專利名稱：包含靶向部分和觸發(fā)免疫反應(yīng)部分的抗腫瘤劑的制作方法
本申請要求2003年3月4日提交的美國臨時申請No.60/451,253的利益。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在腫瘤治療，特別是癌癥治療的方法仍是次最佳的，因?yàn)樗鼈兂３２荒芷茐幕虺ト磕[瘤或癌細(xì)胞。此外，由于在靶向細(xì)胞以進(jìn)行破壞或除去中缺乏特異性，所以現(xiàn)在的方法伴發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥和不良副作用。
開發(fā)成功抗腫瘤劑的關(guān)鍵是設(shè)計如下試劑的能力，所述試劑能夠選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常組織即使有，也具有相對小的作用。這個目標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榱鼋M織和正常組織之間性質(zhì)差異很少。為完成這個目標(biāo)，研究集中在鑒定可以用作化療和診斷的免疫靶的腫瘤特異性“標(biāo)記抗原”。很多腫瘤特異性的或準(zhǔn)腫瘤(quasi-tumor)特異性的(“腫瘤相關(guān)性的”)標(biāo)記已被鑒定為可被特異性抗體識別的腫瘤細(xì)胞抗原。情況通常是這樣的，即腫瘤特異性抗體不會在它們自身當(dāng)中或自身發(fā)揮充分的抗腫瘤作用而使得它們在腫瘤治療中有用。因此，可以用設(shè)計為破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性試劑標(biāo)記腫瘤特異性抗體。
另一個靶向方法是血管特異性靶向，其中被靶向的是腫瘤脈管系統(tǒng)，而不是腫瘤本身。由于腫瘤脈管系統(tǒng)在所有實(shí)體瘤生長和生存中的重要作用，所以它已變?yōu)榘┌Y治療的主要靶(Folkman，J.1997CancerPrinciples and Practice of Oncology.Lippincott-Raven，New York.pp.3075-3087)。這是因?yàn)檫B續(xù)的腫瘤生長需要新血管生長(血管生成)(Risau，W.1997.Mechanisms of angiogenesis.Nature 386671-674；Zetter，B.R.1998.Angiogenesis andtumor metastasis.Annu.Rev.Med.49407-424；和Bicknell，R.1997.Tumor Angiogenesis.0xford University Press，0xford.pp.19-28)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)αvβ3整聯(lián)蛋白是腫瘤特異性的，因此是極好的腫瘤靶(Brooks，P.C.，Clark，R.A.和Cheresh，D.A.1994.Requirement of vascular integrin αvβ3 for angiogenesis.Science 264569-571)。已經(jīng)開發(fā)了αvβ3整聯(lián)蛋白特異性抗體(Tarli，L.，Balza，E.，Viti，F(xiàn).，Borsi，L.，Castellani，P.，Berndorff，D.，Dinkelborg，L.，Neri，D.和Zardi，L.1999.A high-affinity human antibody that targets tumoral bloodvessels.Blood 94192-198；Marty，C.，Scheidegger，P.，Ballmer-Hofer，K.，Klemenz，R.和Schwendener，R.A.2001.Production of functionalized single-chain Fv antibodyfragments binding to the ED-B domain of the B-isoform offibronectin in Pichia pastoris.Protein Expression andPurification 21156-164)并用于攜帶免疫毒素靶向腫瘤(Carnemolla，B.，Borsi，L.，Balza，E.，Castellani，P.，Meazza，R.，Berndt，A.，F(xiàn)errini，S.，Kosmehl，H.，Neri，D.和Zardi，L.2002.Enhancement of the antitumor properties ofinterleukin-2 by its targeted delivery to the tumor bloodvessel extracellular matrix.Blood 991659-1665)。另一方面，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)用于鑒定含有Arg-Gly-Asp(RGD)基序的一組肽并導(dǎo)向腫瘤，所述肽與αvβ3整聯(lián)蛋白具有高親和力(Pasqualini，R.，Koivunen，E.和Ruoslahti，E.1997.αv integrins asreceptors for tumor targeting by circulating ligands.NatureBiotech.15542-546；Assa-Munt，N.，Jia，X.，Laakkonen，P.和Ruoslahti，E.2001.Solution structures and integrin bindingactivities of an RGD peptide with two isomers.Biochemistry402373-2378)。這些肽具有攜帶毒素靶向腫瘤新脈管系統(tǒng)的潛力，如前細(xì)胞凋亡(pro-apoptotic)肽。(Ellerby，H.M.，Arap，W.，Ellerby，L.M.，Kain，R.，Andrusiak，R.，DelRio，G.，Krajewski，S.，Lombardo，C.R.，Rao，R.，Ruoslahti，E.，Bredesen，D.E.和Pasqualini，R.1999.Anti-cancer activity of targetedpro-apoptotic peptides.Nature Med.51032-1038)。
需要具有很少不良副作用或沒有副作用以及對腫瘤細(xì)胞的破壞和除去具有高特異性和徹底性的腫瘤療法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含靶向部分(TP)和觸發(fā)免疫反應(yīng)部分(IRTP)的抗腫瘤劑。TP可以是抗體片段或腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽。在一些實(shí)施方案中，抗體片段是單鏈抗體。在其它實(shí)施方案中，腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)或甘氨酸-絲氨酸-亮氨酸(GSL)。IRTP可以是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，顯示出與Fc區(qū)相同的生物學(xué)功能的IgG Fc片段的片段，或外源主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，抗腫瘤劑用于抑制腫瘤生長。在其它實(shí)施方案中，抗腫瘤劑用于抑制腫瘤血管生成。在一些實(shí)施方案中，抗腫瘤劑用于治療與新血管形成相關(guān)的疾病，如癌癥。
除基因治療方法之外，這里預(yù)期使用細(xì)菌發(fā)酵技術(shù)來大規(guī)模制備RGD/mFc融合蛋白的方法作為另一個選擇。
附圖簡述

圖1.RGD/mFc融合蛋白的圖。RGD＝肽ACDCRGDCFCG；H＝小鼠IgG的鉸鏈區(qū)；CH2和CH3＝小鼠IgG的Fc結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)。
圖2A-B.RGD/mFc表達(dá)的檢測。(A)正常B16F0細(xì)胞和表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞(B16F0/RGD/mFc)的FACS分析，(B)上清液的蛋白印跡分析。1、來自試劑盒的陽性對照；2、來自正常B16F0細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液；3、來自RGD/mFc B16F0細(xì)胞的上清液。
圖3A-F.Matrigel植入物的熒光顯微鏡術(shù)分析。(A)不含B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物、(B)20μm不含B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物的冷凍切片、(C)含有正常B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物、(D)20μm含正常B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物的冷凍切片、(E)含有表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物、(F)20μm含有表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物的冷凍切片。
圖4.Matrigel植入物的免疫組織化學(xué)分析。(A)無B16F0細(xì)胞的Matrigel、(B)含有B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物、(C)含有表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物。
圖5.腫瘤的免疫組織化學(xué)分析。(A)表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞(左側(cè)小鼠)和正常B16F0細(xì)胞(右側(cè)小鼠)的代表性腫瘤；(B)來自注射正常B16F0細(xì)胞的小鼠的腫瘤；(C)來自注射表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的小鼠的腫瘤；(D)腫瘤微血管密度。
圖6.腫瘤生長研究。正方形＝來自注射正常B16F0細(xì)胞的小鼠的腫瘤；菱形＝來自注射表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的小鼠的腫瘤；***＝P＜0.001。
圖7.存活研究。給C57BL/6J小鼠(8只小鼠/組)皮下注射2×105個B16F0細(xì)胞或表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到直徑20mm時，認(rèn)為該小鼠死亡。
圖8.編碼H-2Kd的胞外結(jié)構(gòu)域(核苷酸1-912)、鉸鏈區(qū)(核苷酸912-975)、抗PSMA重鏈可變區(qū)(核苷酸976-1326)、接頭序列(核苷酸1327-1410)和抗PSMA輕鏈可變區(qū)(核苷酸1411-1749)的核酸序列。
圖9A-B.(A)H2Kd/scPSMA融合蛋白的圖。scFv＝作為單鏈的抗人PSMA的輕鏈和重鏈可變區(qū)；MHC＝小鼠H-2Kd的胞外結(jié)構(gòu)域(B)質(zhì)粒pH2-Kd/PSMAVH+VL轉(zhuǎn)染的B16F0細(xì)胞克隆的RT-PCR分析。泳道1標(biāo)記；泳道 2克隆#1；泳道 3克隆# 2；泳道 4克隆# 3；泳道 5克隆# 7；泳道 6B16F0。
圖10A-D.pH2-Kd/PSMAVH+VL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16F0穩(wěn)定細(xì)胞系中H2Kd/scPSMA表達(dá)的FACS分析。(A)用FITC綴合的抗H-2Kd抗體對細(xì)胞系#3細(xì)胞進(jìn)行染色，(B)用FITC綴合的抗小鼠IgG抗體對細(xì)胞系#3細(xì)胞進(jìn)行染色，(C)用FITC綴合的抗H-2Kd抗體對細(xì)胞系#7細(xì)胞進(jìn)行染色，(D)用FITC綴合的抗小鼠IgG抗體對細(xì)胞系#7細(xì)胞進(jìn)行染色。虛線是同種型對照。
圖11A-B.肺轉(zhuǎn)移分析。(A)肺腫瘤結(jié)節(jié)，(B)腫瘤總重量(***P＜0.001)。1組B16F0細(xì)胞；2組B16F0/PSMA細(xì)胞；3組B16F0/H2Kd/scPSMA細(xì)胞；4組B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA細(xì)胞，克隆#3；5組B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA細(xì)胞，克隆#7。
圖12.存活研究。菱形＝B16F0細(xì)胞；正方形＝B16F0/PSMA細(xì)胞；圓形＝B16F0/H2Kd/scPSMA細(xì)胞；田字格＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#3細(xì)胞；和三角形＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#7細(xì)胞。
圖13.腫瘤生長研究。菱形＝B16F0細(xì)胞；正方形＝B16F0/PSMA細(xì)胞；圓形＝B16F0/H2Kd/scPSMA細(xì)胞；三角形＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#3細(xì)胞；和田字格＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#7細(xì)胞。
圖14.人前列腺細(xì)胞的腫瘤生長研究。正方形＝遠(yuǎn)距離腫瘤；菱形＝注射腫瘤；和圓形＝對照腫瘤。垂直箭標(biāo)表示病毒顆粒直接注射入腫瘤的時間。
圖15.TC-1細(xì)胞的腫瘤生長研究。正方形＝遠(yuǎn)距離腫瘤；菱形＝注射腫瘤；圓形＝對照腫瘤(LacZ)；和三角形＝對照腫瘤(PBS)。垂直箭標(biāo)表示病毒顆粒直接注射入腫瘤的時間。
圖16.通過腺病毒送遞的RGD/mFc在DU-145人前列腺腫瘤細(xì)胞中的抗腫瘤生長。給三組裸鼠(5只小鼠/組)中的每只雙脅腹皮內(nèi)注射5×106個DU-145腫瘤細(xì)胞。從第21天開始，將編碼RGD/mFc或LacZ的腺病毒顆粒(108PFU/50μl PBS)注射到右脅腹腫瘤中。以三天的間隔重復(fù)注射四次。從第21天開始測量腫瘤并提供平均腫瘤體積?？招膱A注射編碼Lac Z的腺病毒顆粒的腫瘤；空心菱形注射編碼RGD/mFc的腺病毒顆粒的腫瘤；空心正方形右脅腹腫瘤接受編碼RGD/mFc的腺病毒顆粒的小鼠左脅腹腫瘤。箭標(biāo)表示載體注射。
圖17.通過腺病毒送遞的RGD/mFc在TC-1細(xì)胞中的抗腫瘤生長。給三組C57BL/6J小鼠(8只小鼠/組)雙脅腹皮內(nèi)注射2×105個TC-1腫瘤細(xì)胞。從第10天開始，將編碼RGD/mFc的腺病毒顆粒(108PFU/50μl PBS)注射到右脅腹腫瘤中。在一個對照組中，將等量編碼Lac Z的腺病毒顆粒注射到右脅腹腫瘤；在另一個對照組中，注射1XPBS。以三天的間隔重復(fù)注射四次。從第十天開始測量腫瘤并提供平均腫瘤體積。空心三角形注射PBS的腫瘤；空心圓注射編碼LacZ的腺病毒顆粒的腫瘤；空心菱形注射編碼RGD/mFc的腺病毒顆粒的腫瘤；空心正方形右脅腹腫瘤接受編碼RGD/mFc的腺病毒顆粒的小鼠左脅腹腫瘤。箭標(biāo)表示載體注射。
詳述本發(fā)明提供了選擇性破壞靶細(xì)胞，像癌細(xì)胞的組合物和方法。該組合物是包含與IRTP連接的TP的抗腫瘤劑。TP特異性結(jié)合靶細(xì)胞，而IRTP觸發(fā)引起細(xì)胞被破壞的免疫反應(yīng)。也描述了制備和使用該抗腫瘤劑的方法。
靶向部分(TP)TP可以是能夠選擇性結(jié)合靶細(xì)胞的任何部分。例如，TP可以是抗體片段或腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽。
在一些實(shí)施方案中，TP是選擇性結(jié)合靶細(xì)胞的抗體片段。本發(fā)明有效的抗體片段是F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv等等，包括雜合片段。也有用的是保留免疫球蛋白的高變抗原結(jié)合區(qū)并具有類似或小于Fab′片段大小的任何亞片段。這將包括基因工程改造的和/或重組蛋白，無論單鏈或多鏈，它整合抗原結(jié)合位點(diǎn)和此外以與天然免疫球蛋白片段基本相同的方式在體內(nèi)起靶向載體的作用。優(yōu)選抗體片段是單鏈抗體。
Fv片段大約為25,000道爾頓，是由含有完全抗原結(jié)合位點(diǎn)的IgG和IgM產(chǎn)生的最小片段。Fv片段具有與Fab(50,000道爾頓)相同的結(jié)合性能和相似的三維結(jié)合特征。Fv片段的VH和VL鏈通過非共價相互作用結(jié)合在一起。這些鏈在稀釋后傾向于分離，因此已經(jīng)開發(fā)了方法以通過戊二醛、分子間二硫化物或肽接頭交聯(lián)這些鏈。通過重組技術(shù)也可以產(chǎn)生二價單鏈抗體。
在本發(fā)明的方法中可以利用二價單鏈抗體片段或亞片段，如(sFv)2和(sFv′)2。(sFv)2和(sFv′)2抗體片段具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)并可以提供比具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的單價抗體更好的對抗原的靶向和親合力，所述單價抗體如Fab′、Fab、Fv或Fv′。片段(sFv)2和(sFv′)2分子量類似于Fab′(55,000道爾頓)，但是是二價的而不是單價的，因此提供了對損害相關(guān)抗原具有更好親和力和特異性的抗體片段。
在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的抗體片段識別的腫瘤抗原可以位于被靶向的腫瘤的細(xì)胞表面?，F(xiàn)在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了很多實(shí)體瘤相關(guān)抗原，并且抗體的制備和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。當(dāng)然，最終選擇的腫瘤抗原將依賴于待靶向的特定腫瘤。優(yōu)選的腫瘤抗原是前列腺特異性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、CO17-1A和HER-2/neu。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體片段是單鏈抗體。
在其它實(shí)施方案中，TP是腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽。用細(xì)胞毒性劑靶向腫瘤新脈管系統(tǒng)由于幾個理由而是有利的。首先，靶細(xì)胞是靜脈內(nèi)施用的治療劑可直接接近的，從而允許高百分比注射劑量迅速定位(Kennel等，1991)。其次，由于每個毛細(xì)血管為它的腫瘤圍繞“帶”的成千上萬個細(xì)胞提供氧氣和養(yǎng)分，因此即使腫瘤脈管系統(tǒng)的有限損傷亦可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的涌至(Denekamp，1990；Denekamp，1984)。
腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽可以是靶向或?qū)蚰[瘤脈管系統(tǒng)的任何肽。已經(jīng)鑒定了靶向腫瘤脈管系統(tǒng)的幾個肽基序。例如，通過給攜帶人乳腺癌異種移植物的裸鼠的循環(huán)系統(tǒng)注射噬菌體肽文庫，Arap等鑒定了導(dǎo)向腫瘤的三個肽基序(Arap等，Science，279377-380，1998)。使用相似的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法可以鑒定另外的腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽。本發(fā)明可用的示例性腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽是包含Arg-Gly-Asp(RGD)基序、Asn-Gly-Arg(NGR)基序或Gly-Ser-Leu(GSL)基序的肽。
腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽可以是任何長度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽包含3-15個氨基酸。更優(yōu)選，該肽包含11個氨基酸。該肽可以是線狀或環(huán)狀形式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽是環(huán)狀的。
觸發(fā)免疫反應(yīng)部分(IRTP)IRTP可以是能夠觸發(fā)免疫反應(yīng)的任何部分。例如，IRTP可以是選自下組的部分免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段、顯示出與Fc區(qū)相同生物學(xué)功能的IgG的Fc片段的片段、外源的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的胞外結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段負(fù)責(zé)抗體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)(Abbas，A.K.，Lichtman，A.H.和Pober，J.S.2000.Cellular andMolecular Immunology，W.B.Saunders Company，Philadelphia，Pennsylvania，pp.60-61)。首先，F(xiàn)c可以觸發(fā)嗜中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的吞噬作用，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞表達(dá)Fc受體。其次，F(xiàn)c能夠活化天然殺傷細(xì)胞以裂解攜帶Fc的細(xì)胞(Hu，Z.和Garen，A.，2000，Intratumoral injection of adenoviral vectors encodingtumor-targeted immunoconjugates for cancer immunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 979221-9225)。第三，IgG的Fc部分通過與補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合可以觸發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)。IgG的Fc片段已被用作通過與其它靶向蛋白如組織因子融合而抑制腫瘤中的功能性基序(Hu，Z.和Garen，A.，2000，Intratumoral injection ofadenoviral vectors encoding tumor-targeted immunoconjugatesfor cancer immunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 979221-9225；Hu，Z.和Ga ren，A.2001.Targeting tissue factoron tumor vascular endothelial cells and tumor cells forimmunotherapy in mouse models of prostatic cancer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9812180-12185)。
Fc片段可以源自于任何IgG。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c片段源自于哺乳動物IgG。可以得到IgG的示例性哺乳動物是人、小鼠、山羊、母牛和綿羊。IRTP還可以是顯示出與整個Fc片段相同生物學(xué)功能的IgG的Fc片段的片段。
在其它實(shí)施方案中，IRTP是外源主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的胞外結(jié)構(gòu)域?？梢允褂萌魏蜯HC的胞外結(jié)構(gòu)域作為發(fā)明的抗腫瘤劑中的IRTP。已經(jīng)表明外源MHC觸發(fā)免疫反應(yīng)。當(dāng)MHC分子通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)回腫瘤細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞的致瘤性顯著降低(Tanaka，K.，Isselbacher，K.J.，Khoury，G.和Jay，G.1985.Reversal ofoncogenesis by the expression of a major histocompatibilitycomplex class I gene.Science.22826-30；Nabel，G J.，Yang，Z.Y.，Nabel，E.G.，Bishop，K.，Marquet，M.，F(xiàn)elgner，P.L.，Gordon，D.和Chang，A.E.1995.Direct gene transfer fortreatment of human cancer.Ann.N.Y.Acad.Sci.772227-231)，特別是當(dāng)轉(zhuǎn)移外源的MHCs時(O′neil，B.H.，Kawakami，Y.，Restifo，N.P.，Bennink，J.R.，Yewdell，J.W.和Rosenberg，S.A.1993.Detection of shared MHC-restricted human melanomaantigens after vaccinia virus-mediated transduction of genescoding for HLA.J.Immunol.1511410-1418；Nabel，E.G.，Bishop，K.，Marquet，M.，F(xiàn)elgner，P.L.，Gordon，D.和Chang，A.E.1995.Direct gene transfer for treatment of human cancer.Ann.N.Y.Acad.Sci.772227-231.)。術(shù)語“外源的”意思指MHC源自于除待用抗腫瘤劑治療的生物之外的生物，或MHC源自于其MHC與待用抗腫瘤劑治療的個體不匹配的個體。示例性的MHCs是H-2Kd和HLA-A0101。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，TP是包含RGD基序的腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽(ACDCRGDCFCG)，且IRTP是小鼠IgG C末端的Fc片段。RGD肽結(jié)合腫瘤脈管系統(tǒng)的αvβ3整聯(lián)蛋白，且Fc部分激活免疫反應(yīng)，包括補(bǔ)體系統(tǒng)、NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞以破壞表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白的腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
近來研究證明不僅新脈管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞，而且大部分腫瘤細(xì)胞都表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白(Pasqualini等，Nature Biotech.15542-46(1997))。因此，RGD/mFc融合蛋白應(yīng)該靶向新血管和現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞。結(jié)果，這些融合蛋白可以代表除抑制腫瘤生長外可以根除腫瘤的試劑。
合成方法抗腫瘤劑的TP和IRTP通過鍵合相互作用彼此連接。在一些實(shí)施方案中，TP和IRTP通過TP肽主鏈中的原子和IRTP肽主鏈中的原子之間形成的鍵連接。這里這類連接稱作“主鏈-主鏈”連接。在其它實(shí)施方案中，TP和IRTP通過TP肽主鏈中的原子和IRTP氨基酸側(cè)鏈(表面)的原子之間形成的鍵連接。TP和IRTP也可以通過TP氨基酸側(cè)鏈(表面)的原子和IRTP肽主鏈的原子之間形成的鍵連接。這里這類連接稱作“主鏈-側(cè)鏈”連接。在一些實(shí)施方案中，TP和IRTP彼此直接連接，而在其它實(shí)施方案中，TP和IRTP之間有連接區(qū)。
TP和IRTP可以通過宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白以主鏈-主鏈連接而連接。在這個實(shí)施方案中，抗腫瘤劑作為TP和IRTP的融合蛋白以分泌形式表達(dá)。使包含編碼信號肽的核酸序列之后的編碼TP和IRTP的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白并使用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)純化該蛋白。宿主細(xì)胞表達(dá)所需融合蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
TP和IRTP也可以以主鏈-側(cè)鏈連接進(jìn)行連接。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地完成IRTP和TP之間的主鏈-側(cè)鏈連接。通過主鏈-側(cè)鏈連接使IRTP和TP連接的任何方法適于本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉實(shí)現(xiàn)這種偶聯(lián)的方法。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法可以化學(xué)修飾TP，以致主鏈的每個末端是羧酸基團(tuán)。二羧化TP可以通過IRTP的表面胺與IRTP偶聯(lián)。賴氨酸側(cè)鏈中發(fā)現(xiàn)的胺可以用作表面胺。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法也可以化學(xué)修飾TP，以致主鏈的每個末端是氨基。二胺衍生的TP可以通過IRTP的表面羧酸或碳水化合物部分與IRTP偶聯(lián)。天冬氨酸或谷氨酸殘基的側(cè)鏈中發(fā)現(xiàn)的羧酸可以用作表面羧酸。例如，IgG的Fc區(qū)的碳水化物部分可以與已被衍生而在其C末端具有NH2基的TP偶聯(lián)。
或者，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法可以化學(xué)修飾IRTP，以致主鏈的每個末端是羧酸基團(tuán)。二羧化IRTP可以通過TP的表面胺與TP偶聯(lián)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法也可以化學(xué)修飾IRTP，以致主鏈的每個末端是氨基。二胺衍生的IRTP可以通過TP的表面羧酸或碳水化合物部分與TP偶聯(lián)。
實(shí)現(xiàn)這種偶聯(lián)的示例性方法是EDC介導(dǎo)的TP的C末端羧酸與乙二胺的偶聯(lián)，其中EDC是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。然后衍生的TP通過它的碳水化物部分經(jīng)由碳水化合物氧化、席夫堿形成和還原作用與IRTP偶聯(lián)。許多蛋白含有由于糖基化作用產(chǎn)生的碳水化合物部分。例如，碳水化物部分位于IgG的Fc區(qū)。
在一些實(shí)施方案中，IRTP和TP通過剪接方法偶聯(lián)。Muir等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 6705-6710(1998)和Evans，Jr.等.Protein Science 7 2256-2264(1998)描述了示例性的剪接方法，它們的整體內(nèi)容并入這里。
在其它實(shí)施方案中，連接可以是“側(cè)鏈與側(cè)鏈”連接。這種連接可以通過IRTP上的表面羧酸與TP上的表面胺偶聯(lián)或通過TP上的表面胺與TP上的表面羧酸偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)。
藥物組合物本發(fā)明的另一個方面是包含本發(fā)明抗腫瘤劑和藥物適合載體或賦形劑的藥物組合物。在本發(fā)明的一些方面，該藥物組合物包含含有編碼本發(fā)明抗腫瘤劑的DNA序列的載體和藥物適合載體或賦形劑。
雖然本發(fā)明的抗腫瘤劑或含有編碼本發(fā)明抗腫瘤劑的DNA序列的載體可以單獨(dú)施用于患者，但是本發(fā)明的抗腫瘤劑或載體也可以作為藥物制劑的一部分存在。藥物合適的賦形劑通常包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體，包括藥物佐劑。通常，這些藥物可接受載體包括水、鹽水、緩沖液和如在MERCK INDEX，Merck & Co.，Rahway，N.J.中描述的其它化合物，也見Bioreversible Carriers in Drug Design，Theory and Application，Roche(ed.)，Pergamon Press，(1987)。這些制劑通常包含治療或藥物有效量的藥理學(xué)試劑(即抗腫瘤劑)連同一種或多種藥物或治療可接受載體和任選其它治療成分。在Gilman等.(eds.)(1990)Goodman和GilmanThe Pharmacological Basesof Therapeutics，8th Ed.，Pergamon Press；Novel Drug DeliverySystems，2nd Ed.，Norris(ed.)Marcel Dekker Inc.(1989)和Remington′s Pharmaceutical Sciences中描述了各種考慮事項(xiàng)，其全部公開內(nèi)容并入這里作為參考。
該組合物可以配制成適合于所需施用途徑的任何藥物形式。這種組合物的實(shí)例包括口服施用的固體組合物，如片劑、膠囊、丸劑、粉末和顆粒，它們可被腸溶衣包衣或受到其他保護(hù)而不被水解，特別是酶水解，口服施用的液體組合物，如溶液、懸浮液、糖漿或酏劑，和腸胃外施用的制劑，如無菌溶液、懸浮液或乳劑。該組合物也可以制成無菌固體組合物的形式，它可以在使用之前立即溶于無菌水、生理鹽水或一些其它無菌注射介質(zhì)。
由于本發(fā)明的抗腫瘤劑是兩性的，所以它可以用作游離堿，用作酸加成鹽或用作金屬鹽。該鹽必須是藥物可接受的，且這些將包括金屬鹽，特別是堿和堿土金屬鹽，合適地是鉀或鈉鹽?？衫酶鞣N藥物可接受的酸加成鹽。這些包括由有機(jī)和無機(jī)酸制備的那些，優(yōu)選無機(jī)酸?？梢耘e例提及的一般的酸類包括檸檬酸、琥珀酸、乳酸、鹽酸和氫溴酸。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法可容易地制備這些產(chǎn)物。
在所有這種組合物中，抗腫瘤劑或載體通常將是主要的生理活性成分。然而，抗腫瘤劑或載體可以與另外的藥物試劑一起配制用于組合治療。例如，當(dāng)用于治療癌癥時，它可以與相容的常規(guī)化療劑一起配制。
在前述Gilman等(eds.)(1990)和Norris(ed.)中也探討了施用方法。尤其是，本發(fā)明的藥物組合物可以靜脈內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)皮施用，如在(Prausnitz，M.R.，Bose，VG，Langer，R，Weaver，JCElectroporation of Mammalian skina mechanism to enhancetransdermal drug delivery.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.，9010504-10508(1993)；和Wallace，B M，Lasker，J SStand andDelivergetting peptide drugs into the body.Science 260912-912(1992)的方法中。也可以使用脂質(zhì)體來施用本發(fā)明的細(xì)胞毒素原(procytotoxin)。(見Woodle，M C，Storm，G，Newman，M S，Jekot，J J，Collins，L R，Martin，F(xiàn) J，Szoka F CProlonged systemicdelivery of peptide drugs by long circulating liposomesillustration with vasopressin in the Brattleboro rat.Pharmaceut.Res.9260-265(1992)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對于給定哺乳動物宿主的最佳送遞途徑、劑量和方案。當(dāng)然，將認(rèn)識到使用的實(shí)際劑量將根據(jù)配制的特定組合物、使用的特定化合物、應(yīng)用模式和特定部位、宿主和要治療的疾病而變化。將考慮改變藥物作用的許多因素，包括年齡、體重、性別、飲食、施用時間、施用途徑、排泄率、患者的狀況、藥物組合、反應(yīng)敏感性和疾病的嚴(yán)重性。
治療方法本發(fā)明的抗腫瘤劑在各種治療方法中有用?？鼓[瘤劑可以單獨(dú)或作為如上所述的藥物組合物施用。在一些實(shí)施方案中，抗腫瘤劑用在抑制腫瘤生長的方法中。在其它實(shí)施方案中，抗腫瘤劑用在抑制血管生成的方法中。在一些實(shí)施方中，抗腫瘤劑用于治療與新血管形成相關(guān)的疾病，如癌癥的方法中。
該抗腫瘤劑可用于治療各種癌癥，如原發(fā)或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤，包括肺、結(jié)腸直腸、膀胱、前列腺、乳房、腎、腦、胰腺、黑素瘤、頭和頸部和卵巢的癌癥。
該方法可以在體外或體內(nèi)實(shí)施。示例性的體外方法可以包括使細(xì)胞接觸有效量的抗腫瘤劑。示例性的體內(nèi)方法包括給有需要的患者施用有效量的抗腫瘤劑。如這里使用的，術(shù)語“患者”包括人和其它物種；因此本發(fā)明兼具醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)應(yīng)用。
下列實(shí)施例舉例說明了這些治療方法。例如，注射表達(dá)RGD/mFc融合蛋白的B16F0細(xì)胞的小鼠腫瘤具有顯著較少的新血管，并且小于注射B16F0細(xì)胞的小鼠腫瘤。參見圖5和6。另外，注射表達(dá)RGD/mFc融合蛋白的B16F0細(xì)胞的小鼠具有比注射B16F0細(xì)胞的小鼠更好的存活率。參見圖7。靜脈內(nèi)注射B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA細(xì)胞的小鼠與對照組相比產(chǎn)生顯著較少的腫瘤結(jié)節(jié)。參見圖11A。注射B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA細(xì)胞的小鼠的腫瘤大小小于對照小鼠的腫瘤。參見圖11B。存活研究表明融合蛋白H2Kd/scPSMA顯著提高了總存活。參見圖12。當(dāng)小鼠皮內(nèi)注射時獲得類似的結(jié)果。參見圖13。另外，注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒的小鼠腫瘤小于注射包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒的小鼠腫瘤。參見圖14和15。
實(shí)施例實(shí)施例1-3的材料和方法動物。6-8周齡雌性C57BL/6J小鼠購自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)并飼養(yǎng)在無病原體的動物設(shè)施中。
細(xì)胞系。在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah)和50μg/ml慶大霉素(GIBCO BRL)的DMEM(GIBCO BRL，Grand Island，NY)中培養(yǎng)B16F0小鼠黑素瘤細(xì)胞(ATCC#CRL 6322，Rockville，MD)。如這里使用的，術(shù)語“正常B16F0細(xì)胞”意思是沒有以任何方式改變的B16F0細(xì)胞(即這些細(xì)胞沒有被改變而表達(dá)RGD/mFc或已表達(dá)PMSA)。
蛋白印跡和FACS分析。將B16F0細(xì)胞和表達(dá)RGD/mFc的B16F0的上清液在SDS-PAGE上電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。融合蛋白被抗Fc片段抗體(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)和SuperSignal West Pico Chemi luminescent檢測試劑盒(Pierce，Rockford，IL)識別。也通過細(xì)胞內(nèi)熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析表達(dá)RGD/mFc的穩(wěn)定細(xì)胞系。簡言之，蛋白分泌物被阻斷，并用Cytofix/Cytoperm Plus試劑盒(BD PharMingen，San Diego，CA)透化細(xì)胞。然后用FITC綴合的抗小鼠Fc抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色并使用FACS Calibur(Becton/Dickinson，San Jose，CA)分析細(xì)胞。
Matrigel栓。將基因工程改造而表達(dá)RGD/mFc蛋白的5×105個B16F0細(xì)胞與0.2ml液體Matrigel(Becton/Dickinson)混合并皮下注射給雌性C57BL/6J小鼠。也完成兩個對照實(shí)驗(yàn)。在一個對照實(shí)驗(yàn)中，將0.2ml的液體Matrigel皮下注射給雌性C57BL/6J小鼠。在第二對照實(shí)驗(yàn)中，將5×105個B16F0細(xì)胞與0.2ml的液體Matrigel混合并皮下注射給雌性C57BL/6J小鼠。在第8天，給小鼠靜脈內(nèi)注射50μg/小鼠的FITC凝集素(Sigma，St.Luis，MI)/小鼠。三十分鐘后，分離Matrigel植入物。在熒光顯微鏡下迅速觀察后，冷凍它們用于制備切片。制備厚切片(20μm)并使用熒光顯微鏡觀察。
免疫組織化學(xué)分析。將溶于0.2ml PBS的5×105個表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞皮下注射給C57BL/6J小鼠。作為對照實(shí)驗(yàn)，將溶于0.2ml PBS的5×105個B16F0細(xì)胞皮下注射給C57BL/6J小鼠。十四天后，切下腫瘤并制備冷凍切片。使用這些冷凍切片制備載玻片。接著固定載玻片并用抗CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用VectastainElite ABC試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)顯像。
也通過免疫組織化學(xué)分析研究以上所述的Matrigel植入物。用冷凍切片制備載玻片。接著固定載玻片并用抗CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)顯像。
動物研究。將溶于0.2ml PBS中的2×105個表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞皮下注射給C57BL/6J小鼠。作為對照實(shí)驗(yàn)，將溶于0.2ml PBS中的2×105個B16F0細(xì)胞皮下注射給C57BL/6J小鼠。用數(shù)字測徑器測量腫瘤，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并記錄。腫瘤體積計算為長×寬2。對于存活研究，當(dāng)腫瘤達(dá)到直徑20mm的大小時，認(rèn)為攜帶它的小鼠死亡。每組有8只小鼠。用斯氏T檢驗(yàn)分析腫瘤體積數(shù)據(jù)。
實(shí)施例1RGD/mFc融合蛋白的構(gòu)建RGD/Mfc融合蛋白載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染入B16F0腫瘤細(xì)胞。使用PCR擴(kuò)增小鼠IgG cDNA序列(ATCC#MGC-6628)的Fc片段(從鉸鏈區(qū)至cDNA末端，741bp)。設(shè)計一對引物(顯示如下)用于PCR反應(yīng)。在5′引物N-末端，在酶切位點(diǎn)(HindIII)之后，添加編碼ACDCRGDCFCG肽的序列。將BamHI酶切位點(diǎn)添加到3′引物N-末端。
5’引物CCAAGCTTGCCTGCGACTGCCGAGGAGATTGTTTCTGCGGCGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGC3’引物CGGGATCCCGTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG在上游引物5′末端，HindIII酶切位點(diǎn)之后，添加編碼ACDCRGDCFCG肽的序列。將BamHI酶切位點(diǎn)添加到下游引物5′末端。
然后將PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體pSecTag2B(含有有用的組氨酸標(biāo)簽)中，其在閱讀框中，位于信號肽序列之后。經(jīng)測序證實(shí)全部序列。然后，使用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)制造商的規(guī)程(Gibco BRL)將產(chǎn)生的載體pRGD/mFc轉(zhuǎn)染入B16F0腫瘤細(xì)胞。從含有200或500μg/ml Zeocin(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM中選擇穩(wěn)定細(xì)胞系3-4周。
RGD/mFc表達(dá)。圖1顯示了融合蛋白RGD/mFc的圖。它含有前面的RGD肽序列(ACDCRGDCFCG)，后面是小鼠IgG的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。為證實(shí)融合蛋白的表達(dá)，將載體pRGD/mFc線性化并轉(zhuǎn)染入B16F0黑素瘤細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。使用抗小鼠Fc片段抗體的細(xì)胞內(nèi)FACS分析證明蛋白在這些細(xì)胞中表達(dá)(圖2A)，且蛋白印跡分析表明該蛋白分泌到培養(yǎng)基中(圖2B)。
實(shí)施例2RGD/mFc融合蛋白引起的腫瘤血管生成的抑制使用熒光顯微鏡觀察Matrigel植入物的切片。對于第一個對照實(shí)驗(yàn)(僅僅Matrigel皮下注射給小鼠)，觀察到Matrigel植入物表面上的一些血管，如圖3A所示。植入物內(nèi)沒有觀察到血管。對于第二個對照實(shí)驗(yàn)(B16F0細(xì)胞和Matrigel皮下注射給小鼠)，B16F0腫瘤細(xì)胞顯著促進(jìn)Matrigel植入物中新血管形成，如圖3C和3D所示。相反，對于B16F0細(xì)胞被基因工程改造而表達(dá)RGD/mFc蛋白和Matrigel皮下注射給小鼠的實(shí)驗(yàn)，Matrigel植入物中新血管的形成顯著減少，如圖3E和3F所示，表明RGD/Fc融合蛋白具有抗血管生成活性。
來自Matrigel植入物的切片的免疫組織化學(xué)分析表明與含正常B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物相比，在含表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的Matrigel植入物中不僅血管顯著減少，而且腫瘤細(xì)胞塊也小得多(參見圖4)。在另一個腫瘤模型TC-1中，觀察到類似的抗血管生成作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
為進(jìn)一步證實(shí)這些觀察結(jié)果，將腫瘤細(xì)胞(溶于PBS的B16F0細(xì)胞或溶于PBS的表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞)皮下注射給小鼠。十四天后，切下腫瘤和制備冰凍切片載玻片，用抗CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。與來自正常B16F0細(xì)胞的腫瘤相比，在來自表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的腫瘤中再次觀察到顯著較少的新血管(參見圖5B和5C)。注意到B16F0細(xì)胞和表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的腫瘤大小之間有顯著差異(見圖5A)。圖4C和5C中Matrigel植入物中表達(dá)RGD/mFc的腫瘤和無Matrigel的腫瘤之間的腫瘤細(xì)胞數(shù)目的明顯差異是這兩個腫瘤模型中不同細(xì)胞密度的假象。
實(shí)驗(yàn)3RGD/mFc融合蛋白引起的腫瘤生長抑制為統(tǒng)計測定RGD/mFc融合蛋白是否抑制腫瘤生長，將表達(dá)RGD/mFc蛋白的B16F0腫瘤細(xì)胞皮下注射給雌性C57BL/6J小鼠。作為對照實(shí)驗(yàn)，將B16F0腫瘤細(xì)胞注射給單獨(dú)小鼠組。測量腫瘤體積，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖。如圖6所示，觀察到來自對照實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤和來自注射了表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的小鼠的腫瘤之間有顯著的大小差異。來自對照實(shí)驗(yàn)的小鼠腫瘤比來自注射了表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的小鼠腫瘤大。例如，在第21天，觀察到腫瘤大小有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(p＜0.001)。
也監(jiān)控注射了表達(dá)RGD/mFc的B16F0細(xì)胞的小鼠的存活情況。如圖7所示，RGD/mFc融合蛋白顯著延長小鼠的存活時間。當(dāng)腫瘤達(dá)到直徑20mm的大小時，認(rèn)為小鼠死亡。在第45天，攜帶表達(dá)RGD/mFc的細(xì)胞的75％的小鼠仍活著，而對照組的所有小鼠(注射未改變的B16F 0細(xì)胞的小鼠)在第20天之前死亡(圖7)。
實(shí)施例4-5的材料和方法實(shí)施例4DH2-Kd/PMSAVH+VL的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染與H2Kd/scPSMA的表達(dá)從BALB/c小鼠的淋巴細(xì)胞分離總RNA并通過RT-PCR產(chǎn)生H2-KdcDNA，所用引物為5′-CAGTGCGATGGCACCCTGCACGC-3′和5′-GGCAGCTGTCTTCACGCTAGAGAATG-3′，并將H2-KdcDNA插入載體pCR2.1(pH2-Kd)。通過反轉(zhuǎn)錄和5’-RACE從分離自7E11雜交瘤細(xì)胞系(ATCC#HB10494)的總RNA克隆編碼抗人PSMA重鏈的cDNA序列，其中反轉(zhuǎn)錄使用恒定區(qū)3′引物5′-GACACTGGGATCATTTACCAGGAGAG-3′而5′-RACE使用引物5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′和5′-GACACTGGGATCATTTACCAGGAGAG-3′。
然后將該cDNA插入載體pCR4-TOPO(pPSMAH)。類似地，通過用寡聚dT引物反轉(zhuǎn)錄及使用如下引物的擴(kuò)增來克隆編碼抗人PSMA輕鏈的cDNA序列5′-CGACUGGAGCACGAGGACACUGA-3′和5′-GAGCTGGTGGTGGCGTCTCAG-3′(pPSMAL)。
通過PCR從pH2-Kd擴(kuò)增H-2KdcDNA的胞外結(jié)構(gòu)域，所用引物為5′-GGAATTCATGGCACCCTGCACGCTGC-3′和5′GCTTACGTTAACCACAATCCCTGGGCAGGCGCGCCCGAGACAGTGGATGGAGGAAG-3′。
為保留下游引物5′末端的鉸鏈區(qū)，添加Hpa I限制酶切位點(diǎn)和鉸鏈區(qū)序列的一半。類似地，通過PCR從pPSMAH擴(kuò)增抗人PSMA重鏈的可變區(qū)，所用引物為5′-ATTGTGGTTAACGTAAGCCTTGCATATGTACAGGCCGIACGACCAAGAGCACACCTGCAAATG-3′和5′-CCGCTCGAGGCTCTAGATTACCAGGTGCTGGAGGGGACAGTCAC-3′。
將Hpa I限制酶切位點(diǎn)和鉸鏈區(qū)序列的另一半添加在上游引物的5′末端。然后分別用HpaI/EcoR I和Hpa1/Xho I消化兩個PCR產(chǎn)物、連接并克隆入pCR2.1(pH2-Kd/PSMAH)。使用類似的策略，通過兩個獨(dú)立的PCR和PCR片段連接將抗人PSMA的輕鏈可變區(qū)添加到pH2-Kd/PSMA。對于pH2-Kd/PSMAH，引物是5′-GGAATTCATGGCACCCTGCACGCTGC-3′和5′GCCCCCCCGGGGGGCCCACCAGAAGCAGGGCCTCCGCTCGCCCAGGTGCTGGAGGGGACAGTC-3′且對于pPSMAL為5′GCCCCCCGGGGGGGCCTCCGGTGGCCCGGCCAGTGGGGGACCCGCATCAGGAGGCCCTGATGTTGTGATGACCCAGACTC-3′和5′-CCGCTCGAGTCACCGTTTTATCTCCAGCTTGGTCCCCCC-3′。
在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間引入接頭序列。最后的質(zhì)粒pH2-Kd/PSMAVH+VL含有下列組分H-2Kd的胞外結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、抗PSMA重鏈可變區(qū)、接頭序列和抗PSMA輕鏈可變區(qū)，如圖8所示。
然后使用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)制造商的規(guī)程(Gibco BRL)將pH2-Kd/PSMAVH+VL分別轉(zhuǎn)染入B16F0腫瘤細(xì)胞和B16F0/PSMA5細(xì)胞。使用G418抗性選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系并維持在培養(yǎng)物中。
H2Kd/scPSMA表達(dá)。圖9A顯示了H2Kd/scPSMA融合蛋白的圖。將質(zhì)粒pH2-Kd/PSMAVH+VL轉(zhuǎn)染入B16F0腫瘤細(xì)胞并選擇穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。進(jìn)行RT-PCR以檢測融合基因的轉(zhuǎn)錄物。在分析的四個穩(wěn)定克隆中，三個是RT-PCR陽性的(參見圖9B)。在RT-PCR陽性克隆當(dāng)中，分別使用抗小鼠IgG和H-2Kd抗體，通過細(xì)胞內(nèi)FACS分析進(jìn)一步證實(shí)融合蛋白表達(dá)。圖10顯示了FACS分析選擇的兩個示例性克隆。兩個克隆都表達(dá)高水平的H-2Kd的胞外結(jié)構(gòu)域(圖10A和10C)。對于融合蛋白的VHVL部分也檢測到信號(圖10B和10D)。
實(shí)施例5H2Kd/scPSMA引起的腫瘤生長抑制和總存活改善用pH2-Kd/PSMAVH+VL轉(zhuǎn)染B16F0/PSMA5細(xì)胞。獲得了幾個克隆并通過RT-PCR和細(xì)胞內(nèi)FACS分析證實(shí)H2Kd/scPSMA表達(dá)。將兩個克隆B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3和B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7，連同其它對照細(xì)胞如B16F0、B16F0/PSMA5和B16F0/H2Kd/scPSMA用于下列動物腫瘤研究。
將5×105個細(xì)胞通過尾靜脈靜脈內(nèi)注射給雌性C57BL/6J小鼠進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移測定。三周以后，殺死小鼠并計數(shù)肺上的腫瘤結(jié)節(jié)。與對照組相比，B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA細(xì)胞(克隆#3和#7)產(chǎn)生顯著降低數(shù)目的腫瘤結(jié)節(jié)(圖11A)。B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤結(jié)節(jié)大小顯著小于對照細(xì)胞產(chǎn)生的那些結(jié)節(jié)。這通過腫瘤總重量測量來監(jiān)測并在圖11B中示出。存活研究表明融合蛋白H2Kd/scPSMA顯著增加總存活(P＜0.01，圖12)。
通過在雌性C57BL/6J小鼠(8只小鼠/組)的右脅腹注射溶于0.2mlPBS中的2×105個腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行皮內(nèi)腫瘤研究。8天后，每隔一天測量腫瘤。腫瘤體積計算為長×寬2。B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA腫瘤細(xì)胞生長顯著慢于對照細(xì)胞。(B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3對B16F0，p＜0.02；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3對B16F0/PSMA，p＜0.002；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3對B16F0/H2Kd/scPSMA，p＜0.02；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7對B16F0，p＜0.03；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7對B16F0/PSMA，p＜0.003；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7對B16F0/H2Kd/scPSMA，p＜0.05)在腫瘤發(fā)展早期，這尤為正確(圖13)。在第11和14天，B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3和對照細(xì)胞之間的p值，以及B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7和對照細(xì)胞之間的p值全部小于0.001。
實(shí)施例6-7的材料和方法動物。6-8周齡雌性C57BL/6J小鼠購自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)并飼養(yǎng)在無病原體的動物設(shè)施中。
細(xì)胞系。在含有10％FBS、0.2mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和50μg/ml慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)鼠腫瘤細(xì)胞TC-1。在含有10％熱滅活馬血清、1mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氫鈉和50μg/ml慶大霉素的EMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。在含有10％FBS、1mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氫鈉和50μg/ml慶大霉素的EMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)人前列腺腫瘤細(xì)胞DU-145。
含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的構(gòu)建。將融合基因(RGD/mFc)首先克隆入穿梭載體。然后通過同源重組將含有融合基因的穿梭載體插入腺病毒載體(pAdEasy-1)形成重組Ad質(zhì)粒。線性化后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，該細(xì)胞含有腺病毒復(fù)制的必需基因。從細(xì)胞收獲病毒顆粒并滴定。
含有LacZ基因的腺病毒載體的構(gòu)建。將LacZ基因首先克隆入穿梭載體。然后通過同源重組將含有LacZ基因的穿梭載體插入腺病毒載體(pAdEasy-1)形成重組Ad質(zhì)粒。線性化后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，該細(xì)胞含有腺病毒復(fù)制的必需基因。從細(xì)胞收獲病毒顆粒并滴定。
實(shí)施例6RGD/mFc引起的前列腺腫瘤生長抑制將人前列腺腫瘤細(xì)胞(DU-145)皮下注射到裸鼠(每個部位5×106個細(xì)胞)左和右脅腹。在DU-145細(xì)胞初次注射后的11、28、32和35天，將包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒直接注射到腫瘤中(在50μl溶液中1×108PFU/腫瘤)。作為對照，在DU-145細(xì)胞初次注射后的同一天，以相同劑量注射包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒。在DU-145細(xì)胞初次注射后的第8、11、28、32、35、38、41和44天，進(jìn)行腫瘤大小的測量。腫瘤大小計算為長×寬2(參見圖14)。
用包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒注射的腫瘤大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒注射的腫瘤大小。另外，未注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒的遠(yuǎn)距離腫瘤的大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒注射的腫瘤大小。
因此，如圖17所示，與對照相比時，RGD/mFc有效抑制DU-145在裸鼠中的生長，表明抗腫瘤作用是通過補(bǔ)體系統(tǒng)或天然殺傷細(xì)胞或二者實(shí)現(xiàn)的。意外地，遠(yuǎn)距離腫瘤上RGD/mFc的抑制作用幾乎與裸鼠模型中注射的腫瘤一樣有效；而在TC-1腫瘤模型中，遠(yuǎn)距離的腫瘤被抑制，但是不如注射的腫瘤有效。不同類型細(xì)胞的RGD/mFc的抗血管生成作用可能不同，尤其是當(dāng)腫瘤細(xì)胞來自于不同物種時。有可能它們可以不同水平地表達(dá)靶分子αvβ3并且體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也可以不同。
實(shí)施例7RGD/mFc引起的TC-1腫瘤細(xì)胞生長抑制將TC-1鼠腫瘤細(xì)胞皮下注射到C57BL/6J小鼠(每個部位1×105個細(xì)胞)左和右脅腹。在TC-1細(xì)胞初次注射后的10、13、16和20天，將包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒直接注射到腫瘤中(在50μl溶液中1×108PFU/腫瘤)。作為對照，在TC-1細(xì)胞初次注射后的同一天，以相同劑量注射包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒。在TC-1細(xì)胞初次注射后的10、13、16、20、23和27天，進(jìn)行腫瘤大小的測量。腫瘤大小計算為長×寬2(參見圖15)。
用包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒注射的腫瘤大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒注射的腫瘤大小。另外，未注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒載體的病毒顆粒的遠(yuǎn)距離腫瘤的大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒載體的腺病毒顆粒注射的腫瘤大小。
實(shí)施例8RGD/mFc抗腫瘤劑的合成(“主鏈-側(cè)鏈”連接)通過在C末端羧酸基團(tuán)偶聯(lián)二胺，將蛋白序列ACDCRGDCFCG衍生化而在N和C末端含有胺。該肽溶于0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0中形成溶液A。mFc溶于0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0，濃度為1mg/ml而形成溶液B。向1ml溶液B中添加0.4mg EDC(～2mM)和0.6mg NHS。允許溶液在室溫下反應(yīng)15分鐘。添加1.4μl 2-巰基乙醇(終濃度20mM)以淬滅EDC。添加一定量的溶液A以提供相等摩爾/摩爾比的ACDCRGDCFCG和mFc。在室溫下繼續(xù)反應(yīng)2小時。通過添加羥胺至終濃度為10mM來淬滅反應(yīng)。通過凝膠過濾純化反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)9轉(zhuǎn)移性肺癌人患者的治療向診斷為轉(zhuǎn)移性肺癌的175磅男性人患者可以施用RGD/mFc抗腫瘤劑的治療?？梢越o該患者靜脈內(nèi)輸注治療有效量的抗腫瘤劑，如50mg RGD/mFc，且這種初步治療之后，可以每周一次重復(fù)治療合適的一段時間，如4周。在最后一劑RGD/mFc后合適的時間，如四個月，患者的計算機(jī)化斷層顯象掃描極好地顯示無肺癌的跡象，并且該疾病的所有病征和癥狀都不明顯。
實(shí)施例10腫瘤轉(zhuǎn)移的RGD/mFc抑制為了測定RGD/mFC是否可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，將5×105個B16F0/模擬品或表達(dá)RGD/mFC的B16F0細(xì)胞通過尾靜脈靜脈內(nèi)注射給雌性C57BL/6J小鼠。作為對照，也以同樣方式注射B16F0/模擬品細(xì)胞。表1提供了腫瘤接種后24天以肺結(jié)節(jié)衡量的肺轉(zhuǎn)移。表達(dá)RGD/mFc的兩個克隆都產(chǎn)生比對照腫瘤細(xì)胞(＞200)顯著減少的肺腫瘤結(jié)節(jié)(分別是9.625±4.09和23.875±7.98)。
表1.肺轉(zhuǎn)移試驗(yàn)
將不同腫瘤細(xì)胞系靜脈內(nèi)(i.v.)注射給C57BL/6J小鼠(5×105個/小鼠)。二十四天后，殺死小鼠并計數(shù)肺上的腫瘤結(jié)節(jié)。
實(shí)施例11腺病毒載體構(gòu)建以表達(dá)RGD/mFc使用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)構(gòu)建含RGD/mFc融合蛋白的編碼序列的重組腺病毒載體。簡言之，從pRGD/mFc擴(kuò)增RGD/mFc序列并克隆入pShuttle-CMV載體；接著將所產(chǎn)生的pShuttle-CMV/RGD/mFc轉(zhuǎn)化入BJ5183-AD-1電穿孔感受態(tài)細(xì)胞而產(chǎn)生重組腺病毒載體pAd-RGD/mFc。Pac I消化而線性化pAd-RGD/mFC病毒載體后，使用Transfection MBS哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)將它轉(zhuǎn)染入AD-293細(xì)胞。十天后，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備原代病毒原種并用BD Biosciences′Adeno-X Rapid滴定試劑盒測定病毒滴度。通過以MOI為3感染125×106個AD-293細(xì)胞約四天直到致細(xì)胞病變效應(yīng)完成而進(jìn)行重組病毒的擴(kuò)增。最后，收獲重組病毒并使用BD Biosciences′Adeno-X病毒純化試劑盒根據(jù)提供的說明書進(jìn)行純化。然后滴定純化的病毒，等分試樣，并在-80℃存儲以備將來之用。通過來自pAd-RGD/mFc感染的不同細(xì)胞(AD-293細(xì)胞，TC-1細(xì)胞等等)的蛋白印跡證實(shí)RGD/mFc融合蛋白的產(chǎn)生。擴(kuò)增來自Stratagene的AD-LacZ并如上所述滴定且用作對照。
在將1×108PFU病毒直接注射到腫瘤(C57BL/6J小鼠中的TC-1腫瘤和裸鼠中的DU-145腫瘤)后，在兩個腫瘤模型中都觀察到腫瘤生長顯著延緩(圖16和17)。對于TC-1腫瘤細(xì)胞，第一次病毒注射后三天觀察到病毒注射的腫瘤和對照腫瘤(AD-LacZ注射的腫瘤或PBS注射的腫瘤)之間的顯著差異(P＝0.017和P＝0.016)。對于DU-145腫瘤細(xì)胞，第二次病毒注射后三天觀察到病毒注射的腫瘤和AD-LacZ注射的腫瘤之間的顯著差異(P＝0.023)。此外，與對照的腫瘤生長相比，小鼠左脅腹(未注射)的腫瘤生長也被顯著抑制。
為檢驗(yàn)RGD/mFc作為試劑的抗腫瘤生長作用，構(gòu)建了編碼RGD/mFc融合蛋白的腺病毒載體并轉(zhuǎn)染入AD-293細(xì)胞，腺病毒顆粒分離自該細(xì)胞。將這些復(fù)制缺陷型病毒顆粒直接注射到腫瘤。結(jié)果顯示病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的RGD/mFc抑制鼠和人腫瘤兩者的腫瘤生長。更重要地，表達(dá)的融合蛋白進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并到達(dá)遠(yuǎn)距離腫瘤且抑制它們的生長(圖7)，而沒有明顯的副作用。不可能向人所有的腫瘤直接遞送基因或蛋白；因此，新開發(fā)的抗腫瘤劑必須全身遞送并能夠到達(dá)遠(yuǎn)距離的腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種包含靶向部分和觸發(fā)免疫反應(yīng)部分的抗腫瘤劑，其中(a)所述靶向部分選自抗體片段和腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽；和(b)所述觸發(fā)免疫反應(yīng)部分選自免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段、顯示與Fc區(qū)相同生物學(xué)功能的IgG的Fc片段的片段和外源的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的胞外結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述抗體片段體是單鏈抗體。
3.權(quán)利要求2的抗腫瘤劑，其中所述抗體片段結(jié)合選自前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CEA、CO17-1A和HER-2/neu的腫瘤抗原。
4.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)或甘氨酸-絲氨酸-亮氨酸(GSL)。
5.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述IgG來自哺乳動物。
6.權(quán)利要求5的抗腫瘤劑，其中所述哺乳動物選自人、小鼠、山羊、母牛和綿羊。
7.權(quán)利要求6的抗腫瘤劑，其中所述哺乳動物是人。
8.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述外源的MHC選自H-2Kd和HLA-A0101。
9.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，還包含藥物可接受的載體。
10.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述靶向部分和所述觸發(fā)免疫反應(yīng)部分通過主鏈-主鏈連接而融合。
11.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其中所述靶向部分和所述觸發(fā)免疫反應(yīng)部分通過主鏈-側(cè)鏈連接而融合。
12.一種包含編碼權(quán)利要求10的抗腫瘤劑的核苷酸序列的表達(dá)載體。
13.一種抑制腫瘤生長的方法，包括給有需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1的抗腫瘤劑。
14.一種抑制腫瘤血管生成的方法，包括給有需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1的抗腫瘤劑。
15.一種治療與新血管形成有關(guān)的疾病的方法，包括給有需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1的抗腫瘤劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述疾病是癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含靶向部分和觸發(fā)免疫反應(yīng)部分的抗腫瘤劑。靶向部分可以是抗體片段或腫瘤脈管系統(tǒng)結(jié)合肽。觸發(fā)免疫反應(yīng)部分可以是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，顯示出與Fc區(qū)相同的生物學(xué)功能的IgG的Fc片段的片段，或外源主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的胞外結(jié)構(gòu)域。該抗腫瘤劑具有抑制腫瘤生長，抑制腫瘤血管生成和治療與新血管形成相關(guān)的疾病的用途。
文檔編號A61K47/48GK1787838SQ200480012112
公開日2006年6月14日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者T·E·瓦納, 魏彥章 申請人:格林維爾醫(yī)院系統(tǒng)公司