專利名稱：一種用于腫瘤基因干預的新型靶向復合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體的說是一種用于腫瘤等疾病生物靶向治療的 新型復合物。
背景技術：
在本發(fā)明提出之前，應用于腫瘤生物治療方面的藥物已經有很多，如免疫刺激劑、 抗體藥物、基因干擾藥物等等，但是都存在著各種各樣的問題使得其效果并不明顯，免疫刺 激劑的使用容易引起免疫過度導致自身免疫疾病，抗體藥物因為其外界蛋白的屬性而引起 的免疫反應很常見，基因干擾技術其療效是值得肯定的，但是使用的載體卻存在很大問題， 嚴重的阻礙著基因干擾技術在臨床疾病特別是腫瘤疾病中的使用。目前存在的主要的應 用于臨床疾病干預的基因干擾制劑包括裸小分子核糖核酸(siRNA)、膽固醇結合的siRNA、 脂質體或者陽離子復合物結合的siRNA復合物以及抗體siRNA復合物等等，但是這些應用 均有局限性，裸siRNA的使用只能在眼睛、呼吸道以及脊髓中屬于局部使用，膽固醇結合的 siRNA制劑的使用則是主要針對高血脂的治療，脂質體或者陽離子復合物和siRNA的復合 物沒有特定細胞的靶向性，抗體和siRNA結合的使用受抗體免疫原性的限制，所以探討一 種新的靶向性強、安全的可以廣泛使用的用于腫瘤等疾病治療的RNAi載體勢在必行。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤基因干預的新型靶向復合物，以解決上述腫 瘤治療特別是腫瘤的生物靶向治療中的難題。本發(fā)明設計人通過大量研究，提出和構建了 一種基于核糖核酸干擾技術(RNAi)的新型腫瘤靶向治療載體即核酸適體-魚精蛋白-小 分子干擾核糖核酸復合物(aptamer-protamine-siRNA)，這種復合物的構成由三部分構成， 本發(fā)明復合物的合成方式將aptamer和siRNA按照摩爾比1 1的比例用生理鹽水或者 磷酸鹽緩沖液溶解，超聲混勻，計算魚精蛋白的摩爾數(shù)，其和aptamer以及siRNA的最佳摩 爾比為1 1 1(可以使用的范圍為[1 10] [1 10] [1 10])，溶解于生理鹽 水或者磷酸鹽緩沖液，超聲混勻促溶，然后將核酸混合液緩慢加入魚精蛋白中，低速震蕩混 勻5min，室溫靜置20-30min，置于-20°C長期保存。其中魚精蛋白起到橋梁作用，它具有結 合核酸的功能，可以將另外兩種核酸成分結合起來形成復合物，核酸適體具有識別靶向細 胞表面特異性抗原的作用，而所攜帶的siRNA則可以起到沉默靶向基因的作用，所以該新 型復合物可以靶向識別特定細胞(如腫瘤細胞)并且靶向沉默關鍵基因(如癌基因等)從 而起到疾病(如腫瘤)治療的作用。
應用本發(fā)明，該復合物可以用于腫瘤等疾病的生物靶向治療，也可以應用于科學 研究中siRNA進行基因干擾的研究。
本發(fā)明與現(xiàn)有的腫瘤生物靶向藥物相比較，充分顯示其創(chuàng)新點和優(yōu)點為①特異 性和多重靶向性^ptamer高效靶向識別腫瘤細胞表面特異性抗原、siRNA特異沉默靶基 因，其靶向性非常明確，不影響其他正常細胞的功能，只針對目的腫瘤細胞；不干預其他基因，只針對靶向基因；②安全性該復合物為小分子納米級制劑，魚精蛋白是臨床醫(yī)學得以 批準應用的小分子多肽，安全性得以保障；aptamer、siRNA是經過化學修飾的較穩(wěn)定的小 分子RNA制劑，降解和清除時間為3-4天，無毒副作用；③aptamer和siRNA都可以進行靶向 性替換，針對不同腫瘤選用不同的表面抗原的aptamer (如針對乳腺癌中的erbB3、erbB2, 前列腺癌的PMSA、宮頸癌的ScFv，直腸癌的CEA等腫瘤細胞特異性的細胞表面抗原的 aptamer均適應本復合物)以及不同腫瘤關鍵基因的siRNA(如針對Ras、Jak、Pi;3k、c-myc、 XIAP, survivin、livin、CDKs等在腫瘤生成以及腫瘤轉移中其重要作用的基因的siRNA均 適應于本復合物)。


附圖1 本發(fā)明復合物合成結構示意附圖2 通過熒光顯微鏡觀察vehicle組為生理鹽水對照組，未看到有熒光表達； APFAMsiRNA組為加入了攜帶熒光siRNA的復合物組，可以看到有熒光表達，說明可以復合 物進入到腫瘤細胞中；
附圖3 通過流式細胞儀檢測熒光表達在APFAMsiRNA組表達明顯高于vehicle 生理鹽水對照組；
附圖4 通過熒光顯微鏡觀察加入攜帶EGFP siRNA的復合物組，EGFP熒光表達的 細胞較未加入的EGFP組明顯減少，說明復合物可以起到干擾EGFP表達的作用；
附圖5 流式細胞儀檢測加入攜帶EGFP siRNA的復合物組細胞綠色熒光表達明顯 較單純轉染EGFP質粒組降低；
附圖6 蛋白質免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)加入攜帶EGFP siRNA的復合物組細胞GFP蛋 白的表達水平明顯降低；
附圖7 逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測加入攜帶survivin siRNA的復合物組細胞 survivin在mRNA水平的表達明顯降低，說明aptamer-protamine-sisurvivin復合物可以 明顯的降低細胞中survivin這一癌基因的表達；
附圖8 蛋白質免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)加入aptamer-protamine-sisurvivin復合物 組細胞survivin在蛋白質水平的表達明顯降低；
附圖9 =MTT法檢測發(fā)現(xiàn)加入aptamer-protamine-sisurvivin復合物組細胞的生 長明顯變緩，說明在關鍵癌基因survivin受到抑制之后，細胞的生長受到明顯影響；
附圖10 細胞凋亡檢測(Armexin-V/PI法)發(fā)現(xiàn)加入 aptamer-protamine-sisurvivin復合物組細胞凋亡發(fā)生率明顯升高，說明在survivin表 達受到沉默之后，部分細胞走向凋亡；
附圖11 逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測加入攜帶⑶KlsiRNA的復合物組細胞⑶Kl 在mRNA水平的表達明顯降低，說明aptamer-protamine-si⑶Kl復合物可以明顯的降低細 胞中CDKl這一關鍵細胞周期調控基因的表達；
附圖12 蛋白質免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)加入aptamer-protamine-siCDKl復合物組 細胞CDKl在蛋白質水平的表達明顯降低；
附圖13 :MTT法檢測發(fā)現(xiàn)加入aptamer-protamine-siCDKl復合物組細胞的生長變 緩，說明在關鍵細胞周期調控基因CDKl受到抑制之后，細胞的生長受到比較明顯影響，增殖變慢；
附圖14 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)加入aptamer-protamine-siCDKl復合物組處于 G2-M期的細胞比例明顯增加，說明在關鍵的細胞周期調控基因CDKl受到干擾之后，細胞周 期運行受到明顯改變；
附圖15 在體尾靜脈注射aptamer-protamine-sisurvivin組裸鼠成瘤能力下降， 腫瘤大小和重量均較生理鹽水對照組小得多，說明復合物在體內也可以發(fā)揮干擾癌基因的 表達的作用，起到抑制腫瘤生長的效果；
附圖16 逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測發(fā)現(xiàn)aptamer-protamine-sisurvivin組 裸鼠腫瘤組織survivin在mRNA水平的表達明顯較生理鹽水對照組低；
附圖17 蛋白質免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)aptamer-protamine-sisurvivin組裸鼠腫 瘤組織survivin在蛋白質水平的表達明顯較生理鹽水對照組低。
具體實施方式
本發(fā)明的合成方法實例
本發(fā)明提出和構建了一種基于核糖核酸干擾技術(RNAi)的新型腫瘤靶向治療載 體即核酸適體-魚精蛋白-小分子干擾核糖核酸復合物(aptamer-protamine-siRNA)，這 種復合物的構成由三部分構成，本發(fā)明復合物的合成方式將aptamer和siRNA按照摩爾 比1 1的比例用生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液溶解，超聲混勻，計算魚精蛋白的摩爾數(shù)，其 和aptamer以及siRNA的最佳摩爾比為1 1 1 (可以使用的范圍為[1 10] [1 10] [1 10])，溶解于生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液，超聲混勻促溶，然后將核酸混合液緩 慢加入魚精蛋白中，低速震蕩混勻5min，室溫靜置20-30min，置于_20°C長期保存。
發(fā)明的技術性說明以及發(fā)明的有效性驗證
1)細胞體外實驗驗證該新型復合物可以靶向的進入到特定腫瘤細胞中在 表達有erbB3抗原的乳腺癌細胞系MCF-7細胞中加入合成的aptamer (針對erbB3抗 原)-pr0tamine-FAMSiRNA(FAM綠色熒光顆粒標記的無靶點的siRNA)復合物，然后通過熒 光顯微鏡可以看到加入復合物組有明顯的熒光表達(見圖1)，流式細胞儀檢測到加入復合 物組其熒光表達率明顯高于生理鹽水對照組(見圖幻，說明該新型復合物可以靶向的進入 到特定細胞中去。
2)體外實驗驗證該新型復合物可以靶向的沉默特定細胞中特定基因在表達有 erbB3抗原的轉染了 pEGFP質粒的乳腺癌細胞系MCF-7細胞中加入合成的aptamer (針對 erbB3抗原)-protamine-siEGFP (針對EGFP基因的siRNA)復合物，通過熒光顯微鏡、流式 細胞儀以及蛋白質免疫印跡反應檢測EGFP的表達在加入復合物組明顯的降低，如圖3、4、 5。
3)體外實驗驗證該新型復合物靶向沉默腫瘤關鍵癌基因后腫瘤的生物學特性得 以明顯改變在表達有erbB3抗原的乳腺癌細胞系MCF-7細胞中加入合成的aptamer (針對 erbB3抗原)-protamine-sisurvivin(針對凋亡抑制蛋白家族成員survivin)復合物，我們 通過逆轉錄-多聚酶鏈反應和蛋白質免疫印跡反應檢測到survivin的表達在信使核糖核 酸(mRNA)和蛋白質水平均明顯降低(見圖6、7)，腫瘤細胞生長受到抑制(見圖8)，凋亡細 胞增多(見圖9)。
4)體外實驗驗證該新型復合物靶向沉默腫瘤關鍵細胞周期調節(jié)蛋白后細胞周期 受到明顯阻滯在表達有erbB3抗原的乳腺癌細胞系MCF-7細胞中加入合成的aptamer (針 對erbB3抗原)-protamine-si⑶K1 (針對細胞周期關鍵調節(jié)蛋白細胞周期依賴性激酶 1-CDK1)復合物，我們通過逆轉錄-多聚酶鏈反應和蛋白質免疫印跡反應檢測到CDKl的表 達在mRNA和蛋白質水平均明顯降低(見圖10、11)，細胞生長變慢(見圖12)，細胞周期主 要阻滯在G2-M期(見圖13)。
5)體內實驗驗證該新型復合物在腫瘤治療中是有效的對裸鼠進行皮下MCF-7細 胞成瘤，然后尾靜脈注射aptamer-protamine-sisurvivin復合物，在6周后取出腫瘤發(fā)現(xiàn) 注射復合物組腫瘤大小和重量明顯小于對照的生理鹽水組(見圖14)，并且survivin在腫 瘤組織中的表達和生理鹽水對照組相比明顯降低(見圖15、16)，說明該復合物在體內環(huán)境 下可以通過靶向的沉默腫瘤組織中的survivin的表達來達到抑制腫瘤生長的目的。
權利要求
1.一種用于腫瘤基因干預的新型靶向復合物，它由核酸適體、魚精蛋白和小分子干擾 核糖核酸三部分構成，其特征在于復合物的復合方法步驟是，1)將核酸適體和小分子干擾核糖核酸按照摩爾比1 1的比例用生理鹽水或者磷酸鹽 緩沖液溶解，超聲混勻；2)將魚精蛋白溶解于生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液，超聲混勻促溶，然后將1)中的混 合液緩慢加入魚精蛋白中，魚精蛋白和核酸適體以及小分子干擾核糖核酸的最佳摩爾比為 1:1: 1，低速震蕩混勻5min，室溫靜置20-30min，置于-20°C長期保存。
2.一種腫瘤基因干預的新型靶向復合物的用途，其特征在于該復合物經制備組合成 藥物可以用于腫瘤疾病的生物靶向治療或者作為一種試劑用于基因干擾。
全文摘要
一種用于腫瘤基因干預的新型靶向復合物，它由核酸適體、魚精蛋白和小分子干擾核糖核酸三部分構成，復合物的復合方法步驟是，將核酸適體和小分子干擾核糖核酸按照摩爾比1∶1的比例用生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液溶解，超聲混勻。將魚精蛋白溶解于生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液，超聲混勻促溶，然后將混合液緩慢加入魚精蛋白中，魚精蛋白和核酸適體以及小分子干擾核糖核酸的最佳摩爾比為1∶1∶1，低速震蕩混勻5min，室溫靜置20-30min，置于-20℃長期保存。
文檔編號A61P35/00GK102028955SQ20101024879
公開日2011年4月27日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權日2010年8月9日
發(fā)明者張鵬, 徐向上, 曹志新, 陶德定, 龔建平 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院