時后收集培養(yǎng)物，離心去除細胞內(nèi)容物，。使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度計讀數(shù)。結(jié)果示于圖7，并以每毫升血清的TNFα皮克數(shù)表示。如圖7中所證明的，msbB-菌株誘導的TNFα明顯少于野生型菌株。7．3．5沙門氏菌msbB-LPS在人單核細胞中的TNFα的誘導人單核細胞用離心通過Isolymph(Pharmacia)的方法從外周血中制備，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。野生型和多種msbB-突變的沙門氏菌(即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170)的脂多糖(LPS)按Galanos等介紹的程序制備(1969，Eur．J．Biochem．9245-249)(簡要介紹見章節(jié)7．3．3)。將LPS溶于蒸餾水，將數(shù)量范圍為0．001至100ng／ml的LPS加入細胞培養(yǎng)孔中。15小時后收集培養(yǎng)基，離心去除細胞內(nèi)容物，使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度計讀數(shù)。結(jié)果示于圖8，并以每毫升TNFα的皮克數(shù)表示。如圖8中所證明的，純化自msbB-菌株的LPS誘導的TNFα明顯少于來自野生型菌株的LPS。7．4沙門氏菌msbB的破壞降低毒性7．4．1在小鼠中野生型沙門氏菌14028及其msbB-沙門氏菌克隆YS862在無氯化鈉的LB培養(yǎng)基中在37℃在250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0．8。按1∶10的比例將細菌在磷酸緩沖鹽(PBS)中稀釋，并用2×107c．f．u．皮下注射進攜帶B16F10黑素瘤的C57BL小鼠中，每天或間隔2至4天檢查存活。結(jié)果示于圖9A，并以存活百分比的形式表示。如圖9A中所示，WT14028在4天內(nèi)殺死所有的小鼠，而msbB突變株經(jīng)過20天后有90％小鼠存活，這證明msbB-突變株的毒性明顯降低。7．4．2在豬中野生型沙門氏菌14028及其msbB-沙門氏菌克隆YS8212在無氯化鈉的LB培養(yǎng)基中在37℃在250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0．8。細菌用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌，并用1．0×109c．f．u．注射進Sinclair豬的耳靜脈中(n=4／菌株)，每天或間隔2至4天檢查存活。結(jié)果示于圖9B，并以存活百分比的形式表示。如圖9B中所示，WT14028在3天內(nèi)殺死所有的豬，而msbB-突變株經(jīng)過20天后有100％小鼠存活，這證明毒性明顯降低。7．5msbB-克隆的腫瘤靶向性使用B16F10黑素瘤皮下動物模型，對帶有msbB-修飾的沙門氏菌WTl4028進行分析，以確定它們是否具有腫瘤靶向能力。msbB-克隆YS8211在無氯化鈉的LB培養(yǎng)基中在37℃在250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0．8。按每份2．0×106c．f．u．經(jīng)靜脈注射進C57BL／6小鼠中，這些小鼠在細菌感染前16天預先用2×105B16黑素瘤細胞進行了移植。在細菌感染后2天和5天，處死小鼠，通過勻漿和系列稀釋涂平板來分析腫瘤和肝臟中細菌的存在。結(jié)果示于圖10，并以c．f．u．細菌／克組織的方式表示。如圖10中所證明的，在第2天發(fā)現(xiàn)腫瘤對肝臟的一個陽性比例(700∶1)，在第5天提高到2000∶1的陽性比例。因此，msbB-突變株保持了靶向?qū)嶓w癌瘤的能力。7．6帶有破壞的msbB的沙門氏菌用于體內(nèi)抗腫瘤活性鼠傷寒沙門氏菌msbB-克隆YS8211、YS8212、YS7216和YS1629以及WT14028(對照)在無氯化鈉的LB培養(yǎng)基中在37℃在250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0．8。按每份2．0×106c．f．u．腹膜內(nèi)注射進C57BL／6小鼠中，這些小鼠在細菌感染前8天預先用2×105B16黑素瘤細胞進行了移植。檢測不同時間的腫瘤體積。結(jié)果示于圖11。兩種菌株---YS8211和YS1629顯示明顯的腫瘤萎縮，即腫瘤生長抑制。7．7對螯合劑的敏感性提高為分析細菌菌株對螯合劑的敏感性，將帶有或沒有msbB突變的細菌在存在或沒有1mMEDTA或10mM檸檬酸鈉的無氯化鈉LuriaBroth(LB)中培養(yǎng)。每種菌株的過夜培養(yǎng)物按1∶100在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，并在37℃在250rpm振蕩培養(yǎng)。對生長的影響用分光光度計在OD600讀數(shù)來確定。WT14028和msbB-克隆YS8211在存在或沒有1mMEDTA時培養(yǎng)(圖12A)。EDTA不抑制WT14028的生長。相反，msbB-克隆在EDTA存在3小時后，生長近似于完全停止。WT14028和msbB-克隆YS862在存在或沒有10mM檸檬酸鈉時培養(yǎng)(圖12B)。與msbB-相比，msbB+WT14028菌株顯示幾乎不被檸檬酸鈉抑制，msbB-在存在檸檬酸鈉3小時后顯示生長幾乎完全停止。因此，msbB-沙門氏菌突變株顯示對螯合劑敏感，這可促進細菌的清除，是一種類似抗生素效果的特征。預期這種特征對使用msbB-沙門氏菌突變株進行體內(nèi)治療是有利的。為進一步分析沙門氏菌菌株對螯合劑的敏感性，將超侵襲性pur菌株YS72、其msbB-菌株YS7216以及YS7216的一個衍生物---YS1629在存在濃度不斷提高的EDTA時培養(yǎng)。將YS72、其msbB-菌株YS7216和其快速生長衍生物YS1629的新鮮培養(yǎng)物在含有0、0．25、0．5、1．0或2．0mMEDTA的新鮮無鹽LB培養(yǎng)基中按1∶100稀釋，37℃在225rpm振蕩培養(yǎng)4小時，通過在LB平板上系列稀釋涂布確定c．f．u．(表Ⅰ)。msbB-菌株YS7216在EDTA濃度大于0．25mM時獲得大于99％的抑制，其衍生物YS1629在濃度0．50mM時獲得大于90％的抑制，在濃度2．0mM時獲得大于99％的抑制。相反，雖然YS72克隆對EDTA顯示一些敏感性，但即使在2．0mM時也沒有90％水平的抑制。表Ⅰ<tablesid="table1"num="001"><table>菌株無EDTA的c．f．u．+EDTA(％抑制)c．f．u．[1．0mM][2．0mM]YS723．0×1092．4×109{20％}1．5×109{50％}7．3×108{75％}4．8×108{84％}YS72166．3×1092．1×106{99．6％}1．1×106{99．8％}3．2x106{99．4％}4．3×106(99．3％}YS16291．3×1096．0×108{54％}1．0×108{92％}2．9×107{97％}7．5×106{99．4％}</table></tables>7．8細菌在巨噬細胞中的存活為確定msbB-沙門氏菌對巨噬細胞的敏感性，使用了兩種類型的巨噬細胞(A)獲自C57BL／6小鼠的股骨和脛骨的骨髓來源的巨噬細胞，這種細胞在加入來自LADMAC細胞系的培養(yǎng)上清時能夠繁殖，因為LADMAC細胞能分泌巨噬細胞集落刺激因子(Sklaretal．，1985．J．Cell．Physiol．125403-412)；和(B)獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的J774細胞(一種鼠巨噬細胞系)。所使用的沙門氏菌株是WT14028及其msbB-衍生物YS8211和YS1170。細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長后期OD600=0．8，在一個24孔培養(yǎng)皿中，用1×106細菌感染哺乳動物細胞匯合層30分鐘，然后用培養(yǎng)基洗滌并加入50ug／ml慶大霉素，以除去細胞外細菌(Elsinghorst，1994，MethodsEnzymol．236405-420)。用0．01％脫氧膽酸取出細胞層，并系列稀釋涂平板，記錄細菌數(shù)目，并以最初時間的c．f．u．的百分數(shù)形式表示。結(jié)果示于表13，并以相對于時間的c．f．u．百分數(shù)形式表示。msbB-菌株顯示在巨噬細胞中的存活明顯較低。7．9msbB衍生物的LD50msbB-菌株的自發(fā)衍生物YS8211和YS7216按照生長速度提高的特征從沒有修改的LB培養(yǎng)基上的體外培養(yǎng)物中選擇。將這些細菌培養(yǎng)至OD600為0．8，用c．f．u范圍為1×102至1×108的細菌注射進C57BL／6小鼠的尾靜脈中。在第3天測定急性致死活性，按Welkos和O'Brien介紹的方法(MethodsinEnzymology23529-39，1994)確定LD50。結(jié)果示于表Ⅱ。因此，雖然所有的msbB-菌株誘導TNFα的能力都降低(見章節(jié)7．3．5)，但結(jié)果證明，菌株YS1170明顯比其他msbB-菌株的毒性低，因此不是所有的msbB-菌株都能用來同時提供TNFα誘導減少和毒性降低。表Ⅱ菌株LD50WT140281×103YS82114×106YS82123．9×107YS16291×107YS11701×1078．msbB突變組合一種生物合成途徑突變?yōu)榱嗽u價營養(yǎng)缺陷型突變的兼容性(這可通過測量靶向腫瘤和在腫瘤中復制能力的保留來進行)，制備msbB突變與營養(yǎng)缺陷型突變的組合。msbB+菌株在LB肉湯或含有1．5％瓊脂的LB平板上在37℃培養(yǎng)。msbB-菌株在每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2、及2ml1NMgSO4、用1NNaOH調(diào)至pH7的修改的LB中培養(yǎng)。為進行msbB1tet轉(zhuǎn)導，使用無NaCl的LB，并加入4mg／l的四環(huán)素。液體培養(yǎng)物用225rpm振蕩培養(yǎng)。將msbBltet轉(zhuǎn)導進營養(yǎng)缺陷型菌株，以產(chǎn)生YS1604(msbB-、pur-、超侵襲性)、YS7232(msbB-、purI-、超侵襲性)、YS7244(msbB-、purI-、aroA-、超侵襲性)、YS1482(msbB-、purI-、purA-)。為進行腫瘤靶向?qū)嶒?，細胞在LB中1∶100稀釋，培養(yǎng)至OD600=0．8至1．0，在磷酸緩沖鹽(PBS)中洗滌，重懸于PBS，并用2×106注射進C57BL／6小鼠的尾靜脈中。在第7天，切下腫瘤，進行稱量，并勻漿化，將其系列稀釋后涂于如上介紹的修改的LB平板，確定c．f．u．。結(jié)果示于表Ⅲ，并以c．f．u．／克腫瘤組織的形式表示。一些菌株---YS8211、YS1604和YS7232在腫瘤中顯示高水平的c．f．u．，而YS7244和YS1482則低約500至5000倍。表Ⅲ<tablesid="table2"num="002"><table>菌株遺傳標記c．f．u．／克腫瘤組織YS8211msbB-3×109YS1604msbB-、pur-、超侵襲性9×109YS7232msbB-、purⅠ-、超侵襲性9×109YS7244msbB-、purⅠ-、aroA-、超侵襲性5×105YS1482msbB、purⅠ-、purA-6×106</table></tables>8．1在msbB和purⅠ中含有刪除的YS1456菌株的制備從野生型鼠傷寒沙門氏菌中制備沙門氏菌株YS1456的過程概述于圖15。用能提供四環(huán)素抗性的purⅠ1757Tn10轉(zhuǎn)導野生型鼠傷寒沙門氏菌，產(chǎn)生了菌株YS1451。然后對YS1451菌株進行Bochner選擇，以獲得四環(huán)素敏感的菌株，并導入tets基因和導入一個purⅠ刪除(Bochneretal．，1980，J．Bacteriol．143926-933)，從而產(chǎn)生菌株YS1452。菌株1452為tets和purⅠ-。然后以菌株YS8211(msbBtet)為供體，通過P22用msbBltet轉(zhuǎn)導菌株YS1452。所獲得的菌株YS1453開始時對10mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，接著自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环NEGTA抗性表型。一種這樣的轉(zhuǎn)變菌株---表示為YS1454，通過將YS1453在EGTA(在Luria瓊脂中2mM)上鋪板進行選擇。然后用msbB2(△)blasacB染色體元件轉(zhuǎn)導菌株YS1454，以選擇氨芐青霉素抗性。這個轉(zhuǎn)導過程引入了表示為msbB2(△)的第二個版本的破壞msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因負責β-內(nèi)酰胺酶的轉(zhuǎn)錄，β-內(nèi)酰胺酶能代謝氨芐青霉素，并被用于選擇氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)導子。sacB基因負責將蔗糖轉(zhuǎn)化為一種有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖對宿主細胞具有致死作用，它可隨后用于選擇失去sacB或在sacB中有突變的重組子(見章節(jié)7．2．1的使用蔗糖的改進的預選擇方法)。bla和sacB基因的存在允許對ampr和sucs菌株(表示為菌株YS1455)進行選擇，后者同時含有msbBltet和msbB2(△)基因。然后將菌株YS1455鋪于LuriaBertani(LB)蔗糖，以選擇sucrampstets衍生物，來去除msbBltet，并保留抗生素活性。該衍生物表示為YS1456?？偟膩碚f，YS1456在purⅠ和msbB中帶有刪除突變。它還是tetsamps和EGTAr。8．2在msbB和purⅠ中含有刪除的YS1646菌株的制備從野生型鼠傷寒沙門氏菌(野生型菌株ATCC14028)中制備沙門氏菌株YS1456的過程概述于圖15。野生型鼠傷寒沙門氏菌用亞硝基胍和紫外線(UV)誘變，并選擇在黑素瘤細胞中有超侵襲性的菌株。抗性菌株表示為YS72，它被證實具有腫瘤超侵襲性、pur-和xyl-特性(Paweleketal．，1997，CancerRes574537-4544)。為了用一個purⅠ刪除在菌株YS72中置換染色體purⅠ基因，用purⅠ1757Tn10基因轉(zhuǎn)導菌株YS72，purⅠ1757Tn10基因能提供四環(huán)素抗性。purⅠ1757Tn10基因的供體是沙門氏菌株TT11(purⅠ1757Tn10)。原始供體菌株獲自沙門氏菌遺傳保藏中心(Dept．ofBiologicalScience，Univ．Calgary，Calgary，Alberta，CanadaT2N1N4)。轉(zhuǎn)導用噬菌體P22(突變體HT105／1int-201)進行。在四環(huán)素上選擇后獲得了轉(zhuǎn)導子，表示為YS1641。然后對YS1641菌株進行Bochner選擇，以去除四環(huán)素基因，并引入一個purⅠ刪除(Bochneretal．，1980，J．Bacteriol．143926-933)，從而產(chǎn)生菌株YS1642。菌株1642為tets和purⅠ-。選擇的tet-刪除菌株可進一步用tet基因轉(zhuǎn)導進行遺傳修飾(如msbB基因破壞，見下一段)。由于purⅠ(△)，因此菌株YS1642對嘌呤有嚴格的要求，并且所顯示的轉(zhuǎn)變?yōu)閜urⅠ+的頻率低于每1010細胞中1個。然后以菌株YS8211(msbBtet)為供體，通過P22用msbB1tet轉(zhuǎn)導菌株YS1642。msbB基因的DNA序列示于圖1。msbB1tet中的tet基因提供對5mg／L四環(huán)素的抗性。這樣獲得的菌株為YS1643。菌株YS1643開始時對10mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，它可自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环NEGTA抗性表型。一種這樣的轉(zhuǎn)變菌株---表示為YS1644，通過將YS1643在EGTA(在Luria瓊脂中2mM)上鋪板進行選擇。然后用msbB2(△)blasacB染色體元件轉(zhuǎn)導菌株YS1644。這個轉(zhuǎn)導過程引入了表示為msbB2(△)的第二個版本的破壞msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因負責β-內(nèi)酰胺酶的轉(zhuǎn)錄，β-內(nèi)酰胺酶能代謝氨芐青霉素，并被用于選擇轉(zhuǎn)導子。sacB基因負責將蔗糖轉(zhuǎn)化為一種有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖對宿主細胞具有致死作用，該基因可用來選擇重組子。bla和sacB基因的存在允許對ampr和sucs菌株(表示為菌株YS1645)進行選擇，后者同時含有msbBltet和msbB2(△)基因。將菌株YS1645鋪于LuriaBertani(LB)蔗糖，以選擇sucrampstets衍生物，來去除msbBtet，并保留抗生素活性(即一個帶有msbBltetblasacB刪除的衍生物)。該衍生物表示為YS1646?？偟膩碚f，YS1646在purⅠ和msbB中帶有刪除突變。它還是tets、amps和EGTAr。8．3用YS1646菌株抑制腫瘤生長靜脈(Ⅳ)給予一種鼠傷寒沙門氏菌的減毒株---YS1646，可產(chǎn)生在腫瘤中的選擇性繁殖，并伴隨著腫瘤生長的抑制(見圖17和表Ⅳ)。在所有情況下，使用一種階段性的腫瘤模型，其中在腫瘤細胞接種后和YS1646給藥前，使腫瘤建立。YS1646在腫瘤中繁殖的能力的一個結(jié)果是，確定了一個在有效劑量范圍內(nèi)的簡單劑量應答關(guān)系，其中由低劑量的YS1646引起的腫瘤抑制的程度接近較高劑量產(chǎn)生的腫瘤抑制水平。這說明，即使在低劑量時也可以達到明顯的臨床效果，只要細菌能夠到達腫瘤并在腫瘤中積累。低于1×102的劑量給出了不一致的結(jié)果，這可能是由于YS1646到達和在腫瘤中定居的能力與動物清除YS1646的能力之間競爭而引起的。YS1646的效果在預先移植了B16-F10黑素瘤的小鼠中進行了評價。在此研究中，一個單一Ⅳ劑量的YS1646在104、105或106c．f．u．／鼠時，與對照處理相比，能明顯減小腫瘤體積，并且腫瘤大小減小的程度是劑量依賴型。用最高劑量的YS1646觀察到的效果優(yōu)于使用陽性對照CYTOXANTM(也稱為環(huán)磷酰胺)的效果，而中等劑量的YS1646的效果與CYTOXANTM相當。應當注意，YS1646產(chǎn)生的效果是由一個單獨的Ⅳ劑量誘導的，而CYTOXANTM誘導的效果是由多次Ⅳ劑量產(chǎn)生的(每周給藥，共3周)。在1×104至1×106c．f．u．／鼠的給藥劑量范圍內(nèi)，對相對于劑量的YS1646抑制腫瘤生長的能力進行了檢測。每個劑量組包括10只荷瘤動物，這些動物在用細菌給藥前隨機分組。在第7天用細菌對小鼠進行給藥，并在第10、13、17、20和24天測量腫瘤的體積。為進行比較，用CYTOXANTM(環(huán)磷酰胺)按一個劑量200mg／kg每周一次進行給藥，也在第7天開始給藥。在第24天每組的平均腫瘤體積示于表Ⅳ。表Ⅳ<tablesid="table3"num="003"><table>接種劑量(cfu／鼠)平均腫瘤體積(mm3)±S．D．T／C抑制百分比04728±80401041011±3750．21478105560±1760．11888106279±910．05994</table></tables>在用Wilcoxon符號秩檢驗分析或用雙側(cè)t檢驗進行分析時，在各組之間觀察到的差異都被認為是明顯的。如表Ⅳ所示，在YS1646劑量增加時，能觀察到腫瘤抑制增強。按照DrugEvaluationBranch0ftheDivisionofCancerTreatment，NationalCancerInstitute(Bethesda，MD)(Vendett，J．M．，Preclinicaldrugevaluationrationaleandmethods，Semin．Oncol．8349-361；1981)的定義，所有的劑量都被發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤抑制活性(T／C比平均小至42％)。并且1×105cfu／鼠的劑量所給出的結(jié)果相當于或優(yōu)于環(huán)磷酰胺。在YS1646劑量與腫瘤抑制之間沒有觀察到一個線性關(guān)系，因為YS1646具有優(yōu)先在腫瘤中的能力，這導致在低劑量時比預期的能力強。經(jīng)靜脈注射一種鼠傷寒沙門氏菌的減毒菌株---YS1646，導致在腫瘤中的選擇性繁殖，并伴隨著腫瘤生長的抑制。當接種劑量在1×104至1×106cfu／鼠之間時，能夠得到一個腫瘤生長抑制的劑量應答，其腫瘤生長抑制的范圍是78％至94％。在兩個最高接種劑量時，腫瘤生長抑制的水平相當于或優(yōu)于環(huán)磷酰胺最佳處理時達到的水平。8．4毒性在劑量為1×106cfu／鼠時，YS1646沒有引起致死性，這與其親本野生型菌株ATCC14028相對，后者在1×102cfu／鼠的劑量時，導致100％的死亡。這說明YS1646的毒性比親本野生型菌株低10，000倍。在劑量為104至106cfu／鼠時就能觀察到抗腫瘤效應，而直到劑量＞106cfu／鼠時也沒有觀察到致死性。導致死亡的劑量比誘導抗腫瘤效應的劑量高1至100倍(見圖18)。8．5致死感染后YS1646誘導死亡的抗生素抑制氨芐青霉素和環(huán)丙沙星抑制YS1646感染的能力，可通過確定抗生素阻止接種了5×106cfu(等于LD50)的C57BL／6小鼠死亡的能力來評價。按下面的處理類別進行分組1)未處理對照，2)氨芐青霉素處理，3)環(huán)丙沙星處理，以及4)環(huán)丙沙星和氨芐青霉素處理?？股靥幚碓诩毦o藥后第3天開始，每天觀察動物的表現(xiàn)和死亡，直至第14天。這里所示的結(jié)果證明，抗生素的使用能抑制致死性細菌感染后的死亡(見圖18)。9．微生物的保藏下面的微生物已于1997年9月9日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd．，Manassas，VA20110-2209進行了保藏，并被給予了所示的保藏編號微生物ATCC編號YS8211202026YS1629202025YS1170202024下面的微生物已于1998年8月25日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd．，Manassas，VA20110-2209進行了保藏，并被給予了所示的保藏編號微生物ATCC編號YS1646202165YS1456202164這里宣布和介紹的本發(fā)明包括但不限于保藏的微生物實施方案不是用具體的實施方案來限制其范圍，之所以在這里公開是因為，這些實施方案是為了說明本發(fā)明的幾個方面。事實上，除了這里顯示和介紹的內(nèi)容，按前面的介紹對本發(fā)明進行各種修改，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這種修改也被包含在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。這里引用了大量參考文獻，這些引入的全部公開物均全文引入作為參考。序列表<110>VIONPHARMACEUTICALS，INC.YALEUNIVERSITY<120>減毒的遺傳修飾腫瘤靶向細菌<130>8002-042<140>PCT／US98／<141>1998-09-09<160>4<170>PatentInVer．2．0<210>1<211>2019<212>DNA<213>沙門氏菌<220><221>CDS<222>(244)．．(1212)<400>lgatcaaccagcaagccgttaaccctctgacagcaaaattgccgcgcacggaaggtctgac60ggggtcagatcgtcgtgaatacctggcacaggtgaaagaggttctgccgcaactgcgctt120cgattaacaaatgcgctgacagagccggtacgcgatgtgtgccggcttttttgttttgtg180tgagacgcagacgtcgctacactattcacaattccttttcgcgtcagcagaccctggaaa240agcatggaaaccaaaaaaaataatagtgagtatatccctgaattcgaa288MetGluThrLysLysAsnAsnSerGluTyrIleProGluPheGlu151015aaatcctttcgctatccacagtattggggcgcctggttgggcgcggcg336LysSerPheArgTyrProGlnTyrTrpGlyAlaTrpLeuGlyAlaAla202530gcaatggcggggarcgcattaacaccggcatcattccgcgaccctttg384AlaMetAlaGlyIleAlaLeuThrProAlaSerPheArgAspProLeu354045ctggcgacgctggggcgttttgccggacggctggggaagagttctcgt432LeuAlaThrLeuGlyArgPheAlaGlyArgLeuGlyLysSerSerArg505560cgccgggcgctaattaatctgtcgttgtgctttccgcagcgtagcgaa480ArgArgAlaLeuIleAsnLeuSerLeuCysPheProGlnArgSerGlu657075gctgagcgcgaagcgattgtcgatgagatgttcgccaccgcgccacag528AlaGluArgGluAlaIleValAspGluMetPheAlaThrAlaProGln80859095gcaatggcgatgatggctgagttggcgatgcgcggtccgaaaaaaatt576AlaMetAlaMetMetAlaGluLeuAlaMetArgGlyProLysLysIle100105110caacagcgtgttgactgggaaggtctggagattarcgaggagatgcgt624GlnGlnArgValAspTrpGluGlyLeuGluIleIleGluGluMetArg115120125cgtaacgacgaaaaagtcatttttcrcgtaccgcatggctggggcgtc672ArgAsnAspGluLysValIlePheLeuValProHisGlyTrpGlyVal130135140gacattccagccatgctgatggcctctcaggggcaaaaaatggcggcg720AspIleProAlaMetLeuMetAlaSerGlnGlyGlnLysMetAlaAla145150155atgtttcataatcagggtaatccggtttttgactatatctggaacaca768MetPheHisAsnGlnGlyAsnProValPheAspTyrIleTrpAsnThr160165170175gtgcgtcggcgtttcggcggacgtttgcatgcgcgtaatgacgggatt816ValArgArgArgPheGlyGlyArgLeuHisAlaArgAsnAspGlyIle180185190aaaccctttattcagtctgttcgtcagggctactggggttactacctg864LysProPheIleGlnSerValArgGlnGlyTyrTrpGlyTyrTyrLeu195200205ccggaccaggatcacggcccggagcatagtgaattcgttgatttcttt912ProAspGlnAspHisGlyProGluHisSerGluPheValAspPhePhe210215220gcgacatacaaagcgacgctgcctgcaattggtcggctgatgaaagtg960AlaThrTyrLysAlaThrLeuProAlaIleGlyArgLeuMetLysVal225230235tgccgcgcacgcgtgataccgcttttcccggtgtataatggtaaaacg1008CysArgAlaArgValIleProLeuPheProValTyrAsnGlyLysThr240245250255catcgcctgactatccagattcgcccgccaatggacgatctgctcacg1056HisArgLeuThrIleGlnIleArgProProMetAspAspLeuLeuThr260265270gctgacgaccacactatcgccagacggatgaacgaagaggtcgaaatt1104AlaAspAspHisThrIleAlaArgArgMetAsnGluGluValGluIle275280285tttgtcggcccgcatccggaacagtacacctggatcctgaagctgctc1152PheValGlyProHisProGluGlnTyrThrTrpIleLeuLysLeuLeu290295300aaaacccgcaagccaggcgagattcagccgtataagcgtaaagatctt1200LysThrArgLysProGlyGluIleGlnProTyrLysArgLysAspIeu305310315tatcccatcaaataaataaagcctctcgtaagagaggctttatgctgacaaa1252TyrProIleLys320ccctgtactacctgatgaacaggcgtgggggagttttactcaacggtcaaaatacgcgtg1312gtattggttgaaccgacggtgctcatgacatcgccctgggtcacgataaccaggtcgccg1372gaaaccagataccctttatcgcgcagcagattaacagcttcatgtgccgcgacaacgcca1432tcagccgcgctatcaaaatgcaccggcgttactccgcgatagagcgcggtcaggttcagc1492gtgcgttcatggcgcgacatggcgaaaatcggcaggccggagctgatacgggaagtcatt1552agcgcggtacgaccggattccgtcatggtgatgatcgcggtaacgcctttcagatggttt1612gccgcatacactgcagacatggcaatggcttcttcaacgttgtcgaactgcacgtcgaga1672cggtgtttagacacattgatgctggggattttttctgcgcccaggcacacgcgcgccatt1732gcggcaacggtttcagaaggatactgaccggctgcggtttcggcagacagcataaccgca1792tccgtgccatccaggacggcgttcgccacgtccatcacttccgcacgggtcggcatcggg1852ttggtgatcatcgactccatcatttgcgttgcggtgatgactgcgcggtttagctgacgc1912gcacggcgaatcagcgctttctggataccaaccagctccggatcgccgatttcaacgccc1972agatcgccacgtgcgaccatcacaacgtcagaggccagaatgatatc2019<210>2<211>323<212>PRT<213>沙門氏菌<400>2MetGluThrLysLysAsnAsnSerGluTyrIleProGluPheGluLys151015SerPheArgTyrProGlnTyrTrpGlyAlaTrpLeuGlyAlaAlaAla202530MetAlaGlyIleAlaLeuThrProAlaSetPheArgAspProLeuLeu354045AlaThrLeuGlyArgPheAlaGlyArgLeuGlyLysSerSerArgArg505560ArgAlaLeuIleAsnLeuSerLeuCysPheProGlnArgSerGluAla65707580GluArgGluAlaIleValAspGluMetPheAlaThrALaProGlnAla859095MetAlaMetMetAlaGluLeuAlaMetArgGlyProLysLysIleGln100105110GlnArgValAspTrpGluGlyLeuGluIleIleGluGluMetArgArg115120125AsnAspGluLysValIlePheLeuValProHisGlyTrpGlyValAsp130135140IleProAlaMetLeuMetAlaSerGlnGlyGlnLysMetAlaAlaMet145150155160PheHisAsnGlnGlyAsnProValPheAspTyrIleTrpAsnThrVal165170175ArgArgArgPheGlyGlyArgLeuHisAlaArgAsnAspGlyIleLys180185190ProPheIleGlnSerValArgGlnGlyTyrTrpGlyTyrTyrLeuPro195200205AspGlnAspHisGlyProGluHisSerGluPheValAspPhePheAla2l0215220ThrTyrLysAlaThrLeuProAlaIleGlyArgLeuMetLysValCys225230235240ArgAlaArgValIleProLeuPheProValTyrAsnGlyLysThrHis245250255ArgLeuThrIleGlnIleArgProProMetAspAspLeuLeuThrAla260265270AspAspHisThrIleAlaArgArgMetAsnGluGluValGluIlePhe275280285ValGlyProHisProGluGlnTyrThrTrpIleLeuLysLeuLeuLys290295300ThrArgLysProGlyGluIleGlnProTyrLysArgLysAspLeuTyr305310315320ProIleLys<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3gttgactgggaaggtctggag<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4ctgaccgcgctctatcgcgg權(quán)利要求1．含有一種遺傳修飾的msbB基因的突變沙門氏菌，其中突變的沙門氏菌在體內(nèi)給藥時能靶向一種實體瘤。2．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它被命名為YS1629，并且其ATCC保藏號為No．202025；或它被命名為YS1170，并且其ATCC保藏號為No．202024；或它被命名為YS8211，并且其ATCC保藏號為No．202026。3．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它選自傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。4．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它表達一種改變的類脂A分子。5．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它誘導的TNFα表達是野生型沙門氏菌誘導水平的約5％至約40％。6．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它誘導的TNFα表達是野生型沙門氏菌誘導水平的約10％至約35％。7．從權(quán)利要求1的突變沙門氏菌純化的脂多糖，它誘導的TNFα表達少于或等于野生型沙門氏菌誘導水平的0．001％。8．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制其約90％的生長。9．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制其約99％的生長。10．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制超過其99％的生長。11．權(quán)利要求8、9或10的突變沙門氏菌，其中螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和檸檬酸鈉。12．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約50％至約30％。13．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約30％至約10％。14．權(quán)利要求1的突變沙門氏菌，它在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約10％至約1％。15．一種抑制實體瘤癌癥生長或減小其體積的方法，包括使用有效劑量的權(quán)利要求1的突變沙門氏菌對患有一種實體瘤癌癥的病人進行給藥。16．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌選自選自傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。17．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌表達一種改變的類脂A分子。18．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌誘導的TNFα表達是野生型沙門氏菌誘導水平的約5％至約40％。19．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌誘導的TNFα表達是野生型沙門氏菌誘導水平的約10％至約35％。20．權(quán)利要求15的方法，其中從突變沙門氏菌純化的脂多糖誘導的TNFα表達少于或等于野生型沙門氏菌誘導水平的0．001％。21．權(quán)利要求15的方法，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制約90％的突變沙門氏菌的生長。22．權(quán)利要求15的方法，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制約99％的突變沙門氏菌的生長。23．權(quán)利要求15的方法，其中與野生型沙門氏菌相比，一種螯合劑能抑制超過99％的突變沙門氏菌的生長。24．權(quán)利要求21、22或23的方法，其中螯合劑選自EDTA、EGTA和檸檬酸鈉。25．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約50％至約30％。26．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約30％至約10％。27．權(quán)利要求15的方法，其中突變沙門氏菌在巨噬細胞中的存活水平為野生型沙門氏菌存活水平的約10％至約1％。28．權(quán)利要求15的方法，其中實體瘤癌癥是黑素瘤。29．權(quán)利要求15的方法，其中實體瘤癌癥是結(jié)腸癌。30．權(quán)利要求15的方法，其中實體瘤癌癥選自肺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌。31．一種藥物組合物，它包括能有效抑制一種實體瘤癌癥生長或減少其體積的一定量權(quán)利要求1的突變沙門氏菌；以及一種可藥用的載體。32．一種突變沙門氏菌，它包含一種遺傳修飾的msbB基因和一種遺傳修飾的purⅠ基因，其中該突變沙門氏菌在體內(nèi)給藥時能夠靶向一種實體瘤。33．權(quán)利要求32的突變沙門氏菌，其中遺傳修飾是一種刪除突變。34．權(quán)利要求32的突變沙門氏菌，它被命名為YS1646，并且其ATCC保藏號為No．202165；或它被命名為YS1456，并且其ATCC保藏號為No．202164。35．一種突變沙門氏菌，它包含一種遺傳修飾的msbB基因和一種遺傳修飾的生物合成途徑基因，其中生物合成途徑突變提供降低的毒性。36．一種抑制實體瘤癌癥生長或減小其體積的方法，包括包括使用有效劑量的權(quán)利要求32的突變沙門氏菌對患有一種實體瘤癌癥的病人進行給藥。37．一種選擇細菌遺傳改變的改進方法，其中的改進包括選擇一種表型變異體，當它在一種含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長時，產(chǎn)生邊緣模糊或粗糙的菌落。全文摘要本發(fā)明涉及含有一種遺傳修飾的msbB基因的突變沙門氏菌,該突變沙門氏菌具有靶向?qū)嶓w瘤的能力。本發(fā)明還涉及含有一種遺傳修飾的msbB基因以及在生物合成途徑基因如purI基因中有一種遺傳修飾的沙門氏菌。本發(fā)明進一步涉及將該突變沙門氏菌用于實體瘤的生長抑制和/或體積減小的用途。文檔編號C12N1/21GK1278864SQ98811030公開日2001年1月3日申請日期1998年9月9日優(yōu)先權(quán)日1997年9月10日發(fā)明者D·伯穆德斯,K·B·羅,M·伊滕索恩申請人:維昂藥品公司,耶魯大學