一種生物靶向納米基因材料及其制造方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種納米基因材料，其特征在于：包括具有靶向性的納米基因基材；所述納米基因基材由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素Ⅱ多肽制備而成；其中，所述氨基酸聚合物和血管緊張素Ⅱ多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有靶向性的納米基因基材。本發(fā)明提供的一種新型的對(duì)缺血心肌具有靶向性、對(duì)基因具有保護(hù)作用、轉(zhuǎn)染效果佳、毒性低的納米基因材料。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種生物卽向納米基因材料及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因載體領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種生物祀向納米基因材料及其制造方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，屯、血管疾病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。盡管 基因治療已經(jīng)取得了令人滿(mǎn)意的效果，但是安全有效的傳遞載體仍然是瓶頸所在。常用的 屯、肌轉(zhuǎn)運(yùn)載體可分為病毒載體和非病毒載體。由于具有較高的轉(zhuǎn)染效率，病毒載體的應(yīng)用 仍然具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。但是，由于病毒載體引起的機(jī)體免疫反應(yīng)較強(qiáng)，使其臨床應(yīng)用受到制 約。作為病毒載體的有效補(bǔ)充，近年來(lái)非病毒載體的研究日益深入。
[0003] 非病毒載體具備無(wú)傳染性，沒(méi)有載體容量限制，材料來(lái)源廣泛，化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制， 且易于大量制備，可負(fù)載基因，如:反義寡核巧酸，有著病毒載體不可替代的作用。
[0004] 但是，目前的非病毒載體往往存在轉(zhuǎn)染效率低，目的基因多數(shù)只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)， 其運(yùn)送系統(tǒng)的顆粒較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機(jī)體所清除。
[0005] 針對(duì)該缺陷，在現(xiàn)有的對(duì)非病毒載體的基礎(chǔ)研究中，體外轉(zhuǎn)染最常用的載體(媒 介)包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物，如:Lipo2000、聚乙締亞胺PEI25000、PEI18000等， 此類(lèi)產(chǎn)品均是目前公認(rèn)的對(duì)多種細(xì)胞具有較高轉(zhuǎn)染效率的商品化轉(zhuǎn)染試劑之一，所W常被 用來(lái)作為評(píng)價(jià)其他siRNA遞送載體有效性的標(biāo)準(zhǔn)。
[0006] 然而，研究表明，長(zhǎng)期使用Lipofectamine 2000?系列產(chǎn)品遞送SiRNA會(huì)增加細(xì)胞 的自隧水平，誘發(fā)體內(nèi)炎癥。此外脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性差，在血液中粒徑、表面電位及脂質(zhì) 成分都有改變的趨勢(shì)。而PEI系列產(chǎn)品的生物毒性明顯。運(yùn)些都限制了脂質(zhì)體和PEI在臨床 上的應(yīng)用。
[0007] 因而，目前急需一種轉(zhuǎn)染效果佳，穩(wěn)定性佳，且無(wú)毒性或毒性較低的載體。
[0008] 此外，目前針對(duì)屯、血管疾病的治療產(chǎn)品中，用于負(fù)載基因的載體，往往在治療時(shí)無(wú) 祀向性，因此，不能解決病變部位富集的情況下的祀向治療的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供一種新型的對(duì)基因具有保護(hù)作用、轉(zhuǎn)染效果佳、毒 性極低、通過(guò)在載體上還連接有具有缺血屯、肌祀向性的多膚ATI來(lái)實(shí)現(xiàn)祀向治療效果的納 米基因材料。
[0010] 本發(fā)明提供的納米基因材料，其特征在于:包括具有祀向性的納米基因載體;上述 納米基因載體由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素 Π 的功能序列多膚制備而成；
[0011] 其中，上述氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多膚分別與修飾性聚乙二醇 兩端的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有祀向性的納米基因載體。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：上述氨基酸聚合物為由賴(lài) 氨酸、絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺中的 一種或多種氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一種或多種。
[0013] 優(yōu)選自由賴(lài)氨酸制備的聚合物，或包含有質(zhì)量百分比含量為45-80%的賴(lài)氨酸的 共聚物。
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：上述修飾性聚乙二醇的結(jié) 構(gòu)如下所示：
[0015]
[0016] 其中，m為80-500的整數(shù)；
[0017] 化為酷胺基、締控基、環(huán)締控基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；
[0018] 上述酷胺基的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0019]
旨P、修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：
[0020]
[0021] R3為締控基、環(huán)締控基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；
[0022] 上述締控基的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0023]
[0024] 目P、修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：
[0025]
[0026] nl和n2為0到20的整數(shù)；當(dāng)鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)時(shí)，該材料的表面活性越好。
[0027] 上述環(huán)締控基的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[00川 R2為醋基；
[0032] 上述醋基的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0033]
[0034] R4為烷基、芳基、雜環(huán)基；
[0035] 上述雜環(huán)基的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0036]
[0037] Rx1-2Q選自氨、烷基、烷氧基、氨基或C-Rx1-2Q為幾基；
[0038] Rx1-20優(yōu)選氨、甲基、乙基、甲氧基、氨基及C-Rx1-20為幾基；
[0039] Y為氮、氧、硫；
[0040] η為0-20的整數(shù)，當(dāng)鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)時(shí)，該材料的表面活性越好。
[0041] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：上述氨基酸聚合物的聚合 度為50-500;優(yōu)選為80-160;
[0042] 上述氨基酸聚合物的的分子量為10000-100000;優(yōu)選為15000W上；
[0043] 上述修飾性聚乙二醇的分子量為1000-10000;優(yōu)選為1500 W上。
[0044] 此外，本發(fā)明還提供了上述納米基因材料的制備方法，其特征在于：
[0045] 步驟一、配置反應(yīng)物：
[0046] 將氨基酸聚合物溶解于溶劑中配置成溶液Α;
[0047] 將修飾性聚乙二醇溶解于溶劑中配置成溶液Β;
[0048] 將血管緊張素 Π 的功能序列多膚溶解于溶劑中配置成溶液C;
[0049] 步驟二、將溶液Β滴加入溶液A中，于10-50°C的溫度下，反應(yīng)1-5小時(shí)；
[0050] 步驟Ξ、在保護(hù)氣保護(hù)的條件下，加入溶液C，于10-50°c的溫度下，反應(yīng)8-24小時(shí)；
[0051] 步驟四、將獲得的溶液透析24-96小時(shí)后，冷凍干燥。
[0052] 如權(quán)利要求5上述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于：
[0053] 上述溶劑選自抑為7-8的憐酸緩沖鹽溶液、二甲基甲酯胺、二甲基亞諷、四氨巧喃、 醇、酸、醋中的一種或幾種；
[0054] 上述聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多膚的摩爾比為1: 2-100:1-100；
[0055] 優(yōu)選地，上述聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多膚的摩 爾比為 1:2-10:2-8。
[0056] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的上述納米基因材料的制備方法，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：即、 在步驟Ξ和四之間，還設(shè)有中和步驟；
[0057] 上述中和步驟為:于步驟Ξ的溶液中加入半脫胺等中和用試劑，于10-50°C的溫度 下，反應(yīng)1-5小時(shí)；
[005引上述半脫胺的制備方法為:將半脫胺鹽酸鹽溶解于二次水中，加入有機(jī)堿震蕩混 合5-20分鐘，冷卻后，采用有機(jī)溶劑萃取后，蒸除溶劑后獲得半脫胺；
[0化9] 上述修飾性聚乙二醇與半脫胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50-150;優(yōu)選為1: :80-100;
[0060] 上述有機(jī)堿與半脫胺鹽酸鹽的摩爾比為1:0.1-10;優(yōu)選為1:1-1.5。
[0061] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：即、上述具有祀向性的納 米基因載體在靜電作用下負(fù)載基因；
[0062] 上述基因可W選自反義寡核巧酸、反義表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒等基因；
[0063] 上述負(fù)載的過(guò)程為:將具有祀向性的納米基因載體加入基因中，吹打均勻后于30- 40°C的條件下解育0.5-2小時(shí)；
[0064] 上述具有祀向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比為1:0.01-15;
[0065] 上述具有祀向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1-10。
[0066] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：即、上述聚氨基酸為聚合 度為95-135的樹(shù)枝狀聚賴(lài)氨酸；
[0067] 上述修飾性聚乙二醇的分子量為1500-2500,其兩端的修飾基團(tuán)分別為NHS和MAL。
[0068] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：
[0069] 上述基因?yàn)橛糜谕?、肌缺血治療的基因?br>[0070] 上述基因?yàn)閙iRNA-1的反義寡核巧酸。
[0071] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：上述具有祀向性的納米基 因載體在靜電作用下負(fù)載miRNA-1的反義寡核巧酸；
[0072] 上述負(fù)載的過(guò)程為:將具有祀向性的納米基因載體加入miRNA-1的反義寡核巧中， 吹打均勻后于30-40°C的條件下解育0.5-2小時(shí)。
[0073] 該具有祀向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比為0.01-15:1;優(yōu)選為0.1-10:1;最 優(yōu)選為0.5-8:1。
[0074] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運(yùn)樣的特點(diǎn)：上述納米基因材料為具有 缺血屯、肌祀向性的納米基因載體。
[0075] 該納米基因材料還可W為未連接有血管緊張素 Π 的功能序列多膚的納米基因載 體，即、DGL-PEG/AMO-1，其制備方法和原料比例，同于DGL-PEG-ATl/AMO-1。
[007引本發(fā)明的作用和效果:
[0077] 在本發(fā)明中，提供了一種新型的納米基因載體，該載體具有缺血屯、肌祀向性的作 用，且毒副作用小。
[0078] 如圖1所示，在本發(fā)明中，氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多膚分別與修 飾性聚乙二醇兩端的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有祀向性的納米基因載體，其后，通 過(guò)將該納米基因載體與反義寡核巧酸、反義表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒等負(fù)載獲得具有祀向功能 的納米基因載體。
[0079] 具體地，氨基酸作為生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動(dòng)有 著密切的關(guān)系。它在基體內(nèi)具有特殊的生理功能，是生物體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分之一。而 在在本發(fā)明中選用的聚氨基酸，基于氨基酸的基本特性，當(dāng)應(yīng)用于載體后，仍能具有良好的 生物相容性等效果，帶有電荷的聚氨基酸在本發(fā)明中為優(yōu)選方案，由于自身帶有的電荷效 果，可與其他帶有反向電荷的物質(zhì)發(fā)生分子間的靜電作用力，從而實(shí)現(xiàn)類(lèi)似于自組裝的效 果。
[0080] 另外，在本發(fā)明中，聚氨基酸選用的最優(yōu)選案例中的DGL(樹(shù)枝狀聚賴(lài)氨酸），是一 種陽(yáng)離子聚合物，是由賴(lài)氨酸(人體必需氨基酸)聚合而成的，其具有良好生物相容性的同 時(shí)、其生物可降解性和壓縮DNA的能力極佳，其表面有大量的氨基，可被修飾，且?guī)в姓姡?當(dāng)其被其他基團(tuán)修飾后，由于自身帶有的正電荷，可與其他帶有負(fù)電荷的物質(zhì)發(fā)生分子間 的靜電作用力，從而實(shí)現(xiàn)負(fù)載因子或反義寡核巧酸的效果。
[0081] 此外，本發(fā)明中選用聚乙二醇作為反應(yīng)組分之一，由于其本身為一種優(yōu)良的表面 活性劑，當(dāng)其與聚氨基酸上的基團(tuán)發(fā)生取代等反應(yīng)后，能實(shí)現(xiàn)在聚氨基酸的表面形成一層 水化層的效果，從而能減小聚氨基酸的毒性，降低其在體內(nèi)被巨隧細(xì)胞系統(tǒng)吞隧的可能性。
[0082] 另外，在本發(fā)明中，選用的PEG為兩端均設(shè)有修飾基團(tuán)的PEG,從而使其通過(guò)該基團(tuán) 上的活性基與聚氨基酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)各組分之間的聯(lián)合的同時(shí)，提高產(chǎn)品的表面 張力和兼容性。
[0083] 另外，在本發(fā)明的最優(yōu)選方案中，將其兩端分別連接NHS和MAL基團(tuán)，該NHS基團(tuán)可 與聚氨基酸表面的氨基發(fā)生取代等反應(yīng)，將D化和PEG連接起來(lái);而MAL基團(tuán)可與多膚AT1 (血 管緊張素 Π 的功能序列多膚)上的琉基-HS發(fā)生加成反應(yīng)，從而將多膚ATI與PEG連接起來(lái)， 進(jìn)而構(gòu)建起D(iL和AT1的連接關(guān)系。
[0084] 此外，在本發(fā)明中使用的AT1，其為：當(dāng)屯、肌梗死(屯、肌細(xì)胞缺血缺氧)時(shí)，細(xì)胞表面 的血管緊張素 Π 受體-I(ATIR)升高。所W在體外化學(xué)合成AT1R的配體中的一段功能序列 (稱(chēng)AT1)連接在納米材料表面，可祀向結(jié)合缺血屯、肌的AT1R，從而對(duì)缺血屯、肌具有一定的祀 向作用。
[0085] 在本發(fā)明中，體外合成的AT1多膚，其氨基酸序列如下所示：
[00 化]Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe;
[0087] AT1R的配體的功能序列如下所示：
[0088] Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；
[0089] 其中間的Gly-Gly-Gly-Gly為間隔序列，切S是中含有琉基-HS，是化學(xué)連接的功能 基團(tuán)。
[0090] 此外，在本發(fā)明中，使用AM〇-l(miRNA-l的反義寡核巧酸)作為負(fù)電荷的供電體，與 上述合成基材通過(guò)靜電實(shí)現(xiàn)組裝的結(jié)果。
[0091] miRNA-1在屯、肌梗死或者細(xì)胞缺血缺氧時(shí)升高，可促進(jìn)屯、肌細(xì)胞的調(diào)亡，是屯、肌細(xì) 胞的損害因子。而AM0-1是指miRNA-1的反義寡核巧酸，是化學(xué)合成的與miRNA互補(bǔ)的單鏈 RNA。其在細(xì)胞質(zhì)中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，使得miRNA-1的損害作用減弱，上述 各化合物的序列如下所示：
[0092] miRNA-1序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[0093] AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '
[0094] 在優(yōu)選方案中，AM0-1帶負(fù)電，可W與帶正電DGL-PEG或DGL-PEG-AT1通過(guò)靜電作用 形成納米顆粒。
【附圖說(shuō)明】
[00M]附圖1、納米材料形成和材料結(jié)構(gòu)的示意圖；
[0096] 附圖2、納米材料核磁圖譜；
[0097] 附圖3、納米材料負(fù)載AM0-1后的粒徑和電位圖；
[0098] 附圖4、納米材料負(fù)載AM0-1后的透射電鏡圖；
[0099] 附圖5、納米材料負(fù)載AM0-1凝膠電泳圖
[0100] 附圖6(a)、納米材料對(duì)H9C2細(xì)胞毒性4小時(shí)對(duì)比圖；
[0101] 附圖6(b)、納米材料對(duì)H9C2細(xì)胞毒性8小時(shí)對(duì)比圖；
[0102] 附圖7(al)、激光共聚焦觀察4小時(shí)對(duì)比圖；
[0103] 附圖7(曰2)、流式細(xì)胞檢測(cè)4小時(shí)對(duì)比圖；
[0104] 附圖7化1)、激光共聚焦觀察8小時(shí)對(duì)比圖；
[0105] 附圖7化2)、流式細(xì)胞檢測(cè)8小時(shí)對(duì)比圖；
[0106] 附圖8、活死染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖；
[0107] 附圖9、原代屯、肌細(xì)胞免疫巧光染色對(duì)比圖；
[0108] 附圖10、原代屯、肌細(xì)胞水平治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各處理組miRNA-1量的對(duì)比圖；
[0109] 其中，對(duì)照組：正常細(xì)胞(normal組）給予DEPC水、缺氧細(xì)胞（control組）給予DEPC 水、缺氧細(xì)胞(NC組）給予DGkWG-ATl/AMO-1-NC;實(shí)驗(yàn)組:缺氧細(xì)胞(PEI組）給予陽(yáng)I/AM0- 1、缺氧細(xì)胞（D化-PEG組）給予DGレPEG/AM0-1、缺氧細(xì)胞（D化-PEG-AT1組）給予DGレPEG- AT1/AM0-1。
【具體實(shí)施方式】
[0110] 1、原料和設(shè)備的準(zhǔn)備
[01川 1)原料：
[0112]樹(shù)枝狀聚賴(lài)氨酸(Den化igraft pol}fA-lysines，DGL);
[011；3] 端馬來(lái)酷亞胺端N-徑基班巧酷亞胺聚乙二醇（α-Malemidyl - ω -N- hydroxysuccinimidyl polyethylene glycol，NHS-PEG2〇o〇-MAL);
[0114] ATI(祀向多膚序列：
[0115] Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)；
[0116] 半脫胺鹽酸鹽;二氯甲燒，Ξ乙胺。
[0117] 2)設(shè)備：
[011引定容瓶（1000血，2000血），燒杯(5001^，21，51^，2個(gè)燒瓶(251^)，磁子，磁力攬拌器 (可顯示溫度和轉(zhuǎn)速），1個(gè)瓶塞，1個(gè)橡皮蓋，2個(gè)針頭(長(zhǎng)短），2條橡皮管，MWC0:8000-14000 透析袋。
[0119] 2、試劑準(zhǔn)備(根據(jù)實(shí)際使用的需要還可配置其他濃度和抑的緩沖溶液）
[0120] 1)配置100011110.21的？85原液(抑=7.4)
[0121] 準(zhǔn)備：250mL量筒，500mL燒杯，lOOOmL的定容瓶，二次水，胞2冊(cè)〇4-12此0，N址2P〇4- 2出0
[0122] 具體步驟：
[0123] a)分別稱(chēng)量化抽P04-12出058.01868邑，胞此口04-2出05.92838邑，混合放入500血的燒 杯中，加入500mL的二次水，充分?jǐn)埌枞芙狻?br>[0124] b)將燒杯中的溶液倒入lOOOmL的定容瓶中，加入二次水定容至lOOOmL。（可將二次 水先加入燒杯中沖洗燒杯壁，再加入到定容瓶中，因?yàn)闊勘诳赡苡胁糠秩苜|(zhì)的殘留）
[0125] C)用精密抑試紙測(cè)抑，確認(rèn)抑值在7.4左右(7.2-7.4)
[0126] 2)配置500mL的lOmM的PBS緩沖液
[0127] a)取2.5mL原液，定容至化OmL(稀釋20倍)一做反應(yīng)用 [012引 b)取lOOmL原液，定容到2000ml-透析用
[0129] (注:后面透析和反應(yīng)用的PBS濃度都是lOmM)
[0130] 實(shí)施例一、DGL-PEG的合成
[01：31] a)稱(chēng)量 22mg(l 皿 〇1)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 緩沖液（lOmM;
[0132] 抑=7.4)(濃度0.2皿ol/mL)(稱(chēng)量后將固體DGL置于lOmL邱管中）；
[0133] 在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的DGL，如:MW= 10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0134] b)稱(chēng)量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[0135] 在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：MW=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0136] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對(duì)于DGL 與NHS-PEG2000-MAL的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如:D化與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0137] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對(duì)反應(yīng)液的濃度 進(jìn)行調(diào)整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng) 取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進(jìn)行反 應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進(jìn)行反應(yīng)；
[013引 C)將b)緩慢滴加入a)中（500-1000轉(zhuǎn)/分的混合條件下），55°C反應(yīng)化；
[0139]在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫 度可W調(diào)整為10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、 1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代)的 情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少于20的取代）的情況下，反 應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；
[0140] d)稱(chēng)量90.88mg(800皿〇1)半脫胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分兩次進(jìn)行超聲溶解；
[0141] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，根據(jù)需取代基團(tuán)、取代數(shù)量的不同， 對(duì)于NHS-陽(yáng)G-MAL半脫胺鹽酸鹽的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，NHS-PEG-MAL:半脫胺鹽酸鹽的摩爾 比為 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來(lái)說(shuō)， 當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代）的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當(dāng) 取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；
[0142] e)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震蕩 5min(用手搖晃即可，巧管會(huì)有些發(fā)熱）。
[0143] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，半脫胺鹽酸鹽:Ξ乙胺的摩爾比可W 調(diào)整為 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0144] f)待反應(yīng)完全后，加入lOmL二氯甲燒，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得 固體;將得到的固體溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入C的產(chǎn)物中，于55°C反應(yīng)化。
[0145] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫 度可W調(diào)整為10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、 1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5、3小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)、5小時(shí)不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng) 位較多（多于20的取代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少 于20的取代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；
[0146] g)將d)中最終的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在一次水中透析4她。
[0147] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，透析的時(shí)間可W 為12小時(shí)、36小時(shí)、56小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)不等；
[014引 h)凍干。
[0149] 實(shí)施例二、DGL-PEG-AT1 的合成
[0150] 反應(yīng)方程式如下所示：
[0151]
[0152] a)稱(chēng)量 22mg(l 皿 ol)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 緩沖液 α0mM;pH = 7.4)(濃度 0.2皿ο 1 /mL)(稱(chēng)量后將固體DGL置于1 OmL巧管中）；
[0153] 在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的DGL，如:MW=10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0154] b)稱(chēng)量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[01巧]在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：歷=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0156] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對(duì)于DGL 與NHS-PEG2000-MAL的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如:D化與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0157] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對(duì)反應(yīng)液的濃度 進(jìn)行調(diào)整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng) 取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進(jìn)行反 應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進(jìn)行反應(yīng)；
[015引 C)將b)緩慢滴加入a)中（500-1000轉(zhuǎn)/分的混合條件下），55°C反應(yīng)化；
[0159]在本實(shí)施例中，，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng) 溫度可W調(diào)整為10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小 時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取 代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少于20的取代）的情況 下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；
[0160] (1)稱(chēng)量35.88111邑(254111〇1)41'1(麗：1377.55，純度96%)溶于50化10150中；
[0161] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對(duì)于DGL 與ATI的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如:D化與ATI的摩爾比為1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、 1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0162] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對(duì)反應(yīng)液的濃度 進(jìn)行調(diào)整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng) 取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進(jìn)行反 應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進(jìn)行反應(yīng)；
[0163] e)將d)加入C)中，氮?dú)?或氮?dú)?、氣氣?保護(hù)，室溫反應(yīng)20h。
[0164] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要對(duì)其反應(yīng)時(shí)間進(jìn) 行調(diào)整，其反應(yīng)時(shí)間還可W為8小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)取 代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于15小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā) 生的反應(yīng)位較少(少于20的取代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于15小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；
[01化]f)稱(chēng)量90.88mg(800皿〇1)半脫胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分兩次進(jìn)行超聲溶解；
[0166] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，根據(jù)需取代基團(tuán)、取代數(shù)量的不同， 對(duì)于NHS-陽(yáng)G-MAL半脫胺鹽酸鹽的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，NHS-PEG-MAL:半脫胺鹽酸鹽的摩爾 比為 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來(lái)說(shuō)， 當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多（多于20的取代）的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當(dāng) 取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；
[0167] g)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震蕩 5min(用手搖晃即可，巧管會(huì)有些發(fā)熱）。
[0168] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，半脫胺鹽酸鹽:Ξ乙胺的摩爾比可W 調(diào)整為 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0169] h)待反應(yīng)完全后，加入lOmL二氯甲燒，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得 固體;將得到的固體溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入e的產(chǎn)物中，于55°C反應(yīng)化。
[0170] 在本實(shí)施例中，，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng) 溫度可W調(diào)整為10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小 時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5、3小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)、5小時(shí)不等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的 反應(yīng)位較多（多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少 (少于20的取代）的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；
[0171] i)將f)中最終的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在PBS中透析4她，再在 一次水中透析48小時(shí)。
[0172] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，兩次透析的時(shí)間 可W為12小時(shí)、36小時(shí)、56小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)不等；
[0173] f)凍干
[0174] 注:一次水中透析后，會(huì)產(chǎn)生少許沉淀，離屯、后取上清，凍干，沉淀?xiàng)壍簟?br>[0175] 實(shí)施例Ξ、負(fù)載反義寡核巧酸
[0176] 在本實(shí)施例中，選用AM0-1，納米材料(NHS-陽(yáng)G或NHS-PEG-MAL)和AM0-1按照質(zhì)量 比（20:1)負(fù)載。將納米材料和AM0-1溶于DEPC水，在20化L的ep管中先加入AM0-1，再加入材 料，吹打混勻，滿(mǎn)旋80s后置于47°C溫箱中解育1小時(shí)。（原理:靜電作用;D化帶正電，AM0-1帶 負(fù)電）
[0177] (注l:miRNA-l在屯、肌細(xì)胞缺氧時(shí)升高，對(duì)促進(jìn)屯、肌細(xì)胞的調(diào)亡，是屯、肌細(xì)胞的損 害因子。AM0-1是指miRNA-1的反義寡核巧酸，是化學(xué)合成的與miRNA互補(bǔ)的單鏈RNA。其在細(xì) 胞質(zhì)中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，使得miRNA-1的損害作用減弱。）
[0178] (注2:miRNA-1 序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[01 巧]AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '）
[0180] 在本實(shí)施例中，針對(duì)反應(yīng)條件的科研過(guò)程中，根據(jù)需求的不同，對(duì)于納米材料： AM0-1的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，AM0-1:納米材料的質(zhì)量比為1:1、1:5、1:8、1:10、1:15、1:25、1: 30、1:40、1:50、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、1:100 不等。
[0181] 實(shí)施例四、理化分析和表征
[0182] 本表征的產(chǎn)品為采用實(shí)施例一的方法和實(shí)施例二的方法獲得的載體。
[0183] 其中，DGL-PEG為選用聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇的摩爾比為1:5的產(chǎn)物；
[0184] D化-PEG-AT1為選用聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多 膚的摩爾比為1:5:2.5的產(chǎn)物；
[0185] (l)iHNMR 檢測(cè)圖譜
[0186] 如圖2所示，a( δ = 1-1.8ppm)為賴(lài)氨酸上的3個(gè)C出上的Η，是D化的特征峰。b (δ = 3.6卵m)為陽(yáng)G的重復(fù)序列0-C出-CH2-0，d為（δ = 6.8ppm)為MAL上的Η，e (δ = 2.6ppm)為Ν服上 的Η，均為MAkWG-N服的特征峰。C為AT 1苯環(huán)上的Η，是AT 1的特征峰。D化-PEG中a，b峰存在， 說(shuō)明陽(yáng)G和D化連接，e峰消失，說(shuō)明NHS發(fā)生反應(yīng);d峰消失，說(shuō)明半脫胺鹽酸鹽與MAL發(fā)生反 應(yīng)。D化-PEG-AT1中出現(xiàn)了 C峰，說(shuō)明AT 1成功連接在DGレPEG-MAL上。由此推斷，D化，NHS- PEG-MAL，ATI成功連接在一起。
[0187] (2)粒徑和電位
[018引將合成的DGkPEG-AT 1在DEPC水中負(fù)載AM0-1后（納米材料/AM0-1的質(zhì)量比為8: 1)，如圖3所示，用粒度儀檢測(cè)其粒徑約150nm，電位約+3mv。
[0189] (3)電鏡
[0190] 如圖4所示，電鏡結(jié)果顯示：D化-PEG-AT1/AM0-1(質(zhì)量比為8:1)非水合粒徑為 50nm〇
[0191] (4)材料負(fù)載能力的測(cè)定
[0192] D化-PEG-AT1/AM0-1分別W質(zhì)量比為0,0.5，1，2,4,6,8負(fù)載在一起。3%瓊脂糖凝 膠電泳跑膠，用SYBRn染色。（原理:裸的AM0-1帶負(fù)電，在凝膠電泳中可跑出，可被SYBRn染 色；當(dāng)DGkPEG-AT 1包裹AM0-1時(shí)，AM0-1表面負(fù)電減少，在電泳中跑出的減少，若是完全被包 裹，AM0-1不能跑出加樣孔中。）
[0193] 如圖5所示:裸的AM0-1跑出了加樣孔（白色條帶），當(dāng)DGkWG-AT 1 /AM0-1質(zhì)量比為 2 :1時(shí)，出現(xiàn)了拖帶現(xiàn)象，說(shuō)明AMO-1被材料包裹，但是還沒(méi)有完全包裹，當(dāng)DGレPEG-AT1/ AM0-1質(zhì)量比為8:1時(shí)，未看到AM0-1跑出加樣孔，加樣孔中也未見(jiàn)白色條帶，說(shuō)明AM0-1被完 全包裹。當(dāng)凝膠電泳跑15min時(shí)，可見(jiàn)裸AM0-1組的條帶基本消失(可能AM0-1已經(jīng)降解），但 2:1的孔仍可看到拖帶的白色條帶，說(shuō)明材料對(duì)AM0-1有一定保護(hù)作用，可一定程度減少 AM0-1的降解。
[0194] (5)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[01 巧]將枝化PEI(bPEI)，061^，06^?66,06^?66-41'1分別配置成6個(gè)濃度：1111旨/1111^， 500ug/mL，200ug/mL，lOOug/mL，50ug/mL，20ug/mL，將其作用于朋C2細(xì)胞，地或者化后，用 MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增值的影響(細(xì)胞毒性）。
[0196] 如圖6(a)和6(b)所示:隨著材料濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞活性逐漸降低。bPEI 的毒性明顯大于DGL，D化-PEG-MAL，D化-PEG-AT1。材料濃度小于1 OOug/血時(shí)，D化-PEG-MAL， D化-PEG-AT1作用的細(xì)胞活性均大于80% (毒性較?。?，材料濃度大于lOOug/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞毒 性明顯增加?？蛇x擇lOOug/mL作為后續(xù)治療量。
[0197] (6)細(xì)胞吞隧實(shí)驗(yàn)
[0198] 驗(yàn)證朋C2細(xì)胞對(duì)陽(yáng)I(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL) 負(fù)載AM0-1-FAM(3ug/2mL)的吞隧效果。
[0199] 如圖7(曰1)、7化1)、7(曰2)和7(曰2)所示:41，81中藍(lán)色為細(xì)胞核(04口1染色），綠色為 AM0-1-FAM，位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核位置。激光共聚焦顯示，作用化時(shí)，PEI，D化-PEG，D化- PEG-AT1負(fù)載AM0-1-FAM組的冊(cè)C2細(xì)胞中，綠色巧光均比地時(shí)明顯增強(qiáng)。
[0200] 化時(shí)DGkPEG和DGkPEG-ATl組的綠色巧光較陽(yáng)I組強(qiáng)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示結(jié) 果與之相符。
[0201] 說(shuō)明，H9C2細(xì)胞對(duì)DGkPEG，DGkPEG-AT 1負(fù)載的AM0-1吞隧效果較陽(yáng)I強(qiáng)，即D化- 陽(yáng)G，DGkWG-ATl組較陽(yáng)I組進(jìn)入細(xì)胞的AM0-1多。
[0202] (7)活死染色實(shí)驗(yàn)
[0203] 如圖8所示：紅色為死細(xì)胞化thidiumhomodimer-l染色），綠色為活細(xì)胞(Calcein AM染色）。（由于圖8中顯示，細(xì)胞化時(shí)H9C2細(xì)胞對(duì)DGkWG，D化-PEG-AT1負(fù)載的AM0-1吞隧效 果較PEI強(qiáng)，再根據(jù)圖7的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEI毒性大，推測(cè)，細(xì)胞對(duì)PEI負(fù)載的AM0-1 吞隧作用弱可能是由于PEI毒性大，為了進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)一假設(shè)，用和材料圖8中同樣的條件 下，做活死染色。）結(jié)果顯示，PEI組與06心陽(yáng)6,06心陽(yáng)6-41'1相比，細(xì)胞稀疏，并且紅色巧光 較綠色巧光多，據(jù)此推斷可能細(xì)胞對(duì)PEI負(fù)載的AM0-1吞隧作用弱的原因是PEI對(duì)細(xì)胞毒性 大。
[0204] (8)屯、肌原代細(xì)胞免疫巧光染色
[0205] 當(dāng)屯、肌梗死（屯、肌細(xì)胞缺血缺氧）時(shí)，細(xì)胞表面的血管緊張素 Π 受體(AT1R)升高。 所W在體外化學(xué)合成AT1R的配體中的一段功能序列連接在納米材料表面，可祀向結(jié)合缺血 屯、肌的AT1R，從而對(duì)缺血屯、肌具有一定的祀向作用。
[0206] 為驗(yàn)證SD大鼠原代屯、肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)AT1R是否升高，將原代屯、肌細(xì)胞做缺氧處 理后，進(jìn)行免疫巧光染色。
[0207] 如圖9所示:紅色代表AT1R，位于細(xì)胞膜表面，藍(lán)色代表細(xì)胞核。缺氧細(xì)胞表面的紅 色巧光明顯增加，由此可進(jìn)一步證實(shí)缺氧的SD大鼠原代屯、肌細(xì)胞的AT1R升高。
[0208] (9)原代屯、肌細(xì)胞水平治療實(shí)驗(yàn)
[0209] 用 PEI(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL)負(fù)載 AM0-1 (3ug/2mL)與缺氧的SD大鼠原代屯、肌細(xì)胞（1 % 〇2，24h，低糖DMEM)共培養(yǎng)4h后，在正常條件 下（21%〇2,低糖DMEM)培養(yǎng)2地，提取總RNA,用Real-time PCR檢測(cè)其miRNA-1的變化。
[0210] 如圖10所示:*代表口<0.05，11 = 3，如圖，缺氧細(xì)胞((3〇11化〇1)組未治療時(shí)，11111?^八-1 較正常細(xì)胞（〇〇'111曰1)組明顯升高；0化-?66,0化-?66-41'1組的11111?歴-1較缺氧細(xì)胞 (contro 1)組明顯下降(達(dá)到了治療作用），且DGL-PEG-AT1組較DGL-PEG組miRNA-1降低更明 顯（可能由于ATI對(duì)缺氧細(xì)胞的祀向性作用，使得DGkPEG-ATl負(fù)載AM0-1后，被屯、肌細(xì)胞攝 取的更多，治療作用更明顯）。然而，PEI組不僅沒(méi)有下調(diào)miRNA-1，使細(xì)胞中miRNA-1較缺氧 細(xì)胞(contro 1)組增加(可能由于其細(xì)胞毒性作用引起）。
[0別。上述實(shí)施例的變形例；
[0212] 在上述實(shí)施例中，W聚合度為123的聚賴(lài)氨酸DGL、聚乙二醇兩端修飾基為NHS和 ML為原料進(jìn)行了基因載體的制備。
[0213] 在實(shí)際研發(fā)的過(guò)程中，還對(duì)上述兩種原料分別進(jìn)行了替換的實(shí)驗(yàn)，基于其合成的 方法與實(shí)施例二至Ξ中的方法雷同，此處不再做具體論述，具體實(shí)驗(yàn)組合如下表所示：
[0214] 負(fù)載能力指納米基材與AM0-1的質(zhì)量比；
[0別引毒性評(píng)分為0-10分，從陽(yáng)1為10分，DGkWG-ATl為1分；
[0216] 細(xì)胞吞隧評(píng)分為0-10分，W陽(yáng)I為1分，DGkWG-ATl為10分；
[0217] 治療效果評(píng)分為0-10分，W陽(yáng)I為1分，DGkWG-ATl為10分；
[021 引
[0219]從上述實(shí)施例可W看出，該祀向納米基因載體可為屯、肌缺血或者屯、肌梗死患者的 基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。該載體可負(fù)載AM0-1，也可負(fù)載用于屯、肌缺血治療的其它基 因。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種納米基因材料，其特征在于:包括具有革G向性的納米基因載體； 所述納米基因載體由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素 Π 的功能序列多肽 制備而成； 其中，所述氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端 的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有靶向性的納米基因載體。2. 如權(quán)利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物為由賴(lài)氨酸、絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一種或多種氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一種或多種； 所述氨基酸聚合物優(yōu)選為賴(lài)氨酸和絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一種或多種氨基酸形成的共聚物;其中，賴(lài)氨酸占共聚 物的質(zhì)量百分比含量大于50% ; 所述氨基酸聚合物優(yōu)選為陽(yáng)離子氨基酸聚合物。3. 如權(quán)利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：其中，m為80-500的整數(shù)； Ri為酰胺基、烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基； 所述酰胺基的結(jié)構(gòu)式如下所示：R3為烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基； 所述烯烴基的結(jié)構(gòu)式如下所示：nl和n2為0到20的整數(shù)； 所述環(huán)烯烴基的結(jié)構(gòu)式如下所示： 所述帶有雙鍵的雜環(huán)基的結(jié)構(gòu)式如下所示：R2為酯基；所述酯基的結(jié)構(gòu)式如下所示：R4為烷基、芳基、雜環(huán)基； 所述雜環(huán)基的結(jié)構(gòu)式如下所示：Rxl-2Q選自氫、烷基、烷氧基、氨基或C-Rxl-2Q為羰基； Y為氮、氧、硫； η為0-10的整數(shù)。4. 如權(quán)利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物的聚合度為50-500; 所述氨基酸聚合物的的分子量為10000-100000; 所述修飾性聚乙二醇的分子量為1000-10000。5. -種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 步驟一、配置反應(yīng)物： 將氨基酸聚合物溶解于溶劑中配置成溶液Α; 將修飾性聚乙二醇溶解于溶劑中配置成溶液Β; 將血管緊張素 Π 的功能序列多肽溶解于溶劑中配置成溶液C; 步驟二、將溶液Β滴加入溶液Α中，于10-50 °C的溫度下，反應(yīng)1-5小時(shí)； 步驟三、在保護(hù)氣保護(hù)的條件下，加入溶液C，于10-50°C的溫度下，反應(yīng)8-24小時(shí)； 步驟四、將獲得的溶液透析24-96小時(shí)后，冷凍干燥。6. 如權(quán)利要求5所述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 所述溶劑選自磷酸緩沖鹽溶液、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、醇、醚、酯中的 一種或幾種； 所述聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多肽的摩爾比為1: 2-100:1-100； 優(yōu)選地，所述聚賴(lài)氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 π的功能序列多肽的摩爾比 為1:2-10:2-8。7. 如權(quán)利要求5所述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 在步驟三和四之間，還設(shè)有中和步驟； 所述中和步驟為:于步驟三的溶液中加入半胱胺，于10_50°C的溫度下，反應(yīng)1-5小時(shí)； 所述半胱胺的制備方法為:將半胱胺鹽酸鹽溶解于二次水中，加入有機(jī)堿震蕩混合5-20分鐘，冷卻后，采用有機(jī)溶劑萃取后，蒸除溶劑后獲得半胱胺； 所述修飾性聚乙二醇與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50-150; 所述有機(jī)堿與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1 :〇. 1-10。8. 如權(quán)利要求1-8任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述具有靶向性的納米基因載體在靜電作用下負(fù)載基因； 所述負(fù)載的過(guò)程為:將具有靶向性的納米基因載體加入基因中，吹打均勻后于30-40Γ 的條件下孵育0.5-2小時(shí)； 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比為0.01-15:1; 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為〇. 1-10:1。 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比最優(yōu)選為0.5-8:1。9. 如權(quán)利要求1-8任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述聚氨基酸為聚合度為95-135的樹(shù)枝狀聚賴(lài)氨酸； 所述修飾性聚乙二醇的分子量為1500-2500，其兩端的修飾基團(tuán)分別為NHS和MAL; 所述基因?yàn)橛糜谛募∪毖委煹幕颍? 所述基因優(yōu)選為反義寡核苷酸； 所述基因優(yōu)選為miRNA-1的反義寡核苷酸。10. 如權(quán)利要求1-9任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述納米基因材料為具有缺血心肌革E1向性的納米基因載體； 所述納米基因材料還可以為未連接有血管緊張素 Π 的功能序列多肽的納米基因載體。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK105920618SQ201610420617
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】何斌, 石學(xué)銀, 薛曉梅, 董海青, 李永勇
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院